董杰，姜鋒，陳書強，李博，孫惠君，王東，劉媛，周晶，王曉紅

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，西安　710038)

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輔助生殖技術(shù)致胎盤葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因表達水平上調(diào)

董杰，姜鋒，陳書強，李博，孫惠君，王東，劉媛，周晶，王曉紅*

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，西安710038)

【摘要】目的探究經(jīng)輔助生殖技術(shù)(ART)助孕足月分娩的新生兒與正常自然受孕足月分娩的新生兒的出生重量、胎盤重量、出生重量與胎盤重量比值及胎盤的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因表達是否存在差異。方法選擇2014年8月至2015年1月在我院住院分娩的54例ART子代為ART組，同期住院分娩的100例自然妊娠子代為正常組。對兩組出生體重、胎盤重量及出生體重與胎盤重量比值進行測量及統(tǒng)計分析，然后各組抽取20例樣本，采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)方法檢測兩組新生兒胎盤組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因GLUT1、GLUT3、GLUT4及GLUT5 mRNA的表達水平，采用免疫印跡檢測(Western Blot)方法驗證GLUT1和GLUT3的蛋白水平。結(jié)果(1)ART組與正常組新生兒的出生體重、胎盤重量及新生兒體重與胎盤重量之比相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；(2)與正常組GLUT1與GLUT3的mRNA表達水平相比，ART組胎盤中GLUT1和GLUT3的mRNA表達水平均顯著高于正常組(P<0.05)；而兩組新生兒胎盤GLUT4與GLUT5的mRNA表達水平相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；(3)ART組GLUT1蛋白水平顯著高于正常組(P<0.05)，而GLUT3蛋白水平在兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結(jié)論ART導致足月胎盤中葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因GLUT1和GLUT3的表達增高，提示ART有可能會影響妊娠后期胎盤的葡萄糖轉(zhuǎn)運功能。

【關(guān)鍵詞】輔助生殖技術(shù)；胎盤；GLUT1；GLUT3；GLUT4；GLUT5

(JReprodMed2016，25(3)：258-263)

流行病學研究表明，胎兒子宮內(nèi)發(fā)育時環(huán)境應(yīng)激與成年后代謝性疾病顯著相關(guān)[1]?；谶@一發(fā)現(xiàn)，人們提出了“胚胎源性疾病”的假說，即在胚胎發(fā)育的關(guān)鍵階段，若胎兒生長受到影響，將會導致出生后代謝性疾病的發(fā)生。研究表明，胎兒子宮內(nèi)生長軌跡可以更好的評估胎兒在子宮內(nèi)的應(yīng)激狀態(tài)，胎兒宮內(nèi)生長軌跡的異常與出生后代謝疾病顯著相關(guān)[2]。而胎兒在宮內(nèi)的生長時期，胎盤在母胎營養(yǎng)資源分配方面起到關(guān)鍵作用，胎盤功能的改變會導致胎兒生長軌跡的異常[3]。

自1978年世界上第一個試管嬰兒誕生后，全世界已經(jīng)超過500萬的試管嬰兒誕生[4]。許多研究也證實了輔助生殖技術(shù)(ART)對于絕大多數(shù)的子代是健康的[5-6]。但研究也表明，與自然妊娠出生的子代相比，ART的子代低出生體重、出生缺陷、印記基因紊亂和胎盤異常的風險顯著增加[7-9]。ART的子代在青少年時期就表現(xiàn)出糖脂代謝的異常[10]。另有研究表明，ART會顯著影響人及動物宮內(nèi)生長軌跡：ART受孕的胎兒在妊娠早期及中期表現(xiàn)為生長遲緩，在妊娠的后期表現(xiàn)為代償性加速生長[2]。目前ART致胎兒宮內(nèi)生長軌跡改變的相關(guān)機制仍不明確。動物模型研究認為，ART可以導致胎盤的結(jié)構(gòu)異常形成，并且改變胎盤營養(yǎng)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達，因此可能會影響胎兒的正常生長和發(fā)育[2]。本研究擬通過比較ART助孕與正常自然受孕分娩的足月新生兒的出生體重、胎盤重量、出生體重與胎盤重量之比及胎盤中葡萄糖轉(zhuǎn)運體家族基因GLUT1、GLUT3、GLUT4和GLUT5的mRNA表達水平，并驗證GLUT1和GLUT3的蛋白表達水平，探究ART對胎兒、胎盤發(fā)育及胎盤葡萄糖轉(zhuǎn)運載體表達的影響，從而初步揭示ART致胎兒宮內(nèi)生長軌跡改變的分子機制。

資料與方法

一、研究對象

選擇2014年8月至2015年1月在我院住院分娩的54例ART子代為ART組，同期住院分娩的100例自然妊娠子代為正常組。兩組均為足月、單胎妊娠，母親無肥胖、糖尿病和高血壓等妊娠合并癥，新生兒外觀無明顯畸形。所有標本均經(jīng)患者及家屬知情同意，本研究獲得我院倫理委員會批準。

二、主要試劑和儀器

RNA的抽提采用TRIzol?Reagent(Invitrogen，美國)，兔抗人GLUT1多克隆抗體，兔抗人GLUT3多克隆抗體，兔抗人GAPDH多克隆抗體，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，AIphaimage2200電泳膠用凝膠成像分析系統(tǒng)(Innotech，美國)，ND2000分光光度計(Thermo，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher，美國)，熒光聚合酶鏈反應(yīng)試劑(TaKaRa，日本)，CFX96實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國)，BIO-RAD ChemiDox XRS凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。

三、研究方法

1. 標本采集：記錄產(chǎn)婦基本臨床信息，待胎兒分娩后，立即稱取新生兒出生體重及胎盤的重量。胎盤娩出后立即剪取位于臍帶附著處的胎盤小葉，去除母體蛻膜層，將胎盤絨毛于4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗。洗凈血跡后將組織以每塊約1 cm×1 cm×1 cm的大小，分裝并凍存于液氮中。0.5 h后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2. 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)技術(shù)檢測目的基因mRNA的表達：(1)胎盤組織中RNA的提?。翰捎肨RIzol法提取胎盤組織中總RNA，大約每100 mg胎盤組織中加入TRIzol 1 ml，利用ND2000分光光度計測定OD260/OD280，當比值在1.8～2.0時說明RNA的純度較好，計算獲得核酸量，并經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，樣本符合測定標準后進行后續(xù)操作。(2)逆轉(zhuǎn)錄：每例標本取1 μg RNA樣本加入至20 μl體系中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，嚴格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求進行操作。(3)RT-qPCR：引物序列根據(jù)PrimerBank上所查的序列，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下表1。反應(yīng)體系如下：PCR特異上、下引物按1∶1比例混合后取1.5 μl，cDNA模板1.5 μl，熒光染料SYBR Green 10.0 μl，加滅菌蒸餾水7.0 μl至總體積為20.0 μl。每例樣本均設(shè)3個平行復孔，取平均值。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預變性3 min，95℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)，隨后72℃延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束后記錄擴增曲線和熔解曲線，以確定樣本擴增的特異性。根據(jù)PCR擴增曲線，得到每個樣本的循環(huán)閾值(Ct值)，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達水平。

3. 免疫印跡檢測(Western Blot)方法驗證目的蛋白的表達：(1)提取胎盤組織蛋白質(zhì)后BCA法測定總蛋白濃度。(2)一抗采用兔抗人GLUT1多克隆抗體(1∶200)、兔抗人GLUT3多克隆抗體(1∶400)，以兔抗人GAPDH多克隆抗體(1∶5 000)為內(nèi)參照。(3)采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、洗膜、二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG)結(jié)合、顯影劑定影后，掃描結(jié)果與GAPDH相比較進行半定量分析。

4. 觀察指標：比較兩組母親年齡、孕周、母親體重質(zhì)量指數(shù)(BMI)、新生兒體重、胎盤重量及新生兒體重與胎盤重量之比。每組再抽選20例樣本對兩組新生兒胎盤組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因GLUT1、GLUT3、GLUT4及GLUT5的mRNA表達水平進行檢測分析，并對GLUT1和GLUT3的蛋白水平進行驗證。

四、統(tǒng)計學方法

結(jié)果

一、兩組產(chǎn)婦基本臨床資料、新生兒體重、胎盤重量及新生兒體重與胎盤重量之比的比較

ART組產(chǎn)婦年齡顯著高于正常組年齡(P<0.01)，但兩組孕周和BMI值均無顯著性差異(P>0.05)。比較ART組和正常組新生兒出生體重和胎盤重量及新生兒體重與胎盤重量之比，發(fā)現(xiàn)ART組新生兒出生體重略低于正常組，而胎盤重量和新生兒出生體重與胎盤重量之比高于正常組，但差異無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1　目的基因引物序列

表2　比較兩組產(chǎn)婦基本臨床資料、新生兒體重、胎盤重量及新生兒體重與胎盤重量之比(x-±s)

注：與正常組比較，*P<0.01

二、兩組胎盤中GLUT1、GLUT3、GLUT4及GLUT5基因的mRNA表達

從兩組樣本中各抽取的20例樣本，保證兩組的母親年齡、孕周及母親BMI均無明顯差異(P>0.05)，比較兩組新生兒出生體重和胎盤重量及新生兒體重與胎盤重量之比，結(jié)果顯示兩組無顯著性差異(P>0.05)(表3)。再分析比較ART組和正常組胎盤目的基因的mRNA的表達水平，結(jié)果顯示兩組GLUT1和GLUT3的mRNA表達水平具有顯著性差異(P<0.05)。同正常組相比，ART組GLUT1的mRNA平均表達量(0.88±0.34)顯著高于正常組(0.58±0.36)(P<0.05)，ART組GLUT3的mRNA平均表達水平(1.02±0.46)也顯著高于正常組(0.72±0.35)(P<0.05)。而ART組GLUT4和GLUT5的mRNA表達量在兩組之間，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。本實驗還檢測了ART組與正常組的GLUT2在胎盤組織中的表達，由于含量過低，Ct值較高，達不到實驗要求而放棄比較。

三、比較兩組胎盤中GLUT1和GLUT3基因的蛋白表達

與正常組比較，ART組GLUT1的表達量增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而ART組GLUT3的表達水平無顯著性差異(P>0.05)(圖2、圖3)。同正常組相比，ART組胎盤GLUT1(2.60±1.19)的蛋白表達量顯著高于正常組(1.48±0.92)(P<0.05)，而ART組與正常組胎盤GLUT3的蛋白表達水平[(1.89±0.68)vs.(1.75±0.54)]，兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖3)。

表3　產(chǎn)婦基本臨床資料、新生兒體重、胎盤重量及新生兒體重與胎盤重量之比比較(x-±s)

與正常組比較，*P<0.05圖1　正常組和ART組mRNA相對表達量的比較

圖2　正常組和ART組GLUT1和GLUT3的蛋白表達

與正常組比較，*P<0.05圖3　正常組和ART組GLUT1和GLUT3蛋白相對表達量的比較

討論

本研究通過比較ART助孕和和正常自然受孕分娩的足月新生兒的出生體重、胎盤重量、出生體重與胎盤重量之比及胎盤中葡萄糖轉(zhuǎn)運體家族基因GLUT1、GLUT3、GLUT4和GLUT5的表達水平，發(fā)現(xiàn)兩組新生兒出生體重、胎盤重量及新生兒體重與胎盤重量之比無顯著性差異，同時，兩組胎盤上GLUT4和GLUT5的mRNA表達量也無顯著性改變。但是與正常組相比，ART組胎盤上GLUT1和GLUT3的mRNA表達水平顯著增高，并且ART組GLUT1的蛋白水平也明顯增加，提示ART可能通過改變胎盤葡萄糖運輸載體基因的表達，影響了妊娠后期胎盤的葡萄糖轉(zhuǎn)運功能。

許多研究表明，宮內(nèi)環(huán)境應(yīng)激與成年后代謝性疾病密切相關(guān)。宮內(nèi)生長軌跡(intrauterine growth trajectory)是評估宮內(nèi)環(huán)境應(yīng)激的指標，ART可導致個體代謝疾病風險增加，胎兒宮內(nèi)生長軌跡的改變[2]。但ART導致宮內(nèi)胎兒生長軌跡改變(表現(xiàn)為妊娠早期及中期生長遲緩，妊娠后期代償性加速生長)的具體機制未知。本研究發(fā)現(xiàn)，與自然妊娠新生兒相比，ART助孕的足月新生兒體重、胎盤重量及新生兒體重/胎盤比值并無明顯改變，即未發(fā)現(xiàn)胎兒和胎盤在妊娠后期出現(xiàn)代償性加速生長，與文獻 [11] 的報道結(jié)果并不十分一致。Haavaldsen等[11]的研究表明，同自然妊娠相比，ART的子代胎盤重量顯著增高，但新生兒體重無差異性，而新生兒體重與胎盤體重之比則顯著性下降，本報道與其不一致的原因可能在于本研究的樣本數(shù)目偏少，尚不能發(fā)現(xiàn)兩者之間的差異性。

葡萄糖作為胎兒生長發(fā)育的主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，其從母體轉(zhuǎn)運至胎兒，主要依賴胎盤表面營養(yǎng)轉(zhuǎn)運體的易化擴散能力，因此胎盤葡萄糖轉(zhuǎn)運載體對滿足胎兒生長發(fā)育的能量需求極為重要[12]。GLUT1和GLUT3在胎盤組織表達量較高，在胎盤轉(zhuǎn)運葡萄糖的過程中起著主要作用[13]。GLUT1主要分布在胎盤的合體滋養(yǎng)層微絨毛面和基底膜面，并且具有很高的表達量。足月時GLUT1在微絨毛面上的表達量約是其在基底膜的3倍，這種不對稱性分布，能夠快速調(diào)節(jié)胎盤兩側(cè)的葡萄糖水平，有利于胎兒處于一種適宜的葡萄糖環(huán)境當中生長[14]。GLUT3在組織中也廣泛表達，并且對葡萄糖的親和力很高，隨著妊娠這一過程的推移，GLUT3的表達逐漸減少[15]，符合生命早期的發(fā)育特點，胚胎發(fā)育早期是處于一種低氧低營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的狀態(tài)，而GLUT3與底物葡萄糖具有高度親和力，可以滿足胚胎的早期發(fā)育。在本實驗研究中發(fā)現(xiàn)，GLUT1和GLUT3在妊娠末期ART胎盤中mRNA水平表達高于自然妊娠胎盤，并且ART組胎盤GLUT1的蛋白表達也增高，但GLUT3的蛋白水平無明顯改變，可能與GLUT3的基因表達受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。ART組GLUT1的表達增高可能是ART胎盤早期生長發(fā)育受到影響，達不到自然妊娠發(fā)育的胎盤的營養(yǎng)轉(zhuǎn)運效率，機體通過自身的適應(yīng)性調(diào)整，使在妊娠后期ART胎盤表面的葡萄糖主要轉(zhuǎn)運載體GLUT1的表達出現(xiàn)增高，這樣可以滿足胎兒對葡萄糖營養(yǎng)物質(zhì)的需求，保證胎兒的正常生長發(fā)育。因此，ART胎盤中GLUT1的表達增高可能與ART胎兒妊娠后期代償性加速生長相關(guān)。

GLUT4和GLUT5在胎盤組織中表達量均較低[16]，關(guān)于其在胎盤表面的作用特點、轉(zhuǎn)運效率的相關(guān)研究較少。本研究中GLUT4和GLUT5的表達水平在兩組之間沒有顯著性差異。GLUT4是胰島素依賴性的葡萄糖轉(zhuǎn)運體[15]，可能由于ART組胎盤上GLUT4對胰島素的反應(yīng)未發(fā)生明顯改變，GLUT4的表達未受到影響。GLUT5是一種果糖運輸載體，與果糖具有很高的親和力[17]，根據(jù)本實驗研究結(jié)果，GLUT5在ART子代胎盤上的表達無明顯改變，表明ART組胎盤在運輸果糖的過程中未受到影響。因此，ART胎兒在妊娠后期代償性加速生長可能與GLUT4和GLUT5的表達無關(guān)。

在動物模型中，Bloise等[18]小鼠實驗研究中，發(fā)現(xiàn)ART胎盤妊娠后期代償性增大，以補償胎兒的生長。Haavaldsen等[11]的研究與本研究均表明，人類ART來源的胎盤增重并不像小鼠那樣明顯。這表明，人與小鼠的補償機制并不相同，小鼠通過胎盤代償性增大，增加母體對胎兒營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，而人類胎盤重量并不明顯增加，而是靠代償性增加胎盤營養(yǎng)物質(zhì)運輸通道基因的表達增加營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，滿足胎兒后期代償性加速生長的需要。

本研究發(fā)現(xiàn)ART可導致人類妊娠后期胎盤葡萄糖運輸載體基因表達水平的升高，初步揭示了ART致人類妊娠后期胎兒代償性加速增長的分子機制。后期還需進行實驗研究ART胎盤的表觀遺傳學是否發(fā)生改變，進一步闡明ART致妊娠后期胎兒代償性加速增長的分子機制，可望為試管嬰兒預防成年后罹患代謝性疾病的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

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[編輯：郭永]

Glucose transporter genes up-regulation in placeta derived from assisted reproductive technologies

DONGJie，JIANGFeng，CHENShu-qiang，LIBo，SUNHui-jun，WANGDong，LIUYuan，ZHOUJing，WANGXiao-hong*

ReproductiveMedicalCentre，TangduHospital，theForthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710038

【Abstract】

Objective： To determine whether assisted reproductive technology (ART) affects the birth weight，placental weight，ratio of fetal/placental weight and the expression of placental glucose transporter genes of singleton full-term neonates.

Methods： The birth weight，placental weight and ratio of the fetal/placental weight were compared between 54 singleton full-term neonates derived from ART (ART group) and 100 singleton full-term neonates naturally-born (control group). Then，20 placentas were selected from each group for detecting the expressions of placental glucose transporter genes (GLUT1，GLUT3，GLUT4 and GLUT5) by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The protein expressions of GLUT1 and GLUT3 were confirmed by Western Blot.

Results： There are no significant differences in new birth weight，placental weight and ratio of fetal/placental weight between the ART group and the control group (P>0.05). Compared with the control group，the mRNA expressions of GLUT1 and GLUT3 in placenta were significantly up-regulated in ART group (P<0.05). However，there was no significant different in the mRNA expression of GLUT4 and GLUT5 between the two groups (P>0.05). The protein expression of GLUT1 in ART group was significantly higher than that in the control group (P<0.05)，whereas GLUT3 protein expression did not significantly different (P>0.05).

Conclusions： The expressions of GLUT1 and GLUT3 are significantly increased in the placenta derived from ART，which suggests that ART may affect the placental glucose transport in later gestation.

Key words：Assisted Reproductive Technologies；Placenta；GLUT1；GLUT3；GLUT4；GLUT5

【作者簡介】董杰，男，湖北武穴人，碩士，生殖內(nèi)分泌專業(yè).(*通訊作者)

【收稿日期】2015-08-04；【修回日期】2015-10-29

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.3.012