李通，黎欣，高楓，黃家豪，甘嘉亮

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

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·論著·

芒柄花黃素對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡的影響及機制探討

李通，黎欣，高楓，黃家豪，甘嘉亮

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

摘要：目的觀察芒柄花黃素對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡的影響，并探討其機制。方法將結(jié)直腸癌細胞HCT116隨機分為兩組，觀察組分別以25、50、100 μmol/L芒柄花黃素處理，對照組以等量二甲基亞砜處理；用MTT法檢測細胞增殖情況(A490)，Hoechst熒光染色法計數(shù)凋亡細胞，qRT-PCR法檢測細胞中的HOC轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)，Western blot法檢測細胞中的Bax和Bcl-2。結(jié)果與對照組比較，觀察組隨著芒柄花黃素濃度增加及處理時間延長HCT116細胞A490值降低(P均<0.05)；觀察組以25、50、100 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HCT116細胞凋亡數(shù)分別為(3.20±0.84)、(20.20±1.92)、(31.00±2.92)個/HP，均高于對照組的(1.6±1.14) 個/HP(P均<0.01)；與對照組比較，觀察組細胞HOTAIR、Bcl-2表達量降低，而Bax表達量增加，P均<0.05。結(jié)論芒柄花黃素可能通過抑制HOTAIR調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達，從而抑制結(jié)直腸癌細胞的生長并誘導(dǎo)細胞凋亡。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸癌；芒柄花黃素；HOC轉(zhuǎn)錄反義RNA；Bax蛋白；Bcl-2蛋白；細胞增殖；細胞凋亡

結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)生、發(fā)展是多個基因和多種因素綜合調(diào)控的結(jié)果。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的長鏈非編碼RNA，其在CRC組織中高表達，并能促進CRC細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。雖然CRC靶向癌基因治療的效果顯著，但不良反應(yīng)強，價格昂貴，應(yīng)用范圍受限。因此，尋找一種作用于癌基因殺死腫瘤細胞的低毒、廉價新藥尤為重要。芒柄花黃素是傳統(tǒng)中藥紅三葉草的有效成分，近年研究發(fā)現(xiàn)其能有效抑制多種腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[2～4]。2105年4～11月，我們觀察了不同濃度芒柄花黃素對CRC細胞HCT116增殖、凋亡的影響，并檢測細胞HOTAIR及Bax、Bcl-2蛋白表達變化，探討芒柄花黃素的抗腫瘤作用及潛在機制?，F(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑HCT116細胞株購自上海細胞生物研究所，芒柄花黃素(>99.0%)、噻唑藍(MTT)和熒光染料Hoechst33258購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自中國維森特生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購自澳大利亞Excellbio公司，RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司；GAPDH、Bax及Bcl-2兔抗人多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2細胞培養(yǎng)將HCT116細胞置于含1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3細胞增殖情況觀察采用MTT法。取對數(shù)生長期的HCT116細胞，以4×103/孔接種96孔板，終體積為200 μL/孔。培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，將細胞分為兩組；觀察組以含25、50、100 μmol/L芒柄花黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組以含0.1%二甲基亞砜(DMSO)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個濃度5個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后加入MTT 溶液，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中放置4 h；移除孔內(nèi)液體后加入DMSO，用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光值(A490)，以此表示細胞增殖情況。實驗獨立重復(fù)3次，取均值。

1.4細胞凋亡情況觀察采用Hoechst熒光染色法。將對數(shù)生長期的HCT116細胞接種至放置好蓋玻片的 6 孔板中。培養(yǎng)12 h細胞貼壁后分組及處理同1.3，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。吸盡培養(yǎng)液，加入多聚甲醛固定10 min，再加入Hoechst33258 染色液避光孵育10 min；熒光顯微鏡下(200×)觀察細胞核變化，統(tǒng)計細胞凋亡個數(shù)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5細胞HOTAIR檢測收集1.4培養(yǎng)48 h的兩組細胞，用RNA提取試劑盒提取HCT116細胞總RNA，采用核酸檢測儀測總RNA的含量和純度，分別將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用HOTAIR基因特異性引物進行實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)，按說明書操作。HOTAIR引物序列：上游為5′-GGTAGAAAAAG-CAACCACGAAGC-3′，下游為5′-ACATAAACCTCTGTCT-GTGAGTGCC-3′；β-actin引物序列：上游為5′-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，下游為5′-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。反應(yīng)步驟：50 ℃ 2 min，95℃ 10 min, 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCT表示HOTAIR相對表達量。

1.6細胞Bax及Bcl-2蛋白檢測采用Western blot法。收集1.4培養(yǎng)48 h的兩組細胞，加裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，核酸檢測儀檢測樣品蛋白濃度。以每孔100 μg蛋白上樣，濃縮膠電泳電壓為60 V，分離膠為120 V，電泳3 h。用聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，以含5%脫脂奶粉的PBS封閉1 h；分別加Bax、Bcl-2抗體和GAPDH 4 ℃過夜，抗體稀釋度均為1∶1 000。以Tris-PBS溶液洗膜5 min×3次，室溫避光孵育熒光二抗(1∶10 000) 1 h；用Tris-PBS溶液洗膜5 min×5次，用雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜。以目的蛋白與GAPDH條帶的光密度比值表示目的蛋白相對表達量。

2結(jié)果

2.1芒柄花黃素對HCT116細胞增殖能力的影響兩組細胞增殖能力比較見表1。

表1　兩組細胞增殖能力比較±s)

注：與對照組同時點比較，*P<0.05；與同濃度上一時點比較，#P<0.05；與同時點上一濃度比較，△P<0.05。

2.2芒柄花黃素對HCT116細胞凋亡的影響觀察組以25、50、100 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HCT116細胞凋亡數(shù)分別為(3.20±0.84)、(20.20±1.92)、(31.00±2.92)個/HP，均高于對照組的(1.6±1.14) 個/HP(P均<0.01)。

2.3芒柄花黃素對HCT116細胞HOTAIR、Bax、Bcl-2表達的影響兩組HOTAIR、Bax、Bcl-2表達比較見表2。

表2　兩組HOTAIR、Bax、Bcl-2表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

3討論

芒柄花黃素是一種活性異黃酮，其分子結(jié)構(gòu)類似雌二醇，可通過雌激素受體(ER)發(fā)揮作用[5]。ER主要分為ERα和ERβ，結(jié)腸上皮細胞中主要表達ERβ[6]。ERβ介導(dǎo)的信號通路參與雌激素依賴性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而CRC是一種雌激素依賴性腫瘤，雌激素替代療法能明顯降低絕經(jīng)后婦女CRC發(fā)病率[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中ERβ表達降低，且ERβ表達量與CRC腫瘤大小、分期和預(yù)后呈負相關(guān)[9]。在CRC細胞中過表達ERβ后細胞增殖受到抑制，細胞周期阻滯在G1期[10]。又有研究發(fā)現(xiàn)，異黃酮可上調(diào)CRC細胞ERβ表達，通過多個信號通路抑制癌細胞的增殖和侵襲能力[11]。本研究顯示，芒柄花黃素能明顯抑制HCT116細胞的增殖能力，并誘導(dǎo)其凋亡。

HOTAIR是一種長鏈非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)其與CRC、乳腺癌、肝癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并可作為相關(guān)腫瘤診斷和預(yù)后判斷的重要標(biāo)志物[12]。CRC患者的腫瘤和血液中HOTAIR顯著高表達，其水平與肝轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[13]。在CRC中HOTAIR結(jié)合于多硫蛋白抑制復(fù)合體2(PRC2)，并介導(dǎo)其抑制相關(guān)抑癌基因的表達，從而促進腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[14]。沉默CRC細胞中的HOTAIR后能抑制細胞的侵襲和增殖能力，并增強細胞對放療的敏感性[15]。本研究結(jié)果顯示，芒柄花黃素作用于HCT116細胞后，其HOTAIR表達水平呈劑量依賴性下降。這提示芒柄花黃素可能通過ERβ介導(dǎo)的HOTAIR信號通路抑制細胞的增殖能力。細胞凋亡是由基因控制的細胞程序性死亡，它主要包括線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩條凋亡通路，而線粒體通路是控制凋亡的主要通路。Bcl-2和Bax是調(diào)控線粒體凋亡通路的關(guān)鍵凋亡蛋白。Bcl-2是抗凋亡基因，能促進腫瘤細胞增殖；Bax蛋白卻可抑制Bcl-2的活性，并促進細胞凋亡。研究顯示，在頭頸部鱗狀細胞癌中沉默HOTAIR能夠抑制癌細胞增殖并誘導(dǎo)癌細胞凋亡，并證實線粒體凋亡通路Bax/Bcl-2參與到這一HOTAIR相關(guān)的凋亡過程中。我們的數(shù)據(jù)顯示，芒柄花黃素能夠升高Bax表達，同時抑制Bcl-2表達從而誘導(dǎo)HCT116細胞凋亡。

綜上所述，芒柄花黃素能抑制CRC細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，這一過程可能由HOTAIR/Bax/Bcl-2信號通路介導(dǎo)，為芒柄花黃素用于CRC的臨床治療提供了理論依據(jù)。

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Effects of formononetin on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells and its mechanism

LITong,LIXin,GAOFeng,HUANGJiahao,GANJialiang

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of formononetin on the proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells in vitro and to study the underlying mechanism. MethodsThe colorectal cancer cells HCT116 were randomly divided into two groups: the observation group and the control group. Cells in the observation group were treated with 25 μmol/L, 50 μmol/L and 100 μmol/L formononetin, and the control group was treated with the same amount of dimethyl sulfoxide. The proliferation (A490) of HCT116 cells measured by MTT assay, the apoptosis was assessed with Hoechst 33258 staining, the expression level of HOC transcription antisense RNA (HOTAIR) was quantified by qRT-PCR, and the expression level of Bax protein and Bcl-2 protein was determined by Western blotting. Results Compared with the control group, the A490values of the HCT116 cells constantly decreased along with the increased doses and prolonged time in the observation group (all P<0.05). The numbers of apoptosis cells in the observation group treated with 25 μmol/L, 50 μmol/L and 100 μmol/L formononetin after 48 h were respectively (3.20±0.84), (20.20±1.92) and (31.00±2.92)/ HP, which were all higher than that[(1.6±1.14)/HP]of the control group (all P<0.01). Compared with the control group, the expression of Bcl-2 protein and HOTAIR was significantly decreased, but the expression of Bcl-2 protein was significantly increased in the observation group (all P<0.05). ConclusionFormononetin may inhibit the growth and induce the apoptosis of colorectal cancer cells by inhibiting HOTAIR to regulate the expression of Bcl-2 and Bax protein.

Key words:colorectal carcinoma; formononetin; HOC transcription antisense RNA; Bax protein; Bcl-2 protein; cell proliferation; apoptosis

(收稿日期：2015-12-10)

中圖分類號：R735.3

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0001-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.001

通信作者簡介：甘嘉亮(1972-)，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向為結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)與臨床。E-mail： gjl259@126.com

作者簡介：第一李通(1990-)，男，碩士研究生，主要研究方向為結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)和臨床。E-mail： leetongmail989@163.com

基金項目：廣西自然科學(xué)基金面上項目(2013GXNSFAA019153)；廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(2013ZD015)。