王 梓,韓曉增,,*,張志明,郝翔翔

1 東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院, 哈爾濱 150030 2 中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站,哈爾濱 150081

中國東北黑土土壤剖面微生物群落碳源代謝特征

王 梓1,韓曉增1,2,*,張志明2,郝翔翔2

1 東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院, 哈爾濱 150030 2 中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站,哈爾濱 150081

利用Biolog Eco微平板培養(yǎng)法,對中國科學院海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站農(nóng)田(CL)、恢復草地(GL)和人工林地(FL)土壤剖面不同深度土壤中微生物群落碳源代謝特征進行研究。理化性質(zhì)結(jié)果顯示,有機碳、全氮和堿解氮含量隨深度增加逐漸減少,pH則是上層土壤低于底層?？膳囵B(yǎng)微生物數(shù)量從表層(0—20 cm)到底層(180—200 cm)逐漸減少, 在表層(0—20 cm)3種可培養(yǎng)微生物數(shù)量均為草地>農(nóng)田>林地。可培養(yǎng)微生物主要生活在近地表0—60 cm土層中,在60—200cm土層中3種利用方式下可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌數(shù)量基本相同。Biolog結(jié)果顯示,在0—40 cm土層中微生物群落活性最大,底層(180—200 cm)土壤微生物群落活性最小。3種利用方式剖面微生物群落Shannon多樣性指數(shù)和碳源利用數(shù)量從表層到底層逐漸減少,并且與SOC和TN呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P< 0.05)。與農(nóng)田相比恢復草地和人工林地剖面20—40 cm土層中微生物群落對各類碳源的利用強度都較高,說明沒有農(nóng)業(yè)機械作業(yè)的植被自然生長條件下根系會打破原來農(nóng)田中的犁底層,促進表層(0—20 cm)以下微生物群落活性。碳源利用率和主成分分析結(jié)果表明長期不同植被覆蓋已經(jīng)改變了剖面微生物群落碳源代謝特征,而且根系已經(jīng)影響到100 cm的微生物群落,但還沒有影響到180—200cm中的微生物群落。

黑土; 剖面; 微生物群落; 碳源代謝特征

土壤生物被認為是地球關(guān)鍵元素生物,是地球化學循環(huán)過程的引擎[1],而土壤微生物由于數(shù)量巨大,種類豐富成為其中非常重要的組成部分[2],對土壤生態(tài)功能的發(fā)揮有極為重要的作用[3- 5]。土壤是在地球表層母質(zhì)或母巖上發(fā)育起來的自然體,土體物質(zhì)垂直分布的斷面稱為土壤剖面,土壤剖面中的物質(zhì)變化過程,是植被根系-微生物-土壤非生命物質(zhì)三者相互作用過程[6-7]。植物根系的分布會改變不同深度土層中微生物生存的物理環(huán)境,同時根系代謝產(chǎn)物和死亡部分又能給微生物提供生命活動的能量和物質(zhì)。剖面中微生物群落的活動控制C、N、P等重要元素的生物地球化學循環(huán),致使某些物質(zhì)在土壤剖面中存在位置的再分配。所以隨著時間的變化,根系-微生物-土壤這個體系在相互作用中不斷地向著某一個方向發(fā)育。

中國東北黑土是在沖積沉積物上發(fā)育的土壤,土體深厚、土壤粘重,形成界限分明的表層、亞表層、過渡層和母質(zhì)層。剖面中不同層次間微生物群落結(jié)構(gòu)和活性是不同的,一些研究也證明了這一點,在新疆阜康地區(qū)農(nóng)田中表層土壤中放線菌門和變形菌門是群落中主要的類群,二者相對豐度接近50%,但是在亞表層中放線菌門相對豐度逐漸減少,變形菌門相對豐度逐漸增加[8]。2012年研究人員對美國科羅拉多州戈登峽谷流域剖面微生物群落進行研究也表明表層土壤微生物群落組成與亞表層土壤微生物群落組成差異非常大[9]。這些研究結(jié)果表明土壤剖面中不同層次微生物群落組成差異很大,從而推論剖面不同深度土層中微生物群落碳源代謝能力也會存在較大的差異,然而截止到目前為止,對黑土不同利用方式剖面不同深度土層中微生物碳源代謝特征的研究,國內(nèi)外還鮮有報道。

Biolog 作為研究土壤微生物群落功能多樣性的一種簡單、快速方法[10- 14],已經(jīng)對不同土壤類型[15]、不同植物根系活動下[16-17]的根際土壤微生物多樣性和碳源代謝特征做了很多研究。本研究應用Biolog方法研究不同利用方式下黑土剖面不同深度土層中微生物群落碳源代謝特征的變化,區(qū)分不同深度土層中微生物群落的主要代謝碳源類型和利用強度,更深刻的理解微生物群落變化與土壤剖面物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系,加深對土壤形成的認識,具有重要的生態(tài)環(huán)境意義。

1 材料方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗區(qū)位于中國科學院海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站(47°26′N,126°38′E),地處黑龍江省中部,屬溫帶大陸性季風氣候,平均海拔234 m,年均氣溫1.5℃,≥10 ℃的有效積溫2400—2500℃,無霜期120—130 d,作物生長期約120 d。全年降水量500—600 mm,80%以上集中在5—9月[18]。

1.2 試驗設計

試驗區(qū)位于500 m×150 m的區(qū)域內(nèi),地勢平坦,土壤質(zhì)地均一。土壤類型為第四紀黃土狀亞黏土發(fā)育而成的中厚層黑土。于1985年設置以下3 種土地利用方式：1) 草地(GL),1985年退耕休閑,植被類型為草原化草甸植被,主要植被有苔草(Carex)、問荊(EquisetumarvenseL.)和狗尾草(Setariaviridis)等;2)農(nóng)田(Cropland,CL),采用傳統(tǒng)常規(guī)耕作方式,不施肥,種植制度為小麥-玉米-大豆輪作,一年一熟制,本研究當季種植作物為大豆(Soybean),秋季收獲后將作物地上部全部移除;3)林地(Forestland,FL),于1985年在耕地上直接種植紅皮云杉(Piceakoraiensis),種植密度為2 m×2 m,株高約4.5 m。

1.3 樣品采集

2013年6月每種利用方式挖取3個土壤剖面,剖面深度為200 cm,在表層采集0—10 cm和10—20 cm,之后以每20 cm為1層,共采集11層土壤樣品。土壤樣品裝入封口袋內(nèi),放入冰盒運回實驗室,4℃冰箱中保存,以備分析。

1.4 試驗方法

土壤有機碳與全氮采用元素分析儀(EA3000, Euro Vector, Italy)測定;堿解氮采用堿解擴散法測定;土壤速效鉀采用乙酸銨提取法-火焰光度計測定;土壤pH采用電位法(水土比2.5∶1)。

土壤可培養(yǎng)細菌、放線菌和真菌計數(shù)采用平板菌落計數(shù)法測定。細菌采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(pH 7.0—7.2),放線菌采用改良高氏1號培養(yǎng)基(pH 7.2—7.4),真菌采用馬丁(Mantin)培養(yǎng)基[19-21]。

Biolog EcoPlate接種和培養(yǎng)：稱取相當于5 g烘干土重的鮮土加入到裝有45 mL滅菌生理鹽水(0.85%)的三角瓶中,超聲1 min,然后在振蕩器上振蕩40 min混勻。土壤溶液稀釋至10-3濃度梯度,向ECO板中每孔加入150 μL土壤稀釋液,28℃保濕避光培養(yǎng)216 h。每隔24 h用Biolog 自動讀數(shù)儀測量590 nm(顏色和濁度)和750 nm(濁度)波長下的數(shù)值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

按照Classen[20]方法計算：

(1)平均顏色變化率(AWCD)

AWCD=∑(C590-750)/n;

(2)Shannon指數(shù)H(評估物種豐富度)

H=-∑piln(pi)。

式中,C是反應孔吸光值,n是碳源數(shù)。pi為第i孔相對吸光度值與整個平板相對吸光度值總和的比率。

選擇培養(yǎng)第6天的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。

試驗結(jié)果的方差分析及主成分分析采用SPSS 19.0進行。

2 結(jié)果

2.1 理化性質(zhì)

雖然地表植被不同,但是SOC、TN和EN都隨著深度增加而減少,在0—10 cm土層中草地含量高于林地和農(nóng)田。SOC、TN和EN在0—60 cm土層變化最大,在60—200 cm土層變化減小。3個剖面表層pH都低于底層。

2.2 可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化

剖面不同層次可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示,無論是真菌、細菌還是放線菌都是表層數(shù)量最多,3種利用方式中60 cm以下土層的可培養(yǎng)微生物數(shù)量幾乎相同。但是在0—20 cm土壤中無論真菌、細菌還是放線菌數(shù)量均為草地>農(nóng)田>林地。

2.3 剖面中不同層次土壤微生物碳源代謝特征

2.3.1 土壤微生物群落平均顏色變化率

從剖面不同層次平均顏色變化率(AWCD)結(jié)果(圖3)可以看到,微生物群落的活性(AWCD高低)隨剖面深度增加而減小。農(nóng)田0—20 cm土層的AWCD值顯著高于其他層次,由于農(nóng)田0—20 cm土壤每年都會翻耕,并且作物根系主要集中在0—20 cm層次中,所以在0—10cm和10—20cm土層中AWCD值相近。由于農(nóng)田剖面中有犁底層產(chǎn)生,這決定了耕層以下微生物群落的AWCD值較低。草地剖面中植被種類多根系密集,所以0—10 cm和10—20 cm層表現(xiàn)出較高的AWCD值?；謴筒莸靥幚碇杏捎诖罅侩s草根系進入較深的土層中,所以40—60 cm層中AWCD值仍然較高,顯著高于農(nóng)田和林地相應層次。人工林地0—40 cm之間的3個土層的AWCD值比較接近,但是顯著高于深層次土層的AWCD值。

圖1 3種利用方式下剖面的土壤屬性Fig.1 Soil properties of soil profile under three land useCL: 農(nóng)田Crop Land; GL: 草地Grass Land; FL: 林地Forest Land

圖2 剖面中可培養(yǎng)微生物數(shù)量Fig.2 The number of cultivable microorganisms in three profiles

圖3 平均顏色變化率變化Fig.3 Average Well Color Development (AWCD) of microbial community in three profiles

2.3.2 多樣性指數(shù)

Shannon指數(shù)是應用最廣泛的多樣性指數(shù),是評價群落物種多樣性的指數(shù)。3個處理中,表層多樣性指數(shù)顯著高于底層(P<0.05),碳源利用數(shù)量結(jié)果也是如此(P<0.05)(表1)。在0—40 cm土層中草地剖面中的Shannon指數(shù)和碳源利用數(shù)量都是最高的,說明草地植被會增加微生物群落的多樣性。但是3個剖面在底層(180—200 cm)無論是多樣性指數(shù)還是碳源利用數(shù)量是沒有顯著差異(表1),所以可以推測雖然不同類型的植被在同一塊土地生長了近30年,但是不同類型的植被并沒有對底層的微生物群落碳源代謝多樣性產(chǎn)生影響。

2.3.3 碳源相對利用率

Eco板中有31個碳源,分為6類,由于碳源含有生態(tài)有關(guān)的化合物,所以更適合研究土壤微生物的功能多樣性[11]。由于機械作業(yè)在農(nóng)田耕層(0—20 cm)下會產(chǎn)生一層堅硬的犁底層,會阻礙水分、肥料和植物根系進入土壤剖面下方,從圖4中看到,農(nóng)田剖面中6類碳源的吸光值都是0—20 cm土層最高,之后隨深度增加而降低。糖類、氨基酸類、羧酸類和酚酸類在20 cm之后迅速下降,這4類碳源在Eco板上31個碳源中是大多數(shù)。并且糖類、氨基酸類和羧酸類是土壤微生物群落利用最多的碳源,這些碳源在20 cm土層以下利用程度迅速下降,說明了人類農(nóng)業(yè)活動對土壤剖面微生物群落的影響是很大的。草地和林地0—40 cm中各類碳源利用變化較大,但是在40 cm以下碳源利用程度逐漸減小。

表1 不同植被對剖面微生物群落Shannon指數(shù)和碳源利用數(shù)量的影響

CL: 農(nóng)田Crop Land; GL: 草地Grass Land; FL: 林地Forest Land； 平均值±標準偏差,n=3; 大寫字母代表不同處理相同層次(P<0.05),小寫字母代表相同處理不同層次(P<0.05)

圖4 3個剖面不同土壤層次內(nèi)微生物群落對6類碳源的利用強度Fig.4 Utilization intensity of six kind carbon sources in all layers of three profiles

2.3.4 主成分分析

圖5 對3個剖面不同層次土壤微生物群落的主成分分析 Fig.5 Principal component analysis of soil microbial community in all layers of three profiles

微生物群落對碳源利用情況反映了微生物群落組成的變化[21],對碳源利用結(jié)果進行主成分分析。從圖5中看到在3個剖面中微生物群落從表層逐漸過渡到底層,既反映了微生物群落碳源利用特征的變化,也反映了微生物群落組成的變化。從0—100 cm土層中表現(xiàn)出植被根系對微生物群落都產(chǎn)生了影響,導致微生物群落碳源利用特征產(chǎn)生分異,而在180—200 cm土層中植被根系的影響幾乎消失。

3 討論

3.1 可培養(yǎng)微生物數(shù)量在剖面中的分布情況

雖然平板稀釋法培養(yǎng)的微生物只是整個群落中的一小部分[22-23],但是依然可以從某種程度上表現(xiàn)出微生物群落的變化趨勢。在研究中可培養(yǎng)微生物數(shù)量隨深度增加而減少,與以前的研究相同[24]。前期的研究表明,植被根系對SOC的影響可以達到100 cm以下[25],但是對可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響只是在0—60 cm中(圖2)。在0—60 cm中草地植被顯著提高了可培養(yǎng)微生物的數(shù)量,林地的可培養(yǎng)微生物數(shù)量卻是減少了,這充分體現(xiàn)了植被對土壤微生物群落生存環(huán)境的影響。而且最近的研究表明,不同的植被覆蓋對微生物群落組成以及碳礦化速率都有非常大的影響[26]。從表層到深層的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)顯示養(yǎng)分含量隨逐漸減少,容重逐漸增加[25],說明越往深層土壤孔隙越少,空氣越少,造成水分養(yǎng)分運移減少[27],環(huán)境逐漸變得惡劣,所以可培養(yǎng)微生物數(shù)量隨深度減少甚至消失。

不僅可培養(yǎng)微生物總量隨著深度變化而變化,各類群微生物比例也隨深度變化而變化(表2)。農(nóng)田由于每年翻耕,所以0—10 cm和10—20 cm中的細菌、放線菌和真菌的數(shù)量和比例相近。由于20—40 cm是犁底層,經(jīng)過機械壓實容重較大,所以這一層中細菌比例減少,細菌總量也是少于0—20cm表層土壤。可培養(yǎng)微生物在草地剖面所有土層中都被檢測到,在0—80 cm中細菌和放線菌的比例較大,在80 cm以下細菌和放線菌比例急劇減少,二者比例逐漸接近。說明根系作用的層次主要是0—80 cm。林地只在0—40 cm中3種微生物都被檢測出,但細菌與放線菌的比例顯著小于同層次的農(nóng)田和草地,可能由于木本植被是多年生植被,根系在土壤中很深,近地表的根系并不是農(nóng)作物與雜草那樣柔軟且具有大量根毛的根系,所以不能刺激微生物生長;林地中地表溫度也要低于草地和農(nóng)田;其次林地地表有一層半分解的枯枝落葉層,而且枯枝落葉分解主要依靠真菌。這些原因綜合起來決定了林地中可培養(yǎng)微生物總量較少,整個微生物群落中也是真菌比例較大。

表2 在3個剖面中不同層次可培養(yǎng)細菌、放線菌和真菌數(shù)量的比值

3.2 剖面中微生物群落的能源利用特征

利用方式是影響土壤剖面土壤屬性最主要的人為因素之一,植被的轉(zhuǎn)變導致進入土壤中凋落物種類和數(shù)量的變化,造成凋落物分解后進入土壤剖面中的物質(zhì)量和種類不同[28]。Biolog可研究土壤微生物群落對碳源利用能力的變化規(guī)律,但無法對土壤微生物進行分類研究[29],所以在本文研究有一定局限性。但綜合幾種傳統(tǒng)方法,仍能探索微生物群落在土壤剖面中利用碳源的規(guī)律。微生物群落AWCD,多樣性指數(shù)和碳源利用數(shù)量都隨著深度增加而減少,其中多樣性指數(shù)與SOC和TN呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(表3),說明剖面中微生物群落多樣性隨養(yǎng)分含量減少而減少。值得注意的是,草地與林地的多樣性指數(shù)與pH呈極顯著負相關(guān),但是農(nóng)田的多樣性指數(shù)卻沒有顯著相關(guān),這一點也與前期有機碳在剖面分布結(jié)果相同[25],都證明了人類生產(chǎn)活動對土壤屬性會產(chǎn)生顯著影響。

表3 多樣性指數(shù)與理化性質(zhì)相關(guān)關(guān)系

**P<0.01

黑土農(nóng)田剖面中由于每年的翻耕和機械壓實產(chǎn)生了犁底層[30],阻擋了根系的生長,所以每種碳源利用程度都在0—20 cm較高,在20 cm以下逐漸下降。地上植被轉(zhuǎn)變后經(jīng)過植被自然生長,犁底層逐漸消失,根系活動的土層加深導致剖面中不同層次微生物群落對6類碳源的利用發(fā)生變化(圖4)。在0—10 cm土層中林地對羧酸類碳源的利用顯著低于草地和農(nóng)田。而且林地剖面中微生物群落對碳源的利用強度在40 cm以下土層才逐漸下降;而草地剖面中微生物群落在除糖類和胺類碳源利用強度變化與農(nóng)田相似外,氨基酸類、羧酸類和酚酸類碳源利用強度在40 cm以下土層逐漸減弱,而聚合物類碳源利用強度在60 cm以下在逐漸減弱。從主成分分析結(jié)果中可以看到,根系已經(jīng)影響到100 cm以下的土壤微生物群落,但是并沒有影響到180—200 cm土層的微生物群落。

本研究應用的Biolog技術(shù)由于其操作簡便廣泛應用于微生物群落功能多樣性的研究中。但是本身也有一定的局限性,其中所含的碳源具有一定的人為傾向,并沒有包含土壤中所有種類的化合物,而且只能檢測到生長較快的微生物類群,這樣有可能低估土壤微生物群落的實際代謝水平[31]。因此,在今后的研究中盡量結(jié)合多種研究方法,得到更全面的更客觀的研究結(jié)果。

4 結(jié)論

對黑土不同利用方式下土壤剖面中微生物群落碳源利用特征研究表明,從農(nóng)田植被轉(zhuǎn)變?yōu)榛謴筒莸卦黾恿丝膳囵B(yǎng)微生物數(shù)量,轉(zhuǎn)變?yōu)槿斯ち值睾鬁p少了可培養(yǎng)微生物數(shù)量。植被根系對可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響在0—60 cm之間?；謴筒莸睾腿斯ち值爻烁淖儽韺游⑸锶郝浠钚院吞荚蠢脧姸韧?還改變了100 cm以下的微生物群落碳源代謝特征,增加了剖面深層中的微生物活性及各類碳源的利用強度,促進了剖面中養(yǎng)分與物質(zhì)的循環(huán)。

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Metabolic characteristics of the microbial community on the basis of carbon source in black soil profiles in northeastern China

WANG Zi1, HAN Xiaozeng1,2,*, ZHANG Zhiming2, HAO Xiangxiang2

1CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China2NationalObservationStationofHailunAgroecologySystem,Northeast-InstituteofGeographyandAgroecology,ChineseAcademyofSciences,Harbin150081,China

Using long-term field experiment of different ecosystems established at the Hailun State Key Experimental Station of Agroecology, Chinese Academy of Sciences, soil profiles down to the parent material layer (200 cm) were collected to investigate microbial metabolic characteristics of the carbon source by using the Biolog ECO micro-plate technique. The field treatments included three different ecosystems: Crop Land (CL), Grass Land (GL), and Forest Land (FL). The results showed that soil organic carbon (SOC), total nitrogen (TN), and effective nitrogen (EN) decreased with soil depth; soil pH increased with soil depth, and it was lower in the surface layer (0—20 cm) than in the bottom layer (180—200 cm). The number of cultivable microorganisms (bacteria, fungi, and actinomycetes) gradually decreased with soil depth; the cultivable microorganisms mainly lived in the top 0—60 cm soil layer. The numbers of the three types of cultivable microorganisms decreased in the order of GL > CL > FL at 0—20 cm soil depth, and the numbers were almost the same in the three ecosystems in the 60—200 cm soil layer. Activities of the soil microbial community were the highest at 0—40 cm soil depth and decreased with soil depth; the lowest value was observed in the 200 cm soil layer. Similar to SOC and TN, the Shannon diversity index and carbon source utilization gradually decreased with soil depth and showed a positive correlation with SOC and TN (P< 0.05). Compared to CL, carbon use efficiency of the soil microbial community improved at subsurface soil depth (20—40 cm) in GL and FL. This demonstrated that the roots of the vegetation could break the plow pan in GL and FL soils without any tillage activities and promote the activities of the soil microbial community below the surface soil layers. Principal component analysis of the utilization intensity of six types of carbon sources showed that the different long-term ecosystems with different vegetation types had changed the carbon utilization intensity of the soil microbial community in the soil profiles. The roots of the vegetation or crops had great influence on the soil microbial community to 100 cm depth, but not to 200 cm depth.

black soil; soil profile; microbial community; metabolic characteristics

國家自然基金資助項目(41371296)

2015- 09- 28;

2016- 04- 29

10.5846/stxb201509281979

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xzhan@iga.ac.cn

王梓,韓曉增,張志明,郝翔翔.中國東北黑土土壤剖面微生物群落碳源代謝特征.生態(tài)學報,2016,36(23):7740- 7748.

Wang Z, Han X Z, Zhang Z M, Hao X X.Metabolic characteristics of the microbial community on the basis of carbon source in black soil profiles in northeastern China.Acta Ecologica Sinica,2016,36(23):7740- 7748.