單秋霞,李建杰,吳　曉,杜與沖,袁旭軍

(1.上海理工大學(xué) 光電信息與計算機工程學(xué)院,上?！?00093;2.上?？圃措娮涌萍加邢薰?上?！?01101)

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恒溫PCR雙通道熒光讀數(shù)儀的系統(tǒng)設(shè)計

單秋霞1,李建杰1,吳曉2,杜與沖2,袁旭軍2

(1.上海理工大學(xué) 光電信息與計算機工程學(xué)院,上海200093;2.上?？圃措娮涌萍加邢薰?上海201101)

摘要針對傳統(tǒng)PCR檢測儀在檢測速度和精度上存在的問題,文中設(shè)計了恒溫PCR雙通道熒光讀數(shù)儀系統(tǒng),系統(tǒng)采用實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(SAT),大幅提高了擴增反應(yīng)時間。然而考慮到SAT技術(shù)仍無法避免假陰性,文中在此基礎(chǔ)上提出了雙通道的光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計,在檢測樣品陰陽性的同時對陰性樣品進行實時監(jiān)控。結(jié)果表明,該系統(tǒng)最快可在30 min內(nèi)完成檢測,可有效指示假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn),并具有檢測速度快、精確度高、且穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

關(guān)鍵詞PCR儀;恒溫擴增;雙通道熒光檢測

System Design of Constant Temperature Dual-channel PCR Fluorescent Reader

SHAN Qiuxia1,LI Jianjie1,WU Xiao2,DU Yuchong2,YUAN Xujun2

(1.School of Optical-Electrical and Computer Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China;2.Shanghai Cohere Electronics Technology Co.,Ltd,Shanghai 201101,China)

AbstractA system of constant temperature dual-channel fluorescent reader is designed to improve the detection speed and accuracy of traditional ones.The system is based on the technology of real-time simultaneous amplification and testing (SAT),with which the time of amplification reaction can be greatly reduced.Since the technology of simultaneous amplification and testing still cannot avoid the false negative results,a dual-channel optical system is designed based on the technology to offer accurate detection of the characteristics of sample.Real-time monitoring of negative ones is also achieved.Experiments demonstrate that the system can indicate false negative results effectively within 30 minutes with high accuracy and good stability.

KeywordsPCR instrument;isothermal amplification;dual-channel fluorescence detection

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerize Chain Reaction,PCR),是一種基于特定的DNA片段在體外進行快速擴增的方法,其是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一次重大革命,使生物醫(yī)學(xué)研究從宏觀水平和細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平,廣泛應(yīng)用于病原體測定、免疫分析、基因表達、多態(tài)性研究以及評價臨床治療效果等各個方面[1-3]。然而,PCR技術(shù)主要由高溫變性(約95 ℃)、低溫退火(通常50~60 ℃)和適溫延伸(72 ℃)3個步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成。這給PCR儀的溫控系統(tǒng)帶來了一個難題,目前國內(nèi)常規(guī)PCR儀還難以達到快速升溫、快速降溫的要求,導(dǎo)致基因擴增速度沒有預(yù)計的時間快,一般需要5~6小時的反應(yīng)時間,且控制溫度的精確度較低,以至于擴增反應(yīng)體系易受檢測樣品中DNA、肝素、血紅蛋白、EDTA、脂質(zhì)等污染因子的影響,降低了檢測的穩(wěn)定性和結(jié)果的精確性。

自從PCR技術(shù)應(yīng)用以來,其他的核酸擴增技術(shù),尤其是眾多恒溫擴增技術(shù),已被陸續(xù)發(fā)明。恒溫擴增檢測技術(shù)的主要特點是擴增反應(yīng)的全過程均在單一溫度下進行,而不像常規(guī)PCR,需要經(jīng)歷幾十個溫度變化的循環(huán)過程,由此大幅縮短了檢測時間。其中像NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)、SDA(Strand Displacement Amplification)以及TMA(Transcription Mediated Amplification)等恒溫技術(shù)均已在特定的病原體檢測上得到相應(yīng)的應(yīng)用,并顯示出了良好的特性[4]。

本文提出了恒溫PCR雙通道熒光讀數(shù)儀的系統(tǒng)設(shè)計,其采用了實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(Simultaneous Amplification and Testing,SAT)[5]。SAT技術(shù)是國內(nèi)企業(yè)自主研發(fā)的專利技術(shù),其是基于TMA恒溫擴增技術(shù)發(fā)展起來的,相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù),其擴增產(chǎn)物是RNA,RNA容易降解,可大幅減少污染,降低了假陰性和假陽性的發(fā)生率;同時,SAT還具備恒溫擴增技術(shù)的優(yōu)點,并采用實時熒光檢測技術(shù),從而提高了檢測結(jié)果的精確度。本文拓展了SAT技術(shù)的檢測部分,自主設(shè)計了一套雙通道熒光檢測裝置,不僅可實時監(jiān)測基因擴增的情況,且通過雙通道的檢測,可有效指示假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn),滿足了更高的精度需要。因此,本文所設(shè)計的恒溫PCR雙通道熒光讀數(shù)儀的系統(tǒng),在真正意義上實現(xiàn)了快速檢測,并具有較高的穩(wěn)定性和精確性,在病原體檢測,血液病毒篩查,環(huán)境微生物檢測等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

1SAT核酸恒溫擴增原理

系統(tǒng)采用實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(Simultaneous Amplification and Testing,SAT),其是將新一代的核酸恒溫擴增技術(shù)和實時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。其檢測原理是在42 ℃恒定溫度下,首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個雙鏈DNA拷貝,然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(100～1 000個)RNA拷貝。此外,每個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進入下一個擴增循環(huán)。與此同時,帶有特定熒光標(biāo)記的熒光染料和這些RNA拷貝特異結(jié)合,產(chǎn)生對應(yīng)波長的熒光。最后由光電倍增管來實時捕獲熒光信號,實時反映擴增循環(huán)情況[6]。

表1　熒光染料的激發(fā)、發(fā)射波長

SAT技術(shù)的基因擴增效率較高,每一個循環(huán)可擴增100～1 000倍的模版,15～30 min即可將模板擴增109倍,比常規(guī)PCR法高出1 000倍。檢測靈敏度也遠(yuǎn)高于其他核酸檢測技術(shù),并可大幅降低假陰性和假陽性的發(fā)生幾率。在血液病毒篩查領(lǐng)域中,其靈敏度的優(yōu)勢顯得尤為重要,同為恒溫擴增技術(shù)的TMA技術(shù)在歐美已有良好的應(yīng)用證明[7-8]。

2光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計

系統(tǒng)設(shè)計了雙通道檢測光路進行同步檢測,分別采用470 nm藍光(FAM的激發(fā)波長)和525 nm綠光(HEX的激發(fā)波長)作為激發(fā)光源,具體光路如圖1所示。激發(fā)光由發(fā)光二極管產(chǎn)生,經(jīng)過470 nm 的濾光片濾光,再經(jīng)過多層介質(zhì)膜反射,最后對待測樣品進行照射;同時,經(jīng)過擴增反應(yīng)產(chǎn)生的熒光通過多層介質(zhì)膜透射,最后被光電倍增管探測。

注:1.LED光源;2、6、9.光瀾;3.470 nm濾光片;4.多層介質(zhì)膜(反470 nm透520 nm);5.三角棱鏡;7.待測物面;8.520 nm濾光片;10.接收器(520 nm)。圖1　FAM通道測試光路設(shè)計

雖然FAM通道和HEX通道的光路設(shè)計相同,但其在系統(tǒng)上發(fā)揮著各自不同的作用。FAM通道的作用是為了檢測樣品中是否存在目的基因,若存在目的基因則FAM通道檢測結(jié)果為陽性,否則為陰性。但由于采集的樣品在反應(yīng)過程中難免受到各種因素的影響,會檢測出假陰性結(jié)果,故該模塊添加了HEX通道。HEX通道的作用是對陰性樣品進行實時監(jiān)控,在PCR體系中加入擴增內(nèi)標(biāo),通過HEX通道檢測可有效指示假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn)[9-10]。當(dāng)FAM通道檢測的樣品為陰性時,若HEX通道的檢測結(jié)果為陽性,則說明此樣品是陰性;反之,該樣品被指示為假陰性,有可能被污染,需要重新提取樣品檢測。所以,HEX通道可有效指示假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn),確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3系統(tǒng)硬件和軟件設(shè)計

硬件部分以PIC32處理器作為主控芯片來控制光學(xué)模塊、溫度控制模塊、電機模塊和上位機4個模塊的運行,其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2　系統(tǒng)整體框圖

電機模塊采用了兩個TMC260驅(qū)動芯片,一個以x軸方向控制樣品孔位置,另一個以y軸方向控制光學(xué)模塊位置,從光學(xué)模塊發(fā)出兩個入射光,依次對48個樣品進行照射,一個循環(huán)大約需1 min。溫度控制模塊是本系統(tǒng)的重要部分,在該模塊中的樣品槽下面,放有一個48孔均勻的加熱板與之對應(yīng),在其上方,設(shè)計了一個樣品槽熱蓋,利用C8051單片機對加熱板和熱蓋進行溫度控制;同時,通過PT100來檢測48個樣品孔溫度,將其與設(shè)置的溫度做對比,利用P.I.D控制算法來達到精準(zhǔn)控溫的目的[11-12]。在光學(xué)模塊中,發(fā)射光光強大小是由發(fā)光二極管的電流大小決定的,通過調(diào)節(jié)電位器的阻值對電流進行控制,從而調(diào)節(jié)發(fā)射光光強大小。發(fā)射光的周期和頻率則通過調(diào)節(jié)PWM來控制;而發(fā)射出的熒光是通過光電倍增管進行探測,將探測到信號進行放大處理,最終傳送給控制芯片。

軟件設(shè)計包括人機交互模塊、測溫模塊、電機驅(qū)動模塊、光學(xué)模塊及控制器的程序設(shè)計等。整體控制流程圖,如圖3所示。

圖3　系統(tǒng)軟件流程圖

系統(tǒng)上電后,進行初始化,通過在觸摸屏上入相關(guān)參數(shù),主控板讀取相應(yīng)的控制指令,將讀取到的數(shù)值存儲至EEPROM,通過溫度采集模塊采集PT100上的電壓差從而計算出當(dāng)前溫度值,并根據(jù)PID控制信號調(diào)節(jié)PWM脈寬調(diào)制信號的輸出,最終將溫度和時間實時顯示在顯示屏上。當(dāng)溫度到達設(shè)定值時,樣品中的核酸片段開始進行特異性擴增,擴增片段與熒光染料結(jié)合。

擴增開始后主控板發(fā)出控制指令,驅(qū)動電機快速運轉(zhuǎn),帶動光學(xué)模塊到達規(guī)定的樣品組下方。光學(xué)模塊到達指定位置后,主控板發(fā)出指令,驅(qū)動光學(xué)模塊激發(fā)470 nm的藍光和523 nm的綠光,投射到樣品中,由樣品反射回525 nm和564 nm的熒光,由于有48組樣品同時進行檢測,因此電機驅(qū)動模塊和光學(xué)檢測模塊進入循環(huán)程序。

光學(xué)模塊將采集到的光譜輸入到主控板,經(jīng)主控板芯片處理,并通過串口通訊上傳至上位機。由高性能安卓操作系統(tǒng),利用實驗軟件實時繪制擴增曲線,并根據(jù)設(shè)置的閾值自動判斷測量結(jié)果為陰性或陽性。

4樣品檢測及結(jié)果分析

為驗證這種恒溫PCR雙通道熒光讀數(shù)儀是否達到了設(shè)計要求,設(shè)計了以下驗證實驗。

以6個陰性樣品與6個陽性樣品為例進行擴增檢測。首先向12個樣品中添加適量的FAM、HEX熒光染料和擴增內(nèi)標(biāo)物,然后將該樣品放入儀器的樣品槽中進行檢測(A5~F5號樣品槽放的是陰性樣品,A6~F6號樣品槽放的是陽性樣品),其中樣品槽分為8行6列共48孔,可同時檢測48個不同樣品。實驗時間設(shè)置為60 min,實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4　兩個通道檢測樣品的熒光擴增曲線圖

圖4(a)和圖4(b)為FAM通道檢測樣品的擴增曲線圖,圖4(c)為HEX通道檢測陰性樣品的擴增曲線圖,HEX通道是用來驗證FAM通道陰性樣品的檢測結(jié)果。實驗現(xiàn)象表明,所有擴增曲線基本在30 min后達到了擴增的平臺期,這說明該系統(tǒng)最快可在30 min內(nèi)檢測到結(jié)果。FAM通道陰性樣品的擴增曲線沒有擴增的跡象,而陽性樣品全部有明顯擴增,足以看出FAM通道已經(jīng)準(zhǔn)確檢測出樣品的陰陽特性。HEX通道陰性樣品擴增曲線如圖3所示,所有陰性樣品的擴增曲線有明顯擴增,說明這6個陰性樣品均有效,確保了陰性樣品檢測的準(zhǔn)確性。系統(tǒng)實驗最終結(jié)果為:A5~F5位置的6個樣品為陰性,A6~F6位置的6個樣品為陽性。

5結(jié)束語

設(shè)計的恒溫PCR雙通道熒光讀數(shù)儀以SAT恒溫技術(shù)為原理,理論上減少了假陰性和假陽性結(jié)果的發(fā)生機率;同時通過采用獨特的雙通道光學(xué)設(shè)計和溫控系統(tǒng),最快可在30 min內(nèi)完成整個檢測,有效指示檢測過程中出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象,提高系統(tǒng)的檢測準(zhǔn)確率。因此,本系統(tǒng)具有檢測速度快,穩(wěn)定性好、精確度高等優(yōu)點,在病原體檢測、血液病毒篩查、環(huán)境微生物檢測等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

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文章編號1007-7820(2016)03-110-04

doi:10.16180/j.cnki.issn1007-7820.2016.03.028

作者簡介:單秋霞(1990—),女,碩士研究生。研究方向:光學(xué)工程,生物電子。李建杰(1981—),男,博士,碩士生導(dǎo)師。研究方向:電磁場與微波技術(shù)。

基金項目:上海市高校青年教師培養(yǎng)資助計劃基金項目(ZZslg15015)

收稿日期:2015- 07- 21