汪佰莉， 吳煥童， 曹暢， 張淑萍， 覃筱燕

(1. 中央民族大學生命與環(huán)境科學學院，北京100081； 2. 中央民族大學北京市食品環(huán)境與健康工程技術研究中心，北京100081； 3. 中央民族大學醫(yī)院檢驗科，北京100081)

白樺脂酸對免疫性肝損傷小鼠細胞因子及Bcl-2、activated-Caspase-3表達的影響

汪佰莉1， 3#， 吳煥童1， 2#， 曹暢1， 2#， 張淑萍1， 2*， 覃筱燕1， 2*

(1. 中央民族大學生命與環(huán)境科學學院，北京100081； 2. 中央民族大學北京市食品環(huán)境與健康工程技術研究中心，北京100081； 3. 中央民族大學醫(yī)院檢驗科，北京100081)

目的 研究白樺脂酸(BA)對刀豆蛋白(Con A)誘導的急性免疫性肝損傷小鼠細胞因子及凋亡相關蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表達量的影響。方法 將60只雄性KM小鼠隨機分為6組，包括正常對照組，肝損傷模型組，聯(lián)苯雙酯(BIF)陽性對照組，BA高、中、低劑量組(H-BA、M-BA、L-BA組劑量分別為30 mg·kg-1、15 mg·kg-1、7.5 mg·kg-1)。BIF陽性對照組和BA高、中、低劑量組預防性給藥15 d后，尾靜脈注射20 mg·kg-1Con A構(gòu)建小鼠急性免疫性肝損傷模型。采用自動生化分析儀測定血清肝功能指標：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量；ELISA法測定血清炎性細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平；Western blot法檢測肝組織凋亡相關蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表達量的變化。結(jié)果 與正常對照組比較，肝損傷模型組血清ALT和AST含量明顯降低，IL-2、IL-4、IL-10和腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)水平明顯升高，Bcl-2表達量下降而activated-Caspase-3表達量升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；與肝損傷模型組比較，BA不同劑量組可顯著降低Con A所致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST含量，使小鼠血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平顯著降低，而IL-10水平顯著升高，尤其是H-BA組、M-BA組，同時使Bcl-2表達量升高、activated-Caspase-3表達量下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 BA對由Con A誘導的小鼠急性免疫性肝損傷具有拮抗作用。其機制可能與抗凋亡及降低炎性細胞因子水平和提高抗炎細胞因子水平、減輕T淋巴細胞毒性作用有關。

白樺脂酸；刀豆蛋白；急性免疫性肝損傷；細胞因子；Bcl-2；activated-Caspase-3

刀豆蛋白(concanavalin A，Con A)誘導的小鼠急性免疫性肝損傷是近年來新建立的且為通過T細胞毒性介導的肝損傷動物模型(Qinetal.，2010；Zhouetal.，2013；楊逸等，2015；鄭晨宏，謝曉華，2016)。該模型適合用于人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理機制和進行抗肝損傷的藥物篩選(Wahletal.，2009；Wangetal.，2012)。Con A與肝細胞漿膜有極強的親和性，注入體內(nèi)后大量聚集于肝臟，誘導大量免疫細胞向肝組織聚集并激活，通過其釋放多種炎性細胞因子引起炎癥反應，介導肝損傷過程，并進一步激活腫瘤壞死因子(TNF-a)，繼而通過細胞凋亡機制損害肝實質(zhì)細胞(Qinetal.，2010；Zhouetal.，2013；鄭晨宏，謝曉華，2016)。

近年來，已有不少關于植物活性成分防治肝損傷的研究開展，并取得了很好的研究進展。白樺脂酸(betulinic acid，BA)屬羽扇烷型三萜類化合物，在自然界中廣泛存在，眾多文獻闡述了BA在不同屬植物中的存在，但最豐富的自然資源是白樺樹，干燥的白樺樹外皮中含有約30%的白樺三萜類化合物(Schühlyetal.，1999)。BA具有廣泛的生物學及藥理學活性，如抗氧化、抗炎性和抗腫瘤活性(Cichewicz & Kouzi,2004；張琛琛等，2014；孫嘉等，2015)。本實驗研究采用Con A建立急性免疫性肝損傷動物模型，在前期的研究基礎(Qinetal.，2010；楊逸等，2015)上探討B(tài)A在急性免疫性肝損傷中的作用及對細胞因子和凋亡相關蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表達的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

60只雄性健康KM小鼠，體質(zhì)量18～22 g，清潔級，由中國軍事醫(yī)學科學院動物研究所繁育場提供，合格證號：SCXK-(軍)2007-004。于清潔級動物室飼養(yǎng)，自由飲食，室內(nèi)溫度20 ℃～25 ℃，相對濕度60%～80%，保持通風，定時換氣，每日光照/黑暗更替周期為12 h。

1.2 實驗藥物

BA購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，貨號：120327，純度>98%。

1.3 實驗試劑

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，貨號：C010-1、C009-1；聯(lián)苯雙酯(bifendate，BIF)為北京協(xié)和藥廠產(chǎn)品，批號：11090201；Con A為Sigma公司產(chǎn)品，貨號：C2272；腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)、IL-2、IL-4、IL-10試劑盒(北京達科為生物技術有限公司產(chǎn)品，貨號：DKW12-2720、DKW12-2000、DKW12-2020、DKW12-2027、DKW12-2055)。activated-Caspase-3抗體(rabbit，產(chǎn)品編號：C2312)、Bcl-2(N-19)抗體(rabbit，產(chǎn)品編號：L1311)，均為Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品；Actin抗體(mouse，貨號：A5316)，為Sigma產(chǎn)品；goat-anti-mouse IgG(產(chǎn)品編號：MD161)、goat-anti-rabbit IgG(產(chǎn)品編號：MD162)、goat-anti-rabbit IgG-HRP(產(chǎn)品編號：H1211)，均為Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品；組織裂解液、Tween-20等為上海碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品。無水乙醇：分析純，天津市大茂化學試劑廠，貨號：20120728；冰醋酸：分析純，北京化學試劑公司，貨號：10000292。

1.4 實驗儀器

7020型全自動生化分析儀(日本HITACHI公司)；冷凍高速離心機(德國Heraeus公司)；sunrise酶標儀(瑞士Tecan公司)；恒溫水浴鍋(北京長風儀器儀表廠)；DYY-TC型電泳儀(北京六一廠)；化學發(fā)光成像儀Tanon 4200(上海天能公司)。

2 方法

2.1 動物分組及處理

60只KM小鼠隨機分為6組，每組10只：正常對照組、肝損傷模型組、BIF陽性對照組(150 mg·kg-1)、BA高、中、低劑量組(H-BA、M-BA、L-BA組劑量分別為30 mg·kg-1、15 mg·kg-1、7.5 mg·kg-1)。正常對照組和肝損傷模型組給予藥品溶劑(0.1 mL·10 g-1)，每日1次。BIF陽性對照組給予BIF(0.15 mL·10 g-1)，每日1次。BA高、中、低劑量組分別給予相應劑量的藥物(0.1 mL·10 g-1)。15 d后，除正常對照組外，其余各組均尾靜脈注射20 mg·kg-1Con A，建立肝損傷模型，禁食不禁水12 h后，對全部小鼠進行摘眼球取全血處理，所取血液經(jīng)3 000 r·min-1離心10 min后，取血清用于實驗。外周血采集完畢后，暴露肝臟，快速取肝組織，分別保存于3 mL EP管中，用無菌生理鹽水反復洗滌，盡量將血細胞去除，-20 ℃暫存。實驗時取適當大小肝組織于1.5 mL EP管中，用電動組織研磨器在冰上用細胞裂解液(1∶9)分別將小鼠肝組織研磨，冰上裂解30 min后4 ℃，13 000 r·min-1離心25 min，取上清即為所需蛋白，可暫存于-20 ℃，用于Western blot實驗。

2.2 小鼠血清ALT、AST活性檢測

血清ALT、AST檢測采用國際臨床化學和實驗室醫(yī)學聯(lián)盟(IFCC)推薦法，按照試劑盒說明操作，使用酶標儀于波長505 nm處測定吸光度(A)值，根據(jù)制作的標準曲線計算出ALT及AST的含量。

2.3 小鼠血清TNF-α、IFN-γ含量測定

采用ELISA方法，測定時向TNF-α、IFN-γ單抗包被的96孔板中每孔加入標準品稀釋液或待檢樣本100 μL，并設空白對照和標準曲線孔。各試劑稀釋濃度和步驟按試劑盒操作說明進行。終止反應后，用酶標儀于450 nm處測定相應吸光度(A)值。繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線方程換算成TNF-α、IFN-γ含量。

2.4 Western blot法檢測肝組織Bcl-2、activated-Caspase-3表達量變化

Western blot法如前期工作文獻描述(Yangetal.，2014)。用BCA法測定蛋白濃度，對提取的肝組織總蛋白進行蛋白定量。將每個樣品的蛋白濃度調(diào)成一致，用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，5%的脫脂奶粉封閉30 min，一抗(1∶1 000)孵育過夜(4 ℃)，TBST洗3～5次，室溫下二抗(1∶1 000)孵育1 h，TBST洗3～5次，加化學發(fā)光液(A液與B液等體積混合)在化學發(fā)光成像儀Tanon 4200下檢測蛋白質(zhì)的表達量，拍照。結(jié)果以實驗組目的蛋白灰度值與對照組β-Actin灰度值的比值進行統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 BA對Con A所致免疫性肝損傷小鼠ALT、AST的影響

肝損傷模型組小鼠血清中ALT、AST活性較正常對照組明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明造模成功。給予藥物防治后，與肝損傷模型組比較，2種轉(zhuǎn)氨酶均有不同程度的降低，H-BA組、M-BA組和BIF陽性對照組的ALT、AST降低最為明顯(P<0.01)；L-BA組ALT、AST降低的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示BA能顯著降低Con A所致肝損傷小鼠ALT和AST活性(表1)。

表1 白樺脂酸對刀豆蛋白所致急性免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(n=10)Table 1 The impacts of betulinic acid on ALT and AST of concanavalin A-induced acute immune liver injury mice (n=10)

注： 與對照組相比，▲▲P<0.01； 與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01； 下表同。

Notes： compared with the normal group，▲▲P<0.01； compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01； the same below.

3.2 BA對免疫性肝損傷小鼠IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ的影響

肝損傷模型組小鼠血清中IL-2、IFN-r、IL-4、TNF-α、IL-10含量較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與肝損傷模型組比較，H-BA組和BIF陽性對照組IL-2、IFN-r、IL-4、TNF-α含量明顯降低(P<0.01)，M-BA組IL-2、IFN-r、IL-4、TNF-α含量降低(P<0.05或P<0.01)，L-BA組只有IL-2、TNF-α、IFN-r含量明顯降低(P<0.05)，而IL-4含量降低無統(tǒng)計學意義；與肝損傷模型組比較，各BA劑量組IL-10含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而BIF陽性對照組IL-10含量的差異無統(tǒng)計學意義(表2)。提示BA通過降低免疫細胞產(chǎn)生的炎性細胞因子和提高抗炎性細胞因子的作用，能減輕T淋巴細胞毒性對肝細胞的損傷。

表2 白樺脂酸對刀豆蛋白所致急性免疫性肝損傷小鼠IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ的影響(n=10)Table 2 The effects of betulinic acid on cytokines (IL-2， IL-4， IL-10， TNF-α， IFN-γ) of concanavalin A-induced acute immune liver injury mice (n=10)

3.3 BA對免疫性肝損傷小鼠肝組織中凋亡相關蛋白Bcl-2表達量的影響

造模后，同正常對照組相比，肝損傷模型組小鼠肝組織中Bcl-2的表達量明顯下降(P<0.001)，而給藥后，H-BA組、M-BA組、L-BA組與BIF陽性對照組較肝損傷模型組Bcl-2的表達量明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義或有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.001)(圖1)。說明免疫性肝損傷小鼠肝組織Bcl-2表達量明顯下降，而BA能上調(diào)Bcl-2的表達，促進肝細胞的存活。

3.4 BA對免疫性肝損傷小鼠肝組織中凋亡相關蛋白activated-Caspase-3表達量的影響。

造模后，與正常對照組相比，肝損傷模型組小鼠肝組織中activated-Caspase-3的表達量明顯上升(P<0.001)，而給藥后，H-BA組、M-BA組、L-BA組與BIF陽性對照組較肝損傷模型組activated-Caspase-3的表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.001)(圖2)。說明免疫性肝損傷小鼠肝組織activated-Caspase-3的表達量明顯上升，引起肝細胞凋亡，加速肝組織損傷，而BA能下調(diào)activated-Caspase-3的表達量，減少了肝細胞凋亡，促進肝組織的修復。

4 討論

許多研究表明，肝內(nèi)免疫反應是引起肝損傷的重要機制之一，在乙肝發(fā)病過程中引起肝細胞損傷和破壞的直接因素是T淋巴細胞介導的細胞毒性免疫反應(Qinetal.，2010；楊逸等，2015)。T淋巴細胞作為免疫效應細胞和免疫調(diào)節(jié)細胞，在機體的細胞免疫和體液免疫誘導中均有重要作用。

Con A誘導的小鼠免疫性肝損傷是通過T淋巴細胞介導的免疫性肝損傷動物模型(Wahletal.，2009；Qinetal.，2010；Zhouetal.，2013；楊逸等，2015)。Con A與肝細胞漿膜有極強的親和性，注入體內(nèi)后大量聚集在肝臟，小鼠體內(nèi)ALT和AST迅速升高，同時大量免疫細胞向肝臟聚集，激活T淋巴細胞及kupffer細胞等，通過釋放多種細胞因子引起炎癥反應參與肝損傷過程，并進一步激活釋放TNF-α，通過細胞凋亡機制加速肝細胞損害(Gongetal.，2010；Chenetal.，2012；Fullertonetal.，2013；Tsutsui &Nishiguchi，2014)。ALT和AST是肝細胞損傷的敏感指標(Qinetal.，2010；楊逸等，2015)。本研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)尾靜脈注射Con A 12 h后，血清中ALT、AST水平均明顯升高，而且TNF-α等細胞因子的血清含量亦明顯升高，與文獻報道一致(Qinetal.，2010；楊逸等，2015)，提示Con A誘導的免疫性肝損傷模型成功建立。本研究結(jié)果還顯示，與肝損傷模型組比較，H-BA、M-BA、L-BA組小鼠血清中ALT、AST明顯降低，提示BA對免疫性肝損傷具有明顯的保護作用。

圖1 Western blot檢測各組小鼠肝組織中Bcl-2的表達量Fig. 1 The expression of Bcl-2 in mice liver tissue as determined by Western blot

與正常對照組比較，***P<0.001； 與肝損傷模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，n=3； 下圖同。

Compared with the normal group，***P<0.001; compared with the model group，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，n=3； the same below.

圖2 Western blot檢測各組小鼠肝組織中activated-Caspase-3的表達量Fig. 2 The expression of activated-Caspase-3 in mice liver tissue as determined by western blot

研究表明，Con A造成的免疫性肝損傷小鼠模型中IFN-、TNF-α是引起急性肝損傷的重要炎癥細胞因子(Guilhoetal.，1996；Qinetal.，2010)。T淋巴細胞的激活在整個肝損傷發(fā)生過程中起了核心的調(diào)節(jié)作用。T淋巴細胞激活，可導致Th1細胞分泌的細胞因子IL-2、IL-6、IFN-及Th2細胞分泌的細胞因子IL-4、IL-10水平均顯著升高。IL-2、IL-4和IFN-等炎性細胞因子可以激活kupffer細胞誘導TNF-等其他炎癥因子的產(chǎn)生，擴大炎癥反應，引起持續(xù)的肝細胞損傷(Tiegsetal.，1992；Guilhoetal.，1996；Kakumuetal.，1997；Qinetal.，2010)。IL-10為巨噬細胞和T淋巴細胞在肝內(nèi)產(chǎn)生的強有力的抗炎性細胞因子，可以抑制Th1細胞因子(IL-2、IFN-等)的細胞免疫功能，對急性肝損傷具有保護作用(Mizuharaetal.，1996；Zhangetal.，2001)。本實驗結(jié)果看到，肝損傷時小鼠血清中炎性細胞因子IL-2、IFN-、IL-4、TNF-的含量顯著升高，而抗炎性因子IL-10的含量也有明顯升高，可能與肝臟損傷后機體自身可釋放一定量的抗炎性因子有關。而給予BA干預后，發(fā)現(xiàn)BA各劑量組可顯著下調(diào)肝損傷小鼠血清中已經(jīng)升高的IL-2、IFN-、IL-4、TNF-因子含量，同時升高抗炎性因子IL-10的含量，提示BA可以進一步促進抗炎性因子的釋放以對抗炎癥反應。

Con A造成的免疫性肝損傷中，肝細胞的死亡有肝細胞的凋亡和壞死，炎癥細胞因子可以通過死亡配體和受體的相互作用誘導肝細胞的凋亡(Gantneretal.，1995)。細胞凋亡的發(fā)生與抗凋亡蛋白因子如Bcl-2和蛋白激酶B等以及促凋亡蛋白因子如Caspase-3、細胞色素c和Bax等有密切的關系(Muoz-Pinedo，2012；Yangetal.，2014)。Caspase-3通過選擇性地切割某些物質(zhì)，從而造成細胞凋亡。activated-Caspase-3是幾乎所有細胞凋亡的最后執(zhí)行者(Munoz-Pinedo，2012；Yangetal.，2014)。本實驗結(jié)果顯示，Con A造模后，小鼠肝組織中Bcl-2表達下降，activated-Caspase-3表達量明顯升高，說明肝細胞啟動了凋亡機制，引起肝損傷，藥物干預后，Bcl-2表達量上升，activated-Caspase-3表達量明顯下調(diào)，說明BA通過上調(diào)抗凋亡蛋白的表達抑制肝細胞凋亡，進而促進肝組織的修復，減少肝損傷。

綜上所述，BA對Con A誘導的小鼠急性免疫性肝損傷具有拮抗作用。BA通過減少免疫細胞炎性細胞因子同時提高抗炎性細胞因子的釋放，以及上調(diào)Bcl-2和下調(diào)activated-Caspase-3的抗凋亡機制而發(fā)揮拮抗肝損傷的作用。

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The Effects of Betulinic Acid on the Expression of Cytokines and Apoptosis-related Proteins in Immune Liver Injury Induced by Concanavalin A

WANG Baili1， 3#， WU Huantong1， 2#， CAO Chang1， 2#， ZHANG Shuping1， 2*， QIN Xiaoyan1， 2*

(1. College of Life & Environmental Science， Minzu University of China， Beijing 100081， China；2. Beijing Engineering Research Center of Food Environment and Health， Minzu University of China， Beijing 100081， China；3. The School Hospital Clinical Laboratory， Minzu University of China， Beijing 100081， China)

Objective To study the effects of betulinic acid (BA) on the expression of cytokines and apoptosis-related proteins in acute immune liver injury induced by concanavalin A (Con A). Methods A total of 60 male KM mice were divided into six groups randomly， including control group， Con A model group， bifendate (BIF) group and three BA groups with gradient concentrations. Saline diluted BA (30 mg·kg-1， 15 mg·kg-1， 7.5 mg·kg-1) was given orally to mice. After 15 days’ BA pretreatment， mice were then injected with Con A (20 mg·kg-1) to establish the mouse model with acute immune liver injury. Automatic biochemical analyzer was conducted to determine serum liver function indices such as plasma alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST)； ELISA was used to determine the levels of serum inflammatory cytokines (IL-2， IL-4， IL-10， TNF-α， IFN-γ)； Western blot was used to detect the expression of liver tissue apoptosis related proteins (Bcl-2 and activated-Caspase-3). Results Compared with the control group， Con A treated mice showed significantly lower serum ALT and AST levels， while the levels of inflammatory cytokines (IL-2， IL-4， IL-10， TNF-α， IFN-γ) increased significantly. The expression of Bcl-2 was significantly decreased (P<0.05)， whereas the expression of activated-Caspase-3 was significantly increased (P<0.01). Compared with the Con A model group， the mice that treated with different doses of BA， especially the middle and high dose groups， showed significantly reduced serum ALT and AST levels， as well as significantly decreased serum IL-2， IL-4， TNF-α and IFN-γ levels but increased IL-10. The apoptosis related proteins Bcl-2 and activated-Caspase-3 also showed contrary expression changes： the former increased while the latter decreased. Conclusion These findings suggested that BA had antagonistic action on the mouse with acute immune liver injury induced by Con A to some extent， and the mechanism of this process may be related with the anti-apoptosis and anti-inflammatory functions of BA to reduce the toxic effects of T lymphocytes.

betulinic acid； concanavalin A； acute immune liver injury； cytokines； Bcl-2； activated-Caspase-3

2016-04-18 接受日期：2016-06-14

國家自然科學基金項目(31372225)； 中央民族大學學科建設項目(YLDX01013)； 社會醫(yī)學學術團隊建設項目(2015MDTD13C)； 高等學校學科創(chuàng)新引智計劃(B08044)

汪佰莉(1979—), E-mail:13811636247@163.com; 吳煥童(1992—), E-mail:13810472177@163.com; 曹暢(1991—), E-mail:caochang511@163.com#共同第一作者

*通信作者Corresponding author, E-mail:bjqinxiaoyan@muc.edu.cn; zhangshuping@muc.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160091

Q78

A

1000-7083(2016)04-0511-06