羅宗志，林潔榮，2＊，羅虹建，林志魁，陳碧成

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州350000；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州350000；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350000；4.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350000）

雜交狼尾草和桂牧1號(hào)雜交象草的核型分析

羅宗志1，林潔榮1，2＊，羅虹建2，3，林志魁4，陳碧成1

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州350000；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州350000；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350000；4.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350000）

為狼尾草屬種質(zhì)資源的多樣性保護(hù)、利用及遺傳育種研究提供理論依據(jù)，采用常規(guī)壓片法對(duì)雜交狼尾草和桂牧1號(hào)雜交象草的染色體數(shù)目及核型進(jìn)行分析。結(jié)果表明：2種牧草的染色體基數(shù)為x＝7，均為3倍體，染色體數(shù)目為2n＝21條。雜交狼尾草的核型公式2n＝3x＝21＝18m（6SAT）＋3sm，染色體相對(duì)長度組成I.R.L＝6S＋3M1＋6M2＋6L，第1組和第5組染色體含有隨體；桂牧1號(hào)雜交象草核型公式2n＝3x＝21＝3m＋18sm，染色體相對(duì)長組成I.R.L＝6S＋6M1＋3M2＋6L，未發(fā)現(xiàn)隨體。雜交狼尾草和桂牧1號(hào)雜交象草核型不對(duì)稱系數(shù)分別為60.79%和65.06%，分別屬于1B型和2B型，桂牧1號(hào)雜交象草的進(jìn)化程度高于雜交狼尾草。

雜交狼尾草；桂牧1號(hào)雜交象草；牧草；染色體；核型

雜交狼尾草（P.americanum×P.purpureum）隸屬禾本科狼尾草屬，為多年生草本植物，由美洲狼尾草和象草雜交而成，雜種優(yōu)勢明顯，具有產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)、耐刈割和適口性好等優(yōu)點(diǎn)，近年來作為優(yōu)質(zhì)牧草被廣泛種植［1-2］。桂牧1號(hào)雜交象草〔（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu No.1〕隸屬禾本科狼尾草屬，為多年生牧草新品種，由矮象草和雜交狼尾草雜交而成，具有生物產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、抗逆性強(qiáng)和適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，近年來在畜牧生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用［3-4］。到目前為止，國內(nèi)外科研工作者對(duì)雜交狼尾草的研究主要集中在外植體愈傷組織的誘導(dǎo)、堿預(yù)處理、栽培技術(shù)、青貯飼料和RAPD分析等方面［5-8］，對(duì)桂牧1號(hào)雜交象草的研究主要集中在栽培技術(shù)、植物特征分析和飼喂動(dòng)物等方面［9-10］，但對(duì)細(xì)胞核型方面的研究鮮見報(bào)道。

染色體是基因的攜帶者，遺傳物質(zhì)的載體［11］。研究染色體數(shù)目與核型對(duì)植物系統(tǒng)演化、物種之間親緣關(guān)系及遺傳工程中染色體鑒別具有重要意義［12］。目前，狼尾草屬一些牧草核型方面的研究已有報(bào)道，如朱丹丹等［13］研究了象草和巨菌草的核型及親緣關(guān)系；周自瑋等［14］對(duì)云南德宏地區(qū)的逸生狼尾草進(jìn)行了分類學(xué)鑒定；張倫等［15］對(duì)長序狼尾草的核型進(jìn)行了分析研究。但目前未見關(guān)于雜交狼尾草和桂牧1號(hào)雜交象草的核型參數(shù)信息。為此，筆者以雜交狼尾草和桂牧1號(hào)雜交象草為試驗(yàn)材料，采用常規(guī)壓片法對(duì)其染色體數(shù)目及核型進(jìn)行分析，以期為狼尾草屬種質(zhì)資源的多樣性保護(hù)、利用及遺傳育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交狼尾草來源于江蘇農(nóng)科院土壤肥料研究所；桂牧1號(hào)雜交象草來源于廣西畜牧研究所。2種牧草均采集于福建省福州市福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源圃（26°10′55.62″N、119°23′21.24″E，海拔10m）。選取不同植株且長勢良好，生長100d以上的雜交狼尾草和桂牧1號(hào)雜交象草莖稈，按2節(jié)切成一段，插入帶有細(xì)沙的塑料桶中，水以淹沒幼芽1cm為宜，將塑料桶擺放在塑料大棚內(nèi)，每天換水1次，常溫下培養(yǎng)生根。待根尖長至2～3cm時(shí)，于8：00～9：00截取不同莖稈上生長旺盛、潔白幼嫩的根尖1cm作為試驗(yàn)材料。

1.2 染色體制片

1）預(yù)處理。將根尖放入冰水混合物離體處理，然后置于0.05%秋水仙素溶液中室溫處理2h。2）固定。用蒸餾水沖洗后將根尖放入4℃卡諾氏液（V無水乙醇∶V冰乙酸＝3∶1）中固定24h。3）解離。將根尖洗凈后放入60℃恒溫水浴鍋中酸解10min，用蒸餾水沖洗酸液10min后轉(zhuǎn)入2%纖維素酶水溶液中室溫下酶解1h。4）再固定。將根尖洗凈后重新用卡諾氏液固定30min。5）染色。用蒸餾水沖洗酸液后轉(zhuǎn)入卡寶品紅染液室溫下染色1～2h。6）制片。取根尖置于載玻片上，用鑷子和剪刀切取根尖1mm，加1滴45%乙酸溶液，用鑷子將根尖充分壓碎，并使其均勻分散，加蓋玻片，用帶有橡皮擦的鉛筆輕輕敲打，并用食指壓緊，用濾紙吸取多余的乙酸溶液。

1.3 染色體觀察

將根尖細(xì)胞裝片置于尼康NI-U熒光顯微鏡載物臺(tái)上，在100倍低倍鏡下找到染色體視野后用1000倍油鏡繼續(xù)觀察，選擇分散良好、輪廓清晰、數(shù)目較全的染色體中期相進(jìn)行拍照。

1.4 核型分析

根據(jù)首屆全國植物染色體學(xué)術(shù)研討會(huì)約定的標(biāo)準(zhǔn)［16］，每個(gè)品種選擇30個(gè)以上分裂中期細(xì)胞，以85%以上細(xì)胞具有相同的染色體數(shù)作為該品種的染色體數(shù)目，并選擇5個(gè)圖像清晰且分散良好的中期分裂相進(jìn)行核型分析。首先利用核型分析軟件Karyo 3.1處理染色體圖片，然后進(jìn)行染色體編號(hào)、確定著絲粒位置并測量其長臂、短臂值。根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行同源染色體配對(duì)組合并繪制核型圖，采用Excel 2010繪制核型模式圖，按臂長由長到短的順序進(jìn)行編號(hào)，最后取5個(gè)細(xì)胞的平均值作為核型參數(shù)。核型分析按照文獻(xiàn)［17］的方法，染色體相對(duì)長度組成參照文獻(xiàn)［18］的分類標(biāo)準(zhǔn)，染色體排序參照文獻(xiàn)［19］的命名系統(tǒng)，核型分類參照文獻(xiàn)［20］的分類標(biāo)準(zhǔn)，核型不對(duì)稱性系數(shù)參照文獻(xiàn)［21］的方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種狼尾草屬牧草的染色體數(shù)目

2.1.1 雜交狼尾草 經(jīng)觀察計(jì)數(shù)，分散良好、輪廓清晰的雜交狼尾草細(xì)胞染色體數(shù)目為20條、21條、22條的分別有2個(gè)、27個(gè)和1個(gè)細(xì)胞，分別占計(jì)數(shù)總數(shù)的6.67%、90.00%和3.33%。染色體數(shù)目為2n＝21條，染色體基數(shù)x＝7（圖1），為3倍體。

2.1.2 桂牧1號(hào)雜交象草 經(jīng)觀察計(jì)數(shù)，分散良好、輪廓清晰的桂牧1號(hào)雜交象草細(xì)胞染色體數(shù)目為20條、21條、22條的分別有1個(gè)、27個(gè)和2個(gè)細(xì)胞，分別占計(jì)數(shù)總數(shù)的3.33%、90.00%和6.67%。染色體數(shù)目為2n＝21條，染色體基數(shù)x＝7（圖2），為3倍體。

圖1 雜交狼尾草染色體的中期相（左）和核型（右）Fig.1 Metaphase chromosomes（left）and karyotype（right）ofP.americanum×P.Purpureum

圖2 桂牧1號(hào)雜交象草染色體的中期相（左）和核型（右）Fig.2 Metaphase chromosomes（left）and karyotype（right）of（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu 1

2.2 2種狼尾草屬牧草染色體的核型

2.2.1 雜交狼尾草 從表1、表2可知，雜交狼尾草染色體核型公式為2n＝3x＝21＝18m（6SAT）＋3sm，由此看出，體細(xì)胞中期染色體由18條中部染色體和3條近中部染色體組成，其中第1組和第5組染色體含有隨體（圖3）。從染色體相對(duì)長度組成I.R.L＝6S＋3M1＋6M2＋6L看，雜交狼尾草由短染色體、中短染色體、中長染色體和長染色體組成，7組染色體相對(duì)長度介于5.95%～23.80%，相對(duì)長度指數(shù)介于0.42～1.67，最長染色體與最短染色體長度比為4.00，臂比范圍在1.43～1.80，無臂比值大于2的染色體。核型不對(duì)稱系數(shù)As.K＝60.79%，按照核型分類標(biāo)準(zhǔn)，雜交狼尾草核型屬于1B型。

表1 2種狼尾草屬牧草的染色體核型參數(shù)Table 1 Karyotype parameters of two Pennisetum varieties

表2 2種狼尾草屬牧草的染色體核型特征Table 2 Karyotype characteristics of two Pennisetum varieties

圖3 雜交狼尾草（左）、桂牧1號(hào)雜交象草（右）染色體的核型模式Fig.3 The karyotype ideogram ofP.americanum×P.purpureum（left）and（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu 1（right）

2.2.2 桂牧1號(hào)雜交象草 從表1、表2可知，桂牧1號(hào)雜交象草染色體的核型公式為2n＝3x＝21＝3m＋18sm，由此看出，體細(xì)胞中期染色體由3條中部染色體和18條近中部染色體組成，未發(fā)現(xiàn)隨體（圖3）。從染色體相對(duì)長度組成I.R.L＝6S＋6M1＋3M2＋6L看，桂牧1號(hào)雜交象草由短染色體、中短染色體、中長染色體和長染色體組成，7組染色體相對(duì)長度介于7.29%～23.24%，相對(duì)長度指數(shù)介于0.51～1.63，最長染色體與最短染色體長度比為3.19，臂比介于1.68～2.14，臂比值大于2的染色體比例為28.57%。核型不對(duì)稱系數(shù)As.K＝65.06%，按照核型分類標(biāo)準(zhǔn)，桂牧1號(hào)雜交象草核型屬于2B型。

3 結(jié)論與討論

染色體數(shù)目是最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一，染色體核型可以揭示生物在系統(tǒng)演化中的位置，也是判斷生物與其相近物種間親緣關(guān)系的重要依據(jù)［22］。研究結(jié)果表明，雜交狼尾草、桂牧1號(hào)雜交象草染色體數(shù)為21條，比例均超過85%，確定其染色體數(shù)為2n＝21條。根尖細(xì)胞中偶爾存在附加1～2條額外的染色體，也有部分缺失的染色體，可能跟染色體變異有關(guān)。陳志彤等［23］研究表明，狼尾草屬植物染色體基數(shù)分為兩大類：一類基數(shù)為x＝7，如美洲狼尾草2n＝2x＝14，象草2n＝4x＝28，逸生狼尾草2n＝4x＝28等；另一類基數(shù)為x＝9，如中亞白草2n＝4x＝36，東非狼尾草2n＝4x＝36，中序狼尾草2n＝4x＝36等。由此推斷，雜交狼尾草和桂牧1號(hào)雜交象草染色體基數(shù)均歸為第一類，即染色體基數(shù)x＝7，為3倍體，染色體數(shù)目為2n＝21條，雜交狼尾草的染色體數(shù)和倍性均與陳禮偉等［24］的研究結(jié)果一致，桂牧1號(hào)雜交象草的染色體數(shù)和倍性均為首次報(bào)道。雜交狼尾草與桂牧1號(hào)雜交象草染色體數(shù)目和倍性均相同，說明其親緣關(guān)系較近，同時(shí)也印證其來源相似，都是通過雜交選育而成，雜交狼尾草由4倍體象草和2倍體美洲狼尾草雜交選育而成，桂牧1號(hào)雜交象草由矮象草和3倍體雜交狼尾草雜交選育而成。

雜交狼尾草的核型不對(duì)稱系數(shù)為60.79%，由18條中部染色體（m）和3條近中部染色體（sm）組成，核型類型屬于1B型；桂牧1號(hào)雜交象草的核型不對(duì)稱系數(shù)為65.06%，由3條中部染色體（m）和18條近中部染色體（sm）組成，核型類型屬于2B型。根據(jù)核型分類標(biāo)準(zhǔn)［25］，核型對(duì)稱性與物種進(jìn)化相輔相成，核型對(duì)稱性越低的生物染色體變異越大，物種進(jìn)化程度越高；核型對(duì)稱性越高的生物染色體變異越小，進(jìn)化程度越低。因此，不論從核型不對(duì)稱系數(shù)還是核型類型看，雜交狼尾草和桂牧1號(hào)雜交象草在進(jìn)化上都屬于比較原始的類型，與張懷山［26］對(duì)中型狼尾草的研究結(jié)果一致；但桂牧1號(hào)雜交象草的進(jìn)化程度比雜交狼尾草高，由于桂牧1號(hào)雜交象草由雜交狼尾草和矮象草雜交選育而成，這與雜交可以加速物種進(jìn)化程度的規(guī)律相符［27］。雜交狼尾草第1組和第5組染色體的短臂上均發(fā)現(xiàn)了隨體，此結(jié)果鮮有報(bào)道。

目前，從國外引進(jìn)的狼尾草屬牧草較多，命名比較混亂，常出現(xiàn)同物異名、同名異物的現(xiàn)象，給育種工作帶來了較大困難，嚴(yán)重阻礙狼尾草屬牧草的應(yīng)用推廣和可持續(xù)發(fā)展。核型分析為研究生物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和物種分化提供了重要依據(jù)［28］，同時(shí)應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)等研究方法，為鑒定狼尾草屬牧草種質(zhì)資源、遺傳育種、系統(tǒng)演化等提供可靠的理論依據(jù)。

［1］黃勤樓，黃秀聲，黃水珍，等.雜交狼尾草青貯飼喂肉豬效果研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（5）：134-140.

［2］范希峰，侯新村，朱 毅，等.雜交狼尾草作為能源植物的產(chǎn)量和品質(zhì)特性［J］.中國草地學(xué)報(bào)，2012，34（1）：48-51.

［3］梁志霞，杜 虎，彭晚霞，等.氮肥、刈割強(qiáng)度對(duì)桂牧1號(hào)雜交象草光合特性的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（4）：319-326.

［4］梁志霞，宋同清，曾馥平，等.氮素和刈割對(duì)桂牧1號(hào)雜交象草光合作用、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2013，32（8）：2008-2014.

［5］臧文靜，陳 瑩，李 青，等.雜交狼尾草不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)［J］.草業(yè)科學(xué)，2015，32（9）：1451-1456.

［6］邱雁斌，秦向東，趙 艷，等.雜交狼尾草堿預(yù)處理研究［J］.云南化工，2016，43（1）：11-14.

［7］田立雙，李鳳山，楊恒山，等.密度對(duì)雜交狼尾草產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2006，23（4）：50-52.

［8］陳 平，朱 鈞，劉 萍，等.雜交狼尾草新品系遺傳關(guān)系的RAPD分析［J］.中國草地學(xué)報(bào)，2007，29（3）：34-38.

［9］閆景彩，陳金龍.氮磷鉀配施對(duì)田周地種植桂牧1號(hào)雜交象草產(chǎn)量及效益的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2009，26（12）：98-102.

［10］滕少花，梁英彩，藍(lán)建寧，等.桂牧1號(hào)雜交象草對(duì)乳牛產(chǎn)奶量的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2004，21（10）：47-48.

［11］劉冬云，張曉曼，李 艷，等.不同居群山丹的核型分析［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2015，16（1）：199-204.

［12］時(shí)麗冉，高汝勇，李會(huì)芬，等.紫茉莉染色體數(shù)目及核型分析［J］.草業(yè)科學(xué)，2010，27（1）：52-55.

［13］朱丹丹，王培丹，林興生，等.象草和巨菌草的核型分析［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（5）：14-18.

［14］周自瑋，袁福錦，匡崇義，等.云南德宏地區(qū)逸生狼尾草的綜合鑒定［J］.中國草地學(xué)報(bào)，2008，30（3）：110-114.

［15］張 倫，康 念.長序狼尾草的核型分析［J］.貴州科學(xué)，1992，10（2）：44-47.

［16］張 凡，張 芹，龍雙紅.波斯菊核型分析［J］.草業(yè)科學(xué)，2012，29（11）：1715-1717.

［17］李懋學(xué)，陳瑞陽.關(guān)于核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問題［J］.武漢植物學(xué)研究，1985，3（4）：297-302.

［18］KUO S R，WANG T T，HANG T C.Karyotype anal-ysis of someFormosangymnosperms［J］.Taiwania，1972，17（1）：66-80.

［19］LEVAN A，F(xiàn)REDGA K，SANDBERG A A.Nomenclature for centrometic position on chromosomes［J］.Hereditas，1964（52）：197-201.

［20］STEBBINS G L.Chromosomal Evolution in Higher Plants［M］.London：Edward Arnold Ltd，1971：85-104.

［21］ARANO H.Cytological studies in subfamily Carduoideae（Compositae）of Japan，IX.The karyo type analysis and phylogentic considerations onPertyaandAinsliaca（2）［J］.Bot Mag Tokyo，1963，76（5）：32-39.

［22］張 蕾，王家保，陳業(yè)淵，等.人心果和蛋黃果染色體核型分析［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，12（3）：486-488.

［23］陳志彤，何水林，黃毅斌.狼尾草屬牧草研究進(jìn)展［J］.草地學(xué)報(bào)，2010，18（5）：740-748.

［24］陳禮偉，楊運(yùn)生.美洲狼尾草和象草種間雜種的細(xì)胞學(xué)觀察［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1990（2）：33-38.

［25］劉 鵬，王彥榮，劉志鵬.野豌豆屬43份牧草種質(zhì)的染色體形態(tài)觀察與分析［J］.草業(yè)科學(xué)，2015，32（6）：908-926.

［26］張懷山.中型狼尾草種質(zhì)特性及遺傳多樣性研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，2014.

［27］鄭 偉，高大海，王留陽.植物的雜交起源及研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（22）：10378-10381.

［28］WU G L.The application of karyotype analysis on cytotaxonmy［J］.Journal of Biology，2006，23（1）：39-42.

（責(zé)任編輯：馮 衛(wèi)）

Karyotype Analysis ofPennisetumamericanum×Pennisetumpurpureumand（Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum）×Pennisetumpurpureumschum.cv.Guimu 1

LUO Zongzhi1，LIN Jierong1，2＊，LUO Hongjian2，3，LIN Zhikui4，CHEN Bicheng1
（1.CollegeofAnimalScience，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350000；2.China NationalEngineeringResearchCenterofJUNCAOTechnology，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350000；3.CollegeofFood Science，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350000；4.CollegeofLifeScience，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350000，China）

The chromosome number and karyotype ofP.americanum×P.purpureumand（P.americanum×P.purpureum）×P.purpureumschum.cv.Guimu 1was analyzed by the root tip squash method to provide the theoretical basis for diversity protection，utilization and genetic breeding ofPennisetumgermplasm resources.Results：The basic chromosome number，ploidy and chromosome number ofP.americanum×P.purpureumand（P.americanum×P.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1both are 7，triploid and 21respectively.The karyotype formulas and relative chromosome length ofP.americanum×P.purpureumare 2n＝3x＝21＝18m（6SAT）＋3sm and 6S＋3M1＋6M2＋6Lseparately and there is a trabant on the chromosome of Group 1and Group 5.The karyotype formulas and relative chromosome length of（P.americanumP.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1are 2n＝3x＝21＝3m＋18sm and 6S＋6M1＋3M2＋6Lrespectively and there is no a trabant on their chromosomes.The karyotype asymmetrical coefficient and karyotype ofP.americanum×P.purpureumand（P.americanumP.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1is 60.79%and 1B type，and 65.06%and 2Btype separately.The evolution degree of（P.americanumP.purpureum）P.purpureumschum.cv.Guimu 1is higher thanP.americanum×P.purpureum

Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum；（Pennisetumamericanum×Pennisetumpurpureum）×Pennisetumpurpureumschum.cv.Guimu 1；forage grass；chromosome；karyotype

S334

A

2016-05-13；2016-07-22修回

國家林業(yè)局公益性行業(yè)專項(xiàng)“渾善達(dá)克沙地疏林型植被建設(shè)技術(shù)研究”（201504412）；福建省科技重大專項(xiàng)“菌草食藥用菌產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（2014NZ002-1）；國家菌草工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目“菌草生物學(xué)特性及優(yōu)良品種評(píng)價(jià)體系研究”（JCGG14020）

羅宗志（1989-），男，在讀碩士，研究方向：草業(yè)科學(xué)。E-mail：1183525491＠qq.com

＊通訊作者：林潔榮（1958-），男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，從事草業(yè)科學(xué)研究。E-mail：fafumcs＠163.com

1001-3601（2016）09-0370-0008-05