彭 雷，趙 艷，馬銀花

（1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550001；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430072）

褐飛虱看家基因啟動子克隆與序列分析

彭 雷1，趙 艷2，馬銀花2

（1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550001；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430072）

為獲得組成型表達啟動子，以褐飛虱的看家基因肌動蛋白（Acting1）與甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）為研究對象，以Genbank上褐飛虱Actin1mRNA序列設(shè)計嵌套引物，通過灰飛虱GAPDHmRNA序列搜尋褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫中的同源序列設(shè)計嵌套引物，并以設(shè)計的嵌套引物通過Tail-PCR技術(shù)對褐飛虱Actin 1與GAPDH基因ATG前側(cè)翼序列進行擴增。結(jié)果表明：通過染色體步移的Tail-PCR技術(shù)獲得Actin1與GAPDH基因ATG前側(cè)翼序列，長度分別為2 878bp和1 196bp。BDGP數(shù)據(jù)庫與PLACE軟件在線分析獲得核心啟動子序列及TATA框、CAAT框和GATA框元件。

褐飛虱；Actin1；GAPDH；啟動子；Tail-PCR

在基因工程研究中，高效啟動子能啟動外源基因高水平表達，但要在某物種中達到組成型表達目的基因常需要此物種的看家基因啟動子。肌動蛋白β-actin和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）啟動子是常用的看家基因啟動子。啟動子克隆一般通過染色體步移技術(shù)，染色體步移技術(shù)主要基于2種方法，一種是基于基因組文庫為主要手段的染色體步移技術(shù)，一種是基于PCR技術(shù)的染色體步移技術(shù)?；赑CR技術(shù)的染色體步移主要又分為連接成環(huán)PCR、外源接頭介導(dǎo)PCR和半隨機引物PCR［1］。熱不對稱交錯PCR（Tail-PCR）是基于半隨機引物的PCR方法。Tail-PCR方法最先由Liu和Whittier提出［2］，該技術(shù)具有簡單快速、高效特異并能對產(chǎn)物直接測序等優(yōu)點，目前已廣泛運用于啟動子克隆、鑒定轉(zhuǎn)基因中T-DNA插入位點、獲得新物種基因非保守區(qū)域等研究領(lǐng)域。褐飛虱（NilaparvatalugensSt?l，BPH）是對水稻危害最大的害蟲之一，在亞洲褐飛虱每年造成水稻減產(chǎn)［3］，對褐飛虱研究越來越受到昆蟲學(xué)、植保學(xué)和生態(tài)學(xué)家的重視。但目前對褐飛虱的研究中，高效組成型表達啟動子分離的相關(guān)研究尚無報道。筆者利用NCBI上褐飛虱Actin1和灰飛虱（Laodelphaxstriatella）GAPDH基因mRNA全長序列設(shè)計嵌套引物，并通過Tail-PCR技術(shù)獲得褐飛虱看家基因肌動蛋白與甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的ATG前端啟動子區(qū)序列，以期分離到褐飛虱具有高效性啟動基因表達能力的組成型表達啟動子，為外源基因在褐飛虱細胞內(nèi)高效表達乃至褐飛虱轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試褐飛虱飼養(yǎng)在溫室，飼養(yǎng)條件為22～28℃，保持合適的光照濕度條件（光照15h/d），以保證水稻和褐飛虱在良好環(huán)境下生長。Top 10感受態(tài)細胞為實驗室保存，PMD18-T載體與Genome walking（染色體步移技術(shù)）試劑盒購自大連保生物公司（Takara），PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購自O(shè)mega。其他試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

表1 不同引物的信息Table 1 Information of different primers

1.2 褐飛虱基因組DNA提取

褐飛虱基因組DNA提取皆為單頭蟲提取。參照文獻［4-5］的CTAB法，略有改動。將采集的單頭褐飛虱放入裝有400μL%的CTAB（1.5mL的離心管中，用勻漿小棒搗碎勻漿）；將勻漿液放入60℃水浴鍋水浴60min裂解；裂解完畢后的勻漿液中加入200μL氯仿/異戊醇（24∶1）抽提2次；加入2倍體積無水乙醇-20℃沉淀；最后DNA風(fēng)干后溶于50μL TE溶解-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 擴增引物

從genbank上登錄的褐飛虱Actin1mRNA序列設(shè)計了3條特異引物，第2次Tail-PCR的3條特異引物以第1次Tail-PCR測序后的序列為基礎(chǔ)設(shè)計；通過灰飛虱的mRNA序列并結(jié)合褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫序列設(shè)計3條特異引物（表1）；簡并引物為試劑盒的AP2、AP3和AP4引物。

1.4 Tail-PCR擴增

3輪反應(yīng)總體系50μL，包括1μL模板；2.5mmol/L dNTPs 8μL；10×LA PCR Buffer II（Mg2＋plus）5μL；LA Taq（5U/μL）0.5μL；AP與特異引物（100pmol/μL）各1μL；加ddH2O至50μL。以Actin1第1次Tail-PCR為例，試劑盒的AP2、AP3、AP4引物分別首先與A1W1-1引物進行第1輪擴增，擴增產(chǎn)物為模板，再加入各自對應(yīng)AP簡并引物和A1W1-2引物進行第2輪擴增，同理以A1W1-3引物和AP引物進行第3輪擴增，第3輪擴增完畢后電泳選取擴增帶型效果好的組合。PCR反應(yīng)條件參照Genome Walking試劑盒說明書。

1.5 PCR產(chǎn)物測序與序列分析

將擴增產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒回收后，直接連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆測序。序列先在genbank blatsn進行比對，確定是否為目的序列。通過BDGP（Berkeley drosophilae genome project）數(shù)據(jù)庫（http：//www.fruitfly.org/seq＿tools/promoter.html）中Neural Network Promoter Prediction軟件預(yù)測啟動子序列。PLACE在線啟動子預(yù)測工具分析啟動子功能元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tail-PCR的擴增片段

對于Actin 1基因，3條特異引物分別于試劑盒（AP2、AP3、AP4簡并引物組合）擴增，AP2組合能擴增到1條約1.1kb的片段（圖1a），連接PMD18-T測序后和genbank的Actin1基因及褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫blast比對后證實為褐飛虱Actin1基因ATG前端序列。根據(jù)測序結(jié)果，又設(shè)計3條特異性引物繼續(xù)向前walking，Tail-PCR后獲得約2kb片段（圖1b），測序后將其與前面測序結(jié)果拼接獲得ATG前端總共2 878bp長度的序列。對于GAPDH，3條特異引物和AP3組合，擴增到約1.2kb片段（圖1c），測序后比對確定為GAPDHATG前端序列。

圖1 TAIL-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of Tail-PCR products

2.2 啟動子序列

將得到的Actin1ATG上游序列通過BDGP數(shù)據(jù)庫與PLACE軟件在線分析，BDGP數(shù)據(jù)庫分析獲得2條核心啟動子序列（圖2），2個核心序列離ATG距離分別為4 3 6bp和3 6 3bp。PLACE軟件在線分析預(yù)測TATA框、GAAT框和CAAT框等啟動子核心原件（圖2），其中TATA框距離ATG為504bp和993bp；GAAT框距離ATG為218bp和760bp；CAAT框距離ATG為563bp和 1 002bp。GAPDH ATG上游序列在genbank的EST數(shù)據(jù)庫blast，并未匹配到相應(yīng)的5′UTR序列（圖3），因此推測在ATG到5′UTR區(qū)存在較長的內(nèi)含子。

圖2 褐飛虱Actin1基因啟動子區(qū)序列Fig.2 Sequence of brown planthopperActin1promoter region

圖3 褐飛虱GAPDH基因ATG上游序列Fig.3 ATG upstream sequence of brown planthopperGAPDHgene

3 討論

肌動蛋白與甘油醛-3-磷酸脫氫酶都是普遍存在高度保守的蛋白，參與細胞中許多重要代謝過程，作為看家基因在各個組織與各個時期均能表達。其啟動子常作為組成型表達啟動子啟動目的基因高效表達。如家蠶（Bombyxmori）與兩點蟋（two-spotted cricket，Gryllusbimaculatus）轉(zhuǎn)基因用Actin基因的啟動子［6-7］?？寺幼拥姆椒ǘ嗖捎没赑CR的染色體步移技術(shù)，而Tail-PCR又是比較常用的技術(shù)，其基于巢式PCR原理，3次熱不對稱PCR即可獲得側(cè)翼序列，該技術(shù)具有簡單快速、高效特異并能對產(chǎn)物直接測序等優(yōu)點［8］。本研究通過Tail-PCR技術(shù)獲得褐飛虱Actin1基因ATG上游2 878bp序列，GAPDH基因ATG上游1 196bp序列。但GAPDHATG前端為內(nèi)含子，未得到啟動子區(qū)序列。Actin1則成功獲得啟動子區(qū)序列，通過BDGP數(shù)據(jù)庫Neural Network Promoter Prediction軟件預(yù)測啟動子2個核心序列離ATG距離分別為436bp和363bp，同時運用PLACE軟件在線分析啟動子區(qū)的各元件。本研究成功克隆了Actin1基因啟動子區(qū)序列，為外源基因在褐飛虱細胞內(nèi)高效表達，乃至褐飛虱轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Cloning and Sequence Analysis of Brown Planthopper House-keeping Gene Promoter

PENG Lei1，ZHAO Yan2，MA Yinhua2
（1.CollegeofLifeSciences，GuizhouNormalUniversity，Guiyang，Guizhou550001；2.CollegeofLife Sciences，WuhanUniversity，Wuhan，Hubei430072，China.）

The ATG front flanking sequence ofNilaparvatalugensActing 1andLaodelphaxstriatellaGAPDH was amplified by Tail-PCR from designed nested primers based on nested primers designed from Nilaparvata lugens Actin 1mRNA sequence in Genbank and the nested primers designed from the homologous sequence inNilaparvatalugensEST database by searchingLaodelphaxstriatellaGAPDHmRNA sequence.Results：The length of ATG front flanking sequence ofActing1andGAPDHis 2 878bp and 1 196bp respectively.The core promoter sequence，TATA box，CAAT box and GATA box are obtained by on-line analysis of BDGP database and PLACE software.

brown planthopper；Actin1；GAPDH；promoter；Tail-PCR

S435.112＋.9

A

2015-05-15；2016-09-01修回

國家自然科學(xué)基金項目“水稻抗褐飛虱基因多樣性持續(xù)控制褐飛虱的分子機理”（31230060）

彭 雷（1980-），男，實驗師，博士，從事水稻與褐飛虱互作研究。E-mail：daylight898＠sina.com

1001-3601（2016）09-0369-0004-04