朱學(xué)棟，何曉蓉，劉華強(qiáng)，楊　霞，朱菲菲，周春江

（重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶涪陵408000）

?

莖瘤芥（榨菜）子葉及帶下胚軸莖段離體培養(yǎng)研究

朱學(xué)棟，何曉蓉，劉華強(qiáng)，楊霞，朱菲菲，周春江

（重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶涪陵408000）

摘 要：以莖瘤芥永安小葉品種無(wú)菌苗子葉和帶下胚軸莖段為材料，初步探索愈傷組織誘導(dǎo)、分化及再生植株生根培養(yǎng).結(jié)果表明，子葉與葉柄的切口處極易產(chǎn)生愈傷組織，在MS＋1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA培養(yǎng)基中，愈傷組織分化率達(dá)到64%，其不定芽量最大；1／2MS＋0.6mg·L-1IBA培養(yǎng)基對(duì)不定根形成最為有利，生根率可達(dá)到96%.

關(guān)鍵詞：子葉；愈傷組織；分化；生根

莖瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）芥菜種葉芥亞種大葉芥變種的變種，其最初由野生芥菜（Brassica juncea）進(jìn)化而來(lái).

自20世紀(jì)70年代至今，蕓薹屬作物組織培養(yǎng)技術(shù)取得了很大進(jìn)展，在芥菜、甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜、花椰菜等一系列物種上都建立了較好的再生體系.盡管白菜型油菜（B.campestris），包括大白菜（B.campestris ssp.pekinensis）、白菜（B.campestris ssp.chinemis）等是組織培養(yǎng)比較困難的一些品種，但到目前為止，白菜等一些蔬菜已經(jīng)獲得了組織培養(yǎng)較高的再生體系頻率.

我國(guó)對(duì)蕓薹屬作物離體培養(yǎng)研究起步較晚，張智奇等［1］以小白菜的子葉為外植體、候喜林等［2］以不結(jié)球白菜的矮腳黃品種的子葉為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的時(shí)候，均發(fā)現(xiàn)了器官不經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)而直接分化成不定芽的結(jié)果.1991年雷建軍等［3］對(duì)中國(guó)芥菜的器官培養(yǎng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)基因型、外植體、生理狀態(tài)對(duì)器官培養(yǎng)植株再生都有很大影響.陳利萍等［4］在2004年利用組織培養(yǎng)技術(shù)輔助莖用芥菜育種，解決了大株留種困難、性狀鑒定時(shí)需犧牲親本等問(wèn)題，也可解決育種過(guò)程遇到溫度過(guò)高、水分不足或蟲(chóng)害等不良自然條件而無(wú)法正常收獲種子時(shí)的種質(zhì)資源保存和繁殖的問(wèn)題.張艷梅等［5］在榨菜下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及分化中得到了較高頻的愈傷組織誘導(dǎo)率及分化率.孫全等［6］用正交試驗(yàn)優(yōu)選莖瘤芥子葉組培誘導(dǎo)培養(yǎng)基研究中篩選出了子葉誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA 3.0mg·L-1＋NAA 0.10 mg·L-1.

植物材料的基因類型直接影響著離體培養(yǎng)的效果，不同材料再生能力不同［7］，因此，作者選定一個(gè)供試品種，從愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、生根培養(yǎng)角度研究莖瘤芥組織培養(yǎng)技術(shù)，為今后莖瘤芥誘變育種、多倍體育種等莖瘤芥材料創(chuàng)制提供技術(shù)支撐.

1　材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為重慶市涪陵區(qū)本地品種永安小葉，材料由重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌苗誘導(dǎo)

將永安小葉種子在自來(lái)水下沖洗2h.清洗干凈后拿到無(wú)菌操作臺(tái)升汞消毒7min（此過(guò)程需要不停地震蕩），無(wú)菌水清洗5遍后接種在無(wú)菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上.無(wú)菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1／2MS＋瓊脂5.5g·L-1，溫度（25±2）℃，光照12h·d-1.

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化

誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.55%的瓊脂、3%的蔗糖，以及添加不同濃度的NAA（0.1、0.2）mg·L-1＋6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0）mg·L-1，調(diào)節(jié)pH為5.8.考察不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響.無(wú)菌苗子葉每瓶接種10片，（25±2）℃，暗培養(yǎng)；帶下胚軸莖段每瓶接種6個(gè)，（25±2）℃，光照12h·d-1，分別接種在上述不同激素配比的培養(yǎng)基中.30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率及不定芽分化率.

1.2.3 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)以1／2MS為基本培養(yǎng)基，附加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.55%的瓊脂、2%的蔗糖，添加不同濃度的IBA（0.2、0.4、0.6、0.8）mg·L-1或NAA（0.2、0.4、0.6、0.8）mg·L-1.每瓶培養(yǎng)基接種高度2cm左右的不定芽小苗5～7根.暗培養(yǎng)3d后光照培養(yǎng)，光照12h·d-1，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)生根率.

1.2.4 煉苗和移栽

將已生根的小苗移到玻璃溫室，不開(kāi)蓋煉苗7d，打開(kāi)蓋子，煉苗4d，用清水將小苗根部的培養(yǎng)基洗凈，移栽到裝有普通營(yíng)養(yǎng)土的花缽中，遮陰，保持土質(zhì)濕潤(rùn)，溫度控制在27℃左右，其余常規(guī)管理.

1.2.5 實(shí)驗(yàn)材料編號(hào)

實(shí)驗(yàn)編號(hào)由“主編號(hào)-副編號(hào)”組成，主編號(hào)由實(shí)驗(yàn)材料決定，子葉材料編號(hào)為1，帶下胚軸莖段編號(hào)為2，再生植株編號(hào)為3，副編號(hào)由實(shí)驗(yàn)所使用的激素濃度決定，由激素濃度由低到高依次編號(hào).

2　結(jié)果與分析

2.1 不同濃度激素配比對(duì)子葉愈傷組織和不定芽分化的影響

愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化中添加不同濃度的6-BA和NAA組合后，出愈率和分化率見(jiàn)表1.

表1　不同濃度的激素對(duì)子葉愈傷組織和不定芽分化的影響Tab.1　Effects of the cotyledon callus and adventitious bud differentiation by different hormone concentration

由表1可以看出，子葉接種在培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)30d后子葉出愈率可達(dá)到100%，主要在子葉與子葉柄切口處形成大量淡黃色愈傷組織，愈傷量小，且伴有大量的毛狀根的形成.不定芽分化率均不高，最高分化率為編號(hào)1-6，分化率達(dá)到64%，激素用量為1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA；最低分化率為編號(hào)1-4，分化率達(dá)到14%，激素用量為2.0mg·L-16-BA＋0.1mg·L-1NAA.從表1中可以看出，NAA用量一定的情況下，隨著6-BA濃度的升高，分化率先升高后降低，說(shuō)明過(guò)高濃度的6-BA對(duì)愈傷組織分化有一定的抑制作用；在6-BA濃度一定的情況下，隨著NAA濃度的升高，分化率有一定的提高，說(shuō)明適當(dāng)提高NAA濃度有利于愈傷組織不定芽的分化.

2.2 不同濃度的激素對(duì)帶下胚軸莖段出苗率的影響

將帶下胚軸的莖段接種在不同濃度梯度的MS培養(yǎng)基種，出苗率及植株長(zhǎng)勢(shì)見(jiàn)表2.

表2　不同濃度的激素對(duì)帶下胚軸莖段出苗率的影響Tab.2　Effect of the hypocotyl stem section under emergence rate by different hormone concentration

由表2可以看出，在不同濃度梯度的激素配比下帶下胚軸的莖段均能出苗，出苗率達(dá)到100%，且在基部均有愈傷組織的生成，NAA用量的提高，基部愈傷組織的量明顯增加；在NAA濃度不變的情況下，隨著6-BA濃度的提高，再生小苗高度增加，葉柄肥厚，葉片細(xì)長(zhǎng)；在低濃度的6-BA作用下葉片大，小苗較為健壯.在激素濃度為1.0mg·L-16-BA＋0.1mg·L-1NAA的作用下，小苗長(zhǎng)勢(shì)最好.

2.3 生根情況

將長(zhǎng)高至3cm左右的再生小苗接種含有不同濃度激素的1／2MS培養(yǎng)基上，生根結(jié)果見(jiàn)表3.

表3　不同濃度的激素對(duì)組培苗生根的影響Tab.3　Effect of rooting by different hormone concentration

由表3可看出，IBA和NAA均能不同程度地誘導(dǎo)再生植株生根，最高生根率為添加0.6mg·L-1的NAA，達(dá)到97%；最低生根率為添加0.8mg·L-1的IBA，達(dá)到74%.隨著IBA和NAA濃度的提高，生根率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，均在用量為0.6mg·L-1時(shí)達(dá)到最大生根率，說(shuō)明高濃度的生長(zhǎng)素會(huì)抑制再生植株的生根.采用IBA和NAA誘導(dǎo)的再生植株生根基本一致，但根的長(zhǎng)勢(shì)IBA整體情況較好，IBA誘導(dǎo)的生根根多、長(zhǎng)、粗壯、側(cè)根較多；NAA誘導(dǎo)根細(xì)長(zhǎng)、少、側(cè)根少.因此，采用0.6mg·L-1IBA對(duì)再生植株誘導(dǎo)生根效果最佳.

2.4 煉苗移栽結(jié)果

不定芽生根培養(yǎng)30d以后，將小苗移到玻璃溫室中，不開(kāi)蓋煉苗7d，打開(kāi)蓋子，煉苗4d，用清水將小苗根部的培養(yǎng)基洗凈，移栽到花缽中，保持水分充足，3d后葉片完全展開(kāi)，葉色飽滿，生長(zhǎng)正常，移栽成活率達(dá)到98%以上.

3　討 論

以永安小葉無(wú)菌苗子葉和帶下胚軸莖段為供試材料，子葉連接葉柄切口處極易形成愈傷組織，但愈傷組織量小、淡黃色，且伴有毛狀根的形成；20d后分化出再生植株，下胚軸莖段接種后7d左右即可觀察到生長(zhǎng)點(diǎn)長(zhǎng)出真葉，且長(zhǎng)勢(shì)良好.沈進(jìn)娟等［8］使用涪陵當(dāng)?shù)亍坝腊残∪~”“郫縣榨菜”“藺市草腰子”3個(gè)地方品種進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)植株再生頻率與材料基因型有密切的關(guān)系.Takasaki等［9］曾報(bào)道在白菜子葉培養(yǎng)中BA和NAA是必不可少的激素，而甘藍(lán)型油菜的子葉培養(yǎng)，只有BA是必需激素，不同種類的生長(zhǎng)素的作用有明顯差異.該實(shí)驗(yàn)愈傷組織誘導(dǎo)分化只采用了NAA作為唯一的生長(zhǎng)激素，當(dāng)激素配比達(dá)到1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA時(shí)，最高分化率達(dá)到64%.Chi等［10］在菜心離體培養(yǎng)中加入AgNO3和ABA，可有效抑制不定根的形成，從而有利于愈傷組織不定芽的分化，陳石頭［11］在榨菜帶柄子葉分化中添加5mg·L-1AgNO3，能有效提高帶柄子葉的分化效率，張鵬等［12］也有類似的研究結(jié)論.該實(shí)驗(yàn)并未驗(yàn)證該法，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn).

該實(shí)驗(yàn)在子葉誘導(dǎo)愈傷組織分化的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)再生植株易出現(xiàn)玻璃化苗、畸形苗現(xiàn)象.陳國(guó)菊［13］在芥菜離體培養(yǎng)中玻璃化機(jī)制進(jìn)行了深入研究，但并未給出如何控制離體培養(yǎng)中的玻璃化現(xiàn)象，筆者通過(guò)降低溫度調(diào)整效果不明顯，現(xiàn)階段正通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基成分來(lái)控制玻璃化現(xiàn)象，結(jié)果尚不明確，而帶下胚軸莖段在培養(yǎng)溫度不高于27℃條件下培養(yǎng)，可有效抑制玻璃化苗的產(chǎn)生.因此，子葉誘導(dǎo)愈傷組織再分化過(guò)程還需要進(jìn)一步研究，以期獲得高頻的愈傷組織誘導(dǎo)再生植株.

參考文獻(xiàn)：

［1］ 張智奇，周音，張玉華，等.小內(nèi)菜子葉誘導(dǎo)不定芽再生植株［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，14（2）：25-28.

［2］ 候喜林，哲壽裕.不結(jié)球白菜子葉離體培養(yǎng)再生植株［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，17（4）：60-64.

［3］ 雷建軍，陳世儒，郭余龍，等.莖用芥菜的原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生［J］.植物學(xué)報(bào)，1991，33（2）：91-97.

［4］ 陳利萍，李春順，戈加欣.利用組織培養(yǎng)技術(shù)輔助莖用芥菜育種［J］.中國(guó)蔬菜，2005（3）：22-23.

［5］ 張艷梅，于錫宏，蔣欣梅，等.榨菜下胚軸離體培養(yǎng)植株再生體系的建立［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（16）：3628-3631.

［6］ 孫全，朱小燕，梁婷，等.應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)選莖瘤芥子葉組培誘導(dǎo)培養(yǎng)基［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（34）：20962-21020.

［7］ 吳慧敏，何勇，邵泱峰，等.葉用芥菜小孢子離體培養(yǎng)條件［J］.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，31（2）：315-321.

［8］ 沈進(jìn)娟，范永紅，冷容，等.莖瘤芥（榨菜）高效離體再生體系的建立［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2012，5：71-75.

［9］ TAKASAKI T，HATAKEYAMA K，OJIMA K，et al.Effects of various factors（hormone combinations，genotypes and antibiotics）on shoot regeneration from cotyledon explants in Brassica rapa［J］.Plant Tissue Culture Letter，1996，13：177-180.

［10］ CHI G L，BARFIELD D G，SIM G E，et al.Effect of AgNO3and amino-ethoxyvinylglycine on in vitro shoot and root organogenesis from seedling explants of recalcitrant Brassica genotypes［J］.Plant Cell Reports，1990，9（4）：195-198.

［11］ 陳石頭，余小林，曹家樹(shù)，等.榨菜子葉和帶柄子葉再生植株的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，17（1）：27-30.

［12］ 張鵬，凌定厚.提高菜心離體植株再生頻率的研究［J］.植物學(xué)報(bào)，1995，37（11）：902-908.

［13］ 陳國(guó)菊，雷建軍.芥菜離體培養(yǎng)中玻璃化機(jī)理的研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22（3）：237-239.

（責(zé)任編輯 于 敏）

The study of cotyledon and hypocotyl with stem
on Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee in vitro culture

ZHU Xuedong，HE Xiaorong，LIU Huaqiang，YANG Xia，ZHU Feifei，ZHOU Chunjiang （The Central Laboratory of Southeast of Chongqing Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uling 400800，China）

Abstract：Cotyledon and hypocotyl stem section under as materials of Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee named Yongan Xiaoye，are used to explore callus induction，differentiation and regeneration plant rooting culture preliminarily.The results showed that the slit of cotyledon and petiole produce callus.Cultured in MS＋1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA medium，the callus differentiation rate reached to 64%.In 1／2MS＋0.6mg·L-1IBA medium for adventitious root formation is most favorable，the rooting rate reached to 96%.

Key words：cotyledons；callus；differentiation；rooting

doi：10.3969／j.issn.1000-2162.2016.01.014

作者簡(jiǎn)介：朱學(xué)棟（1984-），男，甘肅蘭州人，重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院助理研究員，碩士.

基金項(xiàng)目：重慶市涪陵區(qū)科委項(xiàng)目（FLKJ，2014ABB2066）

收稿日期：2015-05-08

中圖分類號(hào)：O156

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-2162（2016）01-0086-05