吳昊偉，　王　倩，　榮　萍，　付春雪，　賈沛軒，　曲憲成

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,上?！?01306)

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黃鱔性腺發(fā)育過程中Amh和SOX9基因的表達分析

吳昊偉，王倩，榮萍，付春雪，賈沛軒，曲憲成

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306)

摘要:文章研究了黃鱔性腺發(fā)育過程中抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,Amh)基因和Sry相關(guān)高泳動類非組蛋白基因9(Sry-related high mobility group-box gene 9,SOX9)2個基因的表達量變化及關(guān)系,進而推斷其基因表達通路,為研究黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中基因的調(diào)控理論奠定基礎(chǔ)。文章提取黃鱔Ⅰ齡卵巢(Ⅱ期卵巢)、Ⅲ齡卵巢、Ⅱ齡間期性腺早期、Ⅱ齡間期性腺后期、Ⅲ齡精巢5個時期的性腺組織RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過半定量和熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)對其表達量進行定量分析。結(jié)果表明,Amh和SOX9基因在黃鱔性腺發(fā)育過程中的表達沒有特異性,隨著卵巢的敗育和精巢的發(fā)育,表達量明顯升高。Amh基因在Ⅲ齡精巢表達有顯著增高,SOX9基因的表達量高于Amh(Ⅲ齡精巢例外)。Amh和SOX9基因的表達呈現(xiàn)正相關(guān),后期Amh基因的表達量顯著升高可能是由于存在一個誘導(dǎo)SOX9基因表達的信號,兩者在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程及精巢的發(fā)育過程中存在一定的協(xié)同關(guān)系,可能存在Amh—SOX9基因信號通路。

關(guān)鍵詞:黃鱔;半定量聚合酶鏈式反應(yīng);熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng);表達分析

0引言

黃鱔(Monopterusalbus)按分類學(xué)隸屬于合鰓目、合鰓科，是我國著名的淡水魚之一,主要棲息于湖泊、河流等水體中,營底棲生活。因其肉味鮮美、營養(yǎng)價值高而深受廣大消費者歡迎[1]。黃鱔生命周期中早期為雌性,卵巢退化后,精巢組織和卵巢同時存在于性腺中,隨著性腺的發(fā)育,卵巢組織完全消失,最后進入雄性階段,這是一種典型的性轉(zhuǎn)變現(xiàn)象[2-3]。黃鱔的基因組只有600 Mbp,是脊椎動物中的原始物種,也是研究生物進化機制、比較基因組學(xué)和發(fā)育生物學(xué)很好的模式生物[4]。但目前由于我國黃鱔野生資源緊缺,過渡捕撈嚴重,水資源及苗種數(shù)量的限制，使黃鱔的人工養(yǎng)殖效率不高,無法滿足市場的需求[5]。研究黃鱔性腺發(fā)育過程中性逆轉(zhuǎn)的機制,能夠人為控制黃鱔性逆轉(zhuǎn)的發(fā)生,使黃鱔保持雌性狀態(tài),增加雌鱔親本的數(shù)量及降低養(yǎng)殖成本,進而提高幼鱔苗種數(shù)量[3]。因此研究黃鱔性逆轉(zhuǎn)有重要的經(jīng)濟意義，同時可以為理解脊椎動物的性別決定與分化機制、豐富魚類性別決定的基因調(diào)控模式提供參考[6]。

抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,Amh)基因在哺乳動物中發(fā)現(xiàn),是由胚胎早期精巢的支持細胞產(chǎn)生的,并引起苗勒氏管的退化[7]。Sry相關(guān)高泳動類非組蛋白基因(Sry-related high mobility group-box gene 9，SOX9)是脊椎動物中雄性性別決定方面的關(guān)鍵基因。SOX9和Amh基因表達都與雄性性別決定和分化有關(guān)。文獻[8]用包含人類Sry基因中保守區(qū)域的探針進行雜交,發(fā)現(xiàn)了在黃鱔基因組中Sry的同源基因。文獻[9]在黃鱔中克隆得到了SOX9a1 和SOX9a轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,原位雜交結(jié)果顯示,2種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在卵巢、精巢和間期性腺中都有表達,主要是在性腺的生殖上皮細胞的外層中表達。文獻[10]克隆了黃鱔AmhcDNA全長序列,在各期的性腺中利用原位雜交技術(shù)分析基因表達，發(fā)現(xiàn)其在性腺發(fā)育各期均有表達,在間期性腺中,Amh基因不僅在早期精巢的未分化的支持細胞中表達,同時在敗育的卵母細胞顆粒中也有表達,這個特點與哺乳動物有所區(qū)別。

目前研究得出哺乳動物中是以Sry為主導(dǎo)的一個多基因參與協(xié)調(diào)表達的級聯(lián)雄性調(diào)控通路[11],在哺乳動物中雄性發(fā)育通路是Sry—SOX9—Amh。但在后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在魚類等其他低等脊椎動物中,雄性性別分化通路與哺乳動物相比很保守,但又有所差別[12],體細胞基因SOX9參與了魚類精巢的形成,Amh基因作為一個信號通路伴隨著其他調(diào)控因子存在。有研究者認為，高等哺乳動物中雄性性別決定的基因表達通路是Sry—SOX9—Amh,而在魚類等其他低等脊椎動物中雄性性別決定的基因表達通路是Amh—SOX9[13-14]。從以上研究可看出,雄性表達通路差異在于Amh和SOX9基因表達先后差異,有關(guān)黃鱔的研究中關(guān)于這2個基因通路的報道不多,所以研究該通路的差異性可以發(fā)現(xiàn)魚類乃至低等脊椎動物雄性性別決定和分化哺乳類的差異。

本文從哺乳動物中研究的SOX9及Amh基因入手,在已知的青鳉魚Amh—SOX9表達通路基礎(chǔ)上,通過半定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)及熒光定量PCR定量分析探究黃鱔性腺發(fā)育中的Ⅰ齡卵巢(Ⅱ期卵巢) 、Ⅲ齡卵巢 、Ⅱ齡間期性腺早期、Ⅱ齡間期性腺后期、Ⅲ齡精巢(其中Ⅲ齡卵巢與Ⅲ齡精巢同時出現(xiàn),可能是由于該黃鱔生長條件好生長快,而黃鱔性逆轉(zhuǎn)需要較長時間,所以其仍然為雌性)5個時期的2個基因表達量高低,驗證在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中Amh和SOX9 2個關(guān)鍵基因的表達通路,從而為明確黃鱔性逆轉(zhuǎn)的機制提供參考,同時也為魚類性別決定和分化的研究提供幫助。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本采集

本文試驗樣本購自上海市臨港新蘆苑農(nóng)貿(mào)市場及安徽省農(nóng)科院水產(chǎn)研究所。用頸椎切斷法處死黃鱔,采集性腺(大約為100 ～150 mg),該試驗獲得5個時期性腺,分別為Ⅰ齡卵巢(Ⅱ期卵巢)、Ⅲ齡卵巢、Ⅱ齡間期性腺早期、Ⅱ齡間期性腺后期、Ⅲ齡精巢,之后放入液氮速凍,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑

RNA抽提試劑Trizol Reagent購自invitrogen; Taq DNA聚合酶、dNTP Mix(10 mol/L)、DL 2000 DNA Marker、SYBR Premix Ex TaqTM、RT-PCR Kit、RNase inhibitor、Oligo(dT)18等購自Takara工程(上海皓嘉)有限公司;所用引物由本文設(shè)計后由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3引物

半定量引物設(shè)計是根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(national center of biotechndogy information,NCBI)上已知的Amh、SOX9基因全長,于開放閱讀框內(nèi)設(shè)計1對PCR引物,以GeneBank中已發(fā)表的黃鱔 β-actin基因為內(nèi)參基因,引物5′-3′序列如下:

Amh-F: CTGCTGAAGGCTTTGCAGAC;

Amh-R: AGCGGCATTCACACTCCTTTG;

SOX9-F: GAATCTCCTCGACCCTTAC；

SOX9-R:TCWGCTTCTTCCACAAACGG；

β-actin-F: ATCGCCGCACTCGTTGTTGAC；

β-actin-R: CCTGTTGGCTTTGGGGTTC。

熒光定量PCR引物同上。

1.2實驗方法

1.2.15個時期組織總RNA的提取

分別從-80 ℃冰箱中取出5個時期性腺組織樣本,取出100 mg置于冰上加入1 mL Trizol試劑,勻漿完全后利用氯仿進行抽提,異丙醇進行沉淀提取,最后用適量的0.1% DEPC-H2O溶解總RNA,并檢測RNA的質(zhì)量濃度。

1.2.2普通cDNA第1鏈的合成

分別以5個時期提取的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成普通cDNA第1鏈。具體操作過程如下:向0.2 mL的離心管加入2 μg總RNA,1 μL Oligo(dT)18 Primer和適量的0.1% DEPC-H2O,混勻并短暫離心；置于PCR儀中70 ℃哺育5 min,然后立即冰浴2 min;反應(yīng)后加入4 μL 5×M-MLV Buffer、4 μL 10 mol/L dNTP Mix、0.5 μL RNase inhibitor、0.8 μL M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶,混勻并短暫離心,然后置于PCR儀中42 ℃反應(yīng)1 h,70 ℃反應(yīng)10 min,所得產(chǎn)物為cDNA第1鏈,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3Amh和SOX9基因的半定量PCR分析

以β-actin為內(nèi)參基因,以所合成的性腺5個時期的普通cDNA第1鏈為模板進行PCR擴增,初步檢測基因在性腺中表達量變化及檢測基因的表達是否具有組織特異性。

擴增體系為:10×PCR buffer 2.0 μL,dNTP 1.6 μL,PCR forward primer(10 μmol/L)1.0 μL,PCR reverse primer(10 μmol/L)1.0 μL,Template 1.0 μL,Taq DNA polymerase 0.1 μL,ddH2O 13.3 μL,總體積20.0 μL。

反應(yīng)條件為: 94 ℃5 min;94 ℃30 s;Amh維持58.4 ℃、SOX9維持56.0 ℃、β-actin維持58.2 ℃;Tm 30 s,72 ℃45 s,共30個循環(huán);72 ℃延伸3 min;4 ℃保存。結(jié)束后以1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.42個基因的熒光定量PCR分析

利用SYBR Green I 熒光染料在 Applied Biosystems 7500 熒光定量 PCR 儀上精確檢測Amh基因和SOX9基因在各期性腺之間表達量的關(guān)系。

熒光定量反應(yīng)體系如下:SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,PCR forward primer(10 μmol/L)0.4 μL,PCR reverse primer(10 μmol/L)0.4 μL,Rox reference dyeⅡ(50×)0.4 μL,Template 2.0 μL,ddH2O 6.8 μL,總體積20.0 μL。

反應(yīng)條件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;60 ℃,34 s;40個循環(huán)。熔解曲線程序:95 ℃,1 min;60 ℃,1 min,從60 ℃開始至 95 ℃分析熔解曲線,每個循環(huán)升溫 0.5 ℃。

反應(yīng)結(jié)束后,收集實驗數(shù)據(jù),記錄軟件給出的熒光定量強度增加到閾值時的擴增循環(huán)數(shù)(Ct 值)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)結(jié)果以 2-ΔΔCt的平均值±標準差表示。顯著性檢驗采用 DunnettT3 軟件,P<0.05 時為顯著性差異,P<0.01 為極顯著差異,數(shù)據(jù)利用 SPSS17.0 軟件進行分析。

2結(jié)果與分析

2.12個基因的半定量PCR分析結(jié)果

Amh和SOX9基因的半定量分析結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出,Amh和SOX9基因在黃鱔性腺發(fā)育過程中沒有特異性,在精巢、卵巢和間期性腺中都有表達,隨著性腺發(fā)育電泳條帶亮度呈現(xiàn)明顯的上升趨勢,說明兩者表達量有著不同程度的增加,其中SOX9和Amh基因在早期卵巢中表達不明顯,隨著卵巢的敗育和精巢的發(fā)育表達量明顯升高?？梢钥闯觯@2個基因在早期卵巢與精巢中表達存在明顯差異，亮度的變化趨勢表明,Amh基因在精巢中的亮度要大于SOX9。本實驗也證明了引物特異性良好,可以用作熒光定量實驗。

1.Ⅰ齡卵巢(Ⅱ期卵巢)　2.Ⅲ齡卵巢　3.Ⅱ齡間期性腺早期

2.22個基因熒光定量PCR分析表達結(jié)果

運用SYBR Green I檢測方法,以內(nèi)參基因β-actin表達量為參照,驗證2個基因隨黃鱔性腺發(fā)育的表達情況,以5個性腺時期后一個時期對前一個時期的差異進行方差分析，結(jié)果見表1所列。

表1　各期性腺中Amh和SOX9基因相對表達量

注：“*”表示與前一組數(shù)據(jù)相比差異顯著;“**”表示與前一組數(shù)據(jù)相比差異極顯著；ΔΔCt表示(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)X期性腺-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)Max

Amh基因和SOX9基因熒光定量結(jié)果表明,2個基因在各期性腺中均有表達,與半定量PCR結(jié)果相同,隨著黃鱔性腺的發(fā)育,2個基因表達量逐漸增加。其中Amh基因在Ⅰ齡卵巢和Ⅲ齡卵巢,Ⅱ齡性腺間期早期和Ⅱ齡性腺間期后期的性腺發(fā)育過程中表達量變化大,呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05),在Ⅲ齡精巢中表達量變化很大,呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)；SOX9基因在Ⅰ齡卵巢和Ⅲ齡卵巢，Ⅲ齡卵巢和Ⅱ齡性腺間期早期的性腺發(fā)育過程中表達量變化大,呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，在Ⅱ齡性腺間期早期和Ⅱ齡性腺間期后期中表達量的變化很大，呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

3討論

黃鱔的發(fā)育不同于其他硬骨魚類,是一種雌雄同體并且雌性先熟的淡水魚類,早期發(fā)育為雌性,后期則發(fā)育為雄性,中間經(jīng)歷一個雌雄間性的過程,該發(fā)育過程不可逆。黃鱔的所有個體決定性別的遺傳因素是相同的,沒有遺傳上的雌雄之分,是一種發(fā)育上的而不是遺傳上的雌雄異體[2]。關(guān)于黃鱔性逆轉(zhuǎn)的機制一直是研究的熱點,但有關(guān)其具體分子機制的研究并不多。為了研究這一原始物種的性別決定與分化機制,研究者做了大量的工作,對黃鱔性逆轉(zhuǎn)研究已經(jīng)明確了Vasa[15]、SOX9[8-9]、Dmrt1[16]、Amh[10]、P45011β[17]等基因的表達情況,但現(xiàn)階段的研究均未取得突破性進展。

本文實驗以黃鱔5個時期的性腺樣本為材料,通過半定量PCR驗證2個基因的表達是否具有明顯的組織特異性。結(jié)果顯示,Amh和SOX9基因在黃鱔精巢、卵巢和間期性腺中都有表達,兩者表達量有著不同程度的增加,說明這2個基因在早期卵巢與精巢中表達存在明顯差異。

熒光定量PCR結(jié)果與半定量PCR結(jié)果一致。Amh熒光定量結(jié)果顯示,在Ⅰ齡卵巢表達量很低,這一時期是黃鱔卵巢發(fā)育時期,與其拮抗的Amh基因表達量很低;Ⅲ齡卵巢時期,Amh基因表達量達到了前者的2倍,有顯著差異,該階段已經(jīng)到了卵巢發(fā)育中后期,在該階段發(fā)育過程中卵巢發(fā)育的主要事件是卵母細胞卵黃顆粒的積累,該階段卵巢發(fā)育迅速,活力較強,Amh基因表達量的顯著變化與卵巢的快速發(fā)育存在一定的關(guān)系;在Ⅱ齡性腺間期早期及Ⅱ齡性腺間期后期,Amh基因表達量進一步升高,這一時期是黃鱔性逆轉(zhuǎn)時期,伴隨著卵巢組織的退化;在Ⅲ齡精巢中,Amh基因的表達量急劇增加,產(chǎn)生了極顯著差異(P<0.01),這一時期是黃鱔精巢發(fā)育階段,推測Amh基因作用逐步體現(xiàn),使得卵巢結(jié)構(gòu)完全退化,精巢結(jié)構(gòu)全面產(chǎn)生,Amh基因高的表達量是一個基因表達信號使下游基因達到閾值,促進其表達。

SOX9基因熒光定量PCR結(jié)果與Amh基因類似,在Ⅱ齡性腺間期早期及后期中,SOX9基因表達量升高很快,這一時期SOX9基因會促進卵巢組織退化,精巢支持細胞產(chǎn)生。在Ⅲ齡精巢中,表達量與前一時期相比略有降低,認為應(yīng)該屬于實驗誤差,在Ⅲ齡精巢中表達量應(yīng)該會高于間期。2個基因表達量變化較大階段為黃鱔性腺由卵巢逐漸轉(zhuǎn)化為精巢階段,可以得出2個基因的表達式變化在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中起到一定作用。

黃鱔性逆轉(zhuǎn)是一個復(fù)雜的過程,后續(xù)研究應(yīng)該從以下幾個方面進行:

(1) 進一步找尋上游基因的調(diào)控方式,研究在黃鱔的胚胎發(fā)育和仔魚發(fā)育中一些關(guān)鍵基因的表達及定位。

(2) 進行基因敲除實驗,進一步明確黃鱔體內(nèi)在性逆轉(zhuǎn)時期的基因表達通路。

(3) 研究關(guān)鍵基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物,從蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生物學(xué)意義入手,突破單純的克隆基因的局限。

(4) 研究已知基因相關(guān)的結(jié)構(gòu)(如啟動子),以利于更好地了解基因的表達和調(diào)控。

4結(jié)論

根據(jù)Amh和SOX9基因熒光定量PCR分析結(jié)果,可以得出兩者的表達呈現(xiàn)正相關(guān)。在黃鱔性腺發(fā)育過程中,從早期性腺即有表達,Amh基因的表達量少量升高,SOX9基因表達顯著升高。后期Amh基因的表達量顯著升高可能是一個誘導(dǎo)SOX9基因表達的信號,兩者在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程及精巢的發(fā)育中存在一定的協(xié)同關(guān)系,可能是類似青鳉魚的Amh—SOX9信號通路,該通路在黃鱔早期性腺發(fā)育及性逆轉(zhuǎn)過程中會起到重要作用。本實驗為黃鱔性逆轉(zhuǎn)機制的研究和魚類性別決定與分化提供了參考依據(jù)。

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(責(zé)任編輯閆杏麗)

Expression analysis ofAmhandSOX9 in gonads development during sex reversal in rice field eel

WU Hao-wei,WANG Qian，RONG Ping,FU Chun-xue,JIA Pei-xuan，QU Xian-cheng

(College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306, China)

Abstract:The expression level and relationship between two genes i.e. anti-Mullerian hormone(Amh) and Sry-related high mobility group-box gene 9(SOX9) in gonads development during sex reversal in the rice field eel were investigated， and the gene expression pathway was concluded. The study laid foundation for the genes regulation theory during the sex reversal of the rice field eel. The cDNA of five gonadal samples including one-year-old ovary(ovary of stage Ⅱ), three-year-old ovary, two-year-old early ovotestis, two-year-old later ovotestis, and three-year-old testis were reversely transcribed from the extracted RNA. The expression of the two genes in each stage of the gonads was analyzed by using semi-quantitative polymerase chain reaction(PCR) and real-time fluorescence quantitative PCR. It was showed that the expression of Amh and SOX9 had no specificity during gonad development，with the ovary abortiveness and testis development，the transcription level significantly increased. The expression of Amh had a marked increase in three-year-old testis; the expression of SOX9 was higher than that of Amh except in three-year-old testis. It came to the conclusion that the expression of Amh and SOX9 may have positive correlation， the markedly increased expression of Amh in three-year-old testis may be a signaling pathway to induce the later expression of SOX9， which had a certain synergy relationship during the process of sex reversal and development of the testis in the rice field eel， which may be the gene chain like Amh-SOX9 in Oryzias latipes.

Key words:rice field eel; semi-quantitative polymerase chain reaction(PCR); fluorescence quantitative polymerase chain reaction(PCR); expression analysis

中圖分類號:S917.4

文獻標識碼：A

文章編號：1003-5060(2016)02-0275-05

Doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.02.025

作者簡介：吳昊偉(1990-),男,安徽蕪湖人,上海海洋大學(xué)碩士生;曲憲成(1965-),男,吉林榆樹人,博士,上海海洋大學(xué)副教授,碩士生導(dǎo)師.

基金項目：農(nóng)業(yè)部科技教育司資助項目(201003076)

收稿日期：2015-05-18；修回日期：2015-12-22