梁超　倉(cāng)靜　薛張綱

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上?！?00032)

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·論著·

丙泊酚通過(guò)抑制小鼠海馬神經(jīng)元突觸釋放組織纖溶酶原激活物引起神經(jīng)毒性損傷

梁超倉(cāng)靜薛張綱

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上海200032)

摘要目的： 明確丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)的發(fā)育期新生小鼠海馬神經(jīng)元釋放組織纖溶酶原激活物(tPA)的影響，并進(jìn)一步探討加入外源性tPA能否逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)發(fā)育神經(jīng)元的毒性損傷作用。方法： 將體外培養(yǎng)的發(fā)育期小鼠海馬神經(jīng)元分為4組：對(duì)照組(C組)、丙泊酚組(Pro組)、tPA組和丙泊酚+tPA組(Pro+tPA組)。C組不做任何處理；Pro組在培養(yǎng)液中加入丙泊酚，終濃度為5、10、30 μmol/L，繼續(xù)孵育不同的時(shí)間(1 h、2 h、3 h、6 h)；tPA組在培養(yǎng)液中加入tPA，終濃度為1 μmol/L，繼續(xù)孵育6 h；Pro+tPA組在在培養(yǎng)液中同時(shí)加入tPA(終濃度1 μmol/L)及丙泊酚(終濃度10 μmol/L)，繼續(xù)孵育6 h。檢測(cè)各組神經(jīng)元凋亡率及凋亡指標(biāo)actived-caspase-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果： Pro組神經(jīng)元的凋亡率及actived-caspase-3蛋白的表達(dá)水平較C組顯著上調(diào)(P<0.05)。Pro組tPA水平顯著低于C組(P<0.05)。Pro+ tPA組的神經(jīng)元的凋亡率及actived-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著低于Pro組(P<0.05)。結(jié)論： 丙泊酚可通過(guò)抑制神經(jīng)元釋放tPA而對(duì)體外培養(yǎng)的新生小鼠發(fā)育期海馬神經(jīng)元產(chǎn)生毒性損傷作用，外源性加入tPA可部分逆轉(zhuǎn)丙泊酚的神經(jīng)毒性作用。

關(guān)鍵詞丙泊酚;發(fā)育期神經(jīng)元;毒性損傷

Propofol Induces Neurotoxicity by Inhibiting tPA Release of Neuronal Synapse in Mouse Hippocampus

LIANGChaoCANGJingXUEZhanggang

DepartmentofAnesthesiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective： To explore the effect of propofol on the tPA release of hippocampal neurons in developing mice, so as to investigate whether exogenous tPA could reverse the propofol-induced neurotoxicity on developing neurons.Methods： The hippocampal neurons of developing mice cultured in vitro were divided into 4 groups(n=20 each)：control group(group C)，propofol group(group Pro), group tPA and propofol plus tPA group(group Pro+tPA)．There was no specific treatment in group C. In group Pro，propofol was added to the culture media with the final concentration of 5,10, 30 μmol/L, respectively, and the cells were then incubated for 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, respectively．In group tPA，tPA was added to the culture media with the final concentration of 1 μmol/L，and the cells were then incubated for 6 h．In group Pro+tPA, both propofol and tPA were added to the culture with the final concentration of 10 μmol/L and 1 μmol/L,respectively, and the cells were then incubated for 6 h.The neuron apoptosis rate and the expression level of actived-caspase-3 protein were detected in each group.Results： Compared with that in group C，the apoptosis rate and the expression level of actived-caspase-3 protein in group Pro significantly increased (P<0.05)．The tPA level in group Pro was significantly higher than that in group C(P<0.05). Compared with that in group Pro，the apoptosis rate and the expression level of actived-caspase-3 protein in group Pro+tPA significantly decreased (P<0.05).Conclusions： Propofol induces neurotoxicity on hippocampal neurons of developing mice cultured in vitro by inhibiting neuronal tPA release. And exogenous tPA could partially reverse propofol-induced neurotoxicity.

Key WordsPropofol;Developing neurons;Neurotoxicity

發(fā)育期個(gè)體暴露于全麻藥后所造成的遠(yuǎn)期神經(jīng)行為和學(xué)習(xí)能力損害與全麻藥物對(duì)發(fā)育期神經(jīng)元產(chǎn)生的毒性損傷作用相關(guān)[1-2]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚對(duì)發(fā)育期神經(jīng)元具有促凋亡作用[3]，并會(huì)對(duì)動(dòng)物遠(yuǎn)期的空間學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生負(fù)面影響[4]。消除丙泊酚對(duì)發(fā)育期神經(jīng)元的毒性損傷作用可能是防治其遠(yuǎn)期損害的關(guān)鍵，在此前提下，明確丙泊酚對(duì)發(fā)育期神經(jīng)元產(chǎn)生毒性損傷的分子機(jī)制顯得尤為重要。目前已知，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)具有促進(jìn)神經(jīng)元外生長(zhǎng)和凋亡的雙重作用。BDNF在神經(jīng)接頭的囊泡內(nèi)以前體(proneurotrophin BDNF, proBDNF)形式存在；在proBDNF釋放入突觸間隙后，其被間隙中的纖溶酶裂解為成熟型BDNF(mature BDNF，mBDNF)；纖溶酶主要由突觸前囊泡所釋放的組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)裂解纖溶酶原而生成[5]。mBDNF可觸發(fā)促存活信號(hào)通路，加快神經(jīng)突生長(zhǎng)，促進(jìn)突觸的成熟和穩(wěn)定[6]。而proBDNF激活促凋亡信號(hào)通路，抑制軸突生長(zhǎng)，誘發(fā)生長(zhǎng)錐崩潰和細(xì)胞凋亡[7]。因此，突觸間隙中proBDNF與mBDNF含量的比例在一定程度上決定神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的方向。突觸中tPA的釋放依賴(lài)于神經(jīng)活動(dòng)[8]，而全身麻醉藥物本身可抑制神經(jīng)活動(dòng)，但未知全麻藥物是否會(huì)影響突觸tPA的釋放。本研究旨在明確丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)的發(fā)育期新生小鼠海馬神經(jīng)元tPA釋放的影響，并且進(jìn)一步觀察加入外源性tPA能否逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)發(fā)育期神經(jīng)元的毒性損傷作用。

1資料與方法

1.1新生小鼠海馬神經(jīng)元的體外培養(yǎng)取新生BALBc小鼠(由中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)10只，斷頭取腦，分離海馬組織；用胰蛋白酶消化15 min后，加入含血清的培養(yǎng)液(90%DMEM、10%胎牛血清、0.2 mol/LL-谷氨酰胺、100 μg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素)終止消化，離心后棄上清液；加入含血清培養(yǎng)液并過(guò)濾；臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)，調(diào)整活細(xì)胞終濃度為5×104個(gè)/mL。將細(xì)胞種植于L-多聚賴(lài)氨酸包被的96孔板和放有圓形玻片的24孔板中，加入維持培養(yǎng)液[98%Neurobasal培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)、2%B-27 Supplement(美國(guó)Gibco公司)、0.2 mol/LL-谷氨酰胺、100 μg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素]，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2分組及處理將體外培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)元分為4組：對(duì)照組(C組)、丙泊酚組(Pro組)、tPA組和丙泊酚+tPA組(Pro+tPA組)。C組不做任何處理，Pro組在培養(yǎng)液中加入丙泊酚(批號(hào)：JR045，意大利AstraZeneca公司)，使丙泊酚終濃度為5、10、30 μmol/L，繼續(xù)孵育不同的時(shí)間(1 h、2 h、3 h、6 h)。tPA組在培養(yǎng)液中加入tPA，tPA終濃度為1 μmol/L，繼續(xù)孵育6 h。Pro+tPA組在培養(yǎng)液中同時(shí)加入tPA(終濃度1 μmol/L)及丙泊酚(終濃度10 μmol/L)，繼續(xù)孵育6 h。將各組海馬神經(jīng)元接種于6孔培養(yǎng)板，每組6孔，培養(yǎng)至第7天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況各組新生小鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天時(shí)，用胰酶消化，離心，棄上清液，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至(0.5～1.0)×106個(gè)/L，采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記試劑盒(江蘇南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣本收集10 000個(gè)細(xì)胞熒光信號(hào)，用FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況，計(jì)算凋亡率。

1.4采用Western印跡法檢測(cè)actived-caspase-3蛋白的表達(dá)各組新生小鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天時(shí)，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品以12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-SAGE)電泳分離，后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用含5%脫脂奶粉的l×TBST(Tris-buffered saline with Tween)稀釋actived-caspase-3抗體(稀釋度l∶800，美國(guó)CST公司)，常溫孵育1 h；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(稀釋度1∶5000，美國(guó)Santa Cruz公司)，常溫孵育30 min，曝光成像。以GAPDH為內(nèi)參。應(yīng)用Quantity One 5.0軟件(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行分析，actived-caspase-3的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值反映了actived-caspase-3蛋白的表達(dá)情況。

1.5采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA) 檢測(cè) tPA按tPA測(cè)定試劑盒(美國(guó)Gibco公司)說(shuō)明書(shū)操作。

2結(jié)果

2.1丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)的發(fā)育期新生小鼠海馬神經(jīng)元有毒性損傷作用丙泊酚與體外培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)元共同培養(yǎng)6 h， Pro組神經(jīng)元凋亡率較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，Pro組actived-caspase-3蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

與C組比較，*P<0.05圖1　與對(duì)照組相比較，丙泊酚(10 μmol/L, 6 h)處理顯著增加神經(jīng)元的凋亡率(圖A)和actived-caspase-3蛋白的表達(dá)水平(圖B)

2.2丙泊酚抑制發(fā)育期新生小鼠海馬神經(jīng)元釋放tPA不同終濃度的丙泊酚(5 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L)與體外培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)元共同培養(yǎng)6 h，均會(huì)抑制海馬神經(jīng)元釋放tPA(P<0.05)。丙泊酚(10 μmol/L)與體外培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)元共同培養(yǎng)不同的時(shí)間(0.5 h、1 h、4 h)，均會(huì)抑制海馬神經(jīng)元釋放tPA(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

與C組比較，?P<0.05圖2　丙泊酚以劑量(圖A)和時(shí)間(圖 B)依賴(lài)的方式增加體外培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)元的tPA水平

2.3加入外源性tPA可部分逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)發(fā)育期小鼠海馬神經(jīng)元產(chǎn)生的毒性損傷作用取體外培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)元，同時(shí)加入丙泊酚(10 μmol/L)和tPA(1 μmol/L)培養(yǎng)6 h后發(fā)現(xiàn)，tPA可顯著減輕降低丙泊酚所造成的神經(jīng)毒性損傷作用(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

與Pro組比較 *P<0.05圖3　加入外源性tPA(1 μmol/L)可抑制丙泊酚在新生小鼠海馬神經(jīng)元所誘發(fā)的凋亡率增加和actived-caspase-3蛋白的表達(dá)水平上調(diào)

3討論

本研究證實(shí)，丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)的發(fā)育期小鼠海馬神經(jīng)元有毒性損傷作用，使海馬神經(jīng)元凋亡率增加、actived-caspase-3蛋白表達(dá)水平增加。caspase-3處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，它是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子，其活化是凋亡進(jìn)入不可逆性階段的標(biāo)志。因此，actived-caspase-3蛋白表達(dá)水平增高與神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)。

既往研究[5]認(rèn)為，丙泊酚對(duì)新生小鼠海馬神經(jīng)元的毒性損傷作用部分是通過(guò)激動(dòng)GABAA受體使L型鈣離子通道開(kāi)放而介導(dǎo)的。最近的研究[8]表明，阻斷發(fā)育期小鼠神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)能夠抑制丙泊酚所引起的caspase 3表達(dá)上調(diào)，逆轉(zhuǎn)其對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)的抑制作用。p75NTR是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的低親和力受體，主要在神經(jīng)細(xì)胞早期發(fā)育過(guò)程中豐富表達(dá)，它可通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)以神經(jīng)細(xì)胞為主的增殖、凋亡、突觸建立和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成。因此，p75NTR有望成為消除(降低)丙泊酚對(duì)發(fā)育期神經(jīng)元的毒性損傷作用的有效靶點(diǎn)。然而，有關(guān)丙泊酚通過(guò)p75NTR抑制神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的突觸內(nèi)外分子機(jī)制尚不明確[9]，這就使得圍繞p75NTR上下游信號(hào)分子對(duì)丙泊酚神經(jīng)毒性損傷作用進(jìn)行系統(tǒng)防治存在一定困難。

由于全麻藥物可抑制神經(jīng)元沖動(dòng)發(fā)放，加之tPA的釋放依賴(lài)于神經(jīng)沖動(dòng)，本研究觀察了丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)元tPA釋放的影響。結(jié)果表明，丙泊酚可抑制發(fā)育期小鼠海馬神經(jīng)元釋放tPA。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，加入外源性tPA可部分逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)發(fā)育期海馬神經(jīng)元的毒性損傷。因此，驗(yàn)證了我們的假設(shè)：即丙泊酚通過(guò)抑制小鼠海馬神經(jīng)元突觸tPA釋放，進(jìn)而減少纖溶酶生成，造成proBDNF向mBDNF的轉(zhuǎn)化減少，導(dǎo)致proBDNF-p75NTR信號(hào)通路占優(yōu)勢(shì)，從而引起神經(jīng)元毒性損傷及與海馬區(qū)功能相關(guān)的遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力損害。所以，tPA有潛力成為防治丙泊酚對(duì)發(fā)育期神經(jīng)元毒性損傷的新的干預(yù)靶點(diǎn)。然而，本研究未驗(yàn)證小鼠體內(nèi)丙泊酚對(duì)tPA釋放的影響，也未研究加入外源性tPA能否在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)丙泊酚的神經(jīng)毒性損傷作用，對(duì)此尚有待進(jìn)一步研究。此外，proBDNF-p75NTR信號(hào)通路中的其他突觸內(nèi)外信號(hào)分子靶點(diǎn)在丙泊酚對(duì)發(fā)育期神經(jīng)元毒性損傷中的作用可能是今后的研究方向。

綜上所述，丙泊酚可對(duì)體外培養(yǎng)的發(fā)育期小鼠海馬神經(jīng)元產(chǎn)生毒性損傷作用，丙泊酚可抑制神經(jīng)元tPA的釋放，加入外源性tPA可部分逆轉(zhuǎn)丙泊酚的神經(jīng)毒性作用。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ]Satomoto M, Satoh Y, Terui K, et al. Neonatal exposure to sevoflurane induces abnormal social behaviors and deficits in fear conditioning in mice[J]. Anesthesiology, 2009, 110(3): 628-637.

[ 2 ]Paule MG, Li M, Allen RR, et al. Ketamine anesthesia during the first week of life can cause long-lasting cognitive deficits in rhesus monkeys [J]. Neurotoxicol Teratol, 2011, 33 (2): 220-230.

[ 3 ]Cattano D, Young C, Straiko MM, et al. Subanesthetic doses of propofol induce neuroapoptosis in the infant mouse brain[J]. Anesth Analg,2008,106(6): 1712-1714.

[ 4 ]Yu D, Jiang Y, Gao J, et al. Repeated exposure to propofol potentiates neuroapoptosis and long-term behavioral deficits in neonatal rats[J]. Neurosci Lett, 2013,534:41-46.

[ 5 ]Kahraman S, Zup SL, McCarthy MM, et al. GABAergic mechanism of propofol toxicity in immature neurons[J]. J Neurosurg Anesthesiol,2008, 20(4): 233-240.

[ 6 ]Pearn ML, Hu Y, Niesman IR，et al.Propofol neurotoxicity is mediated by p75 neurotrophin receptor activation[J]. Anesthesiology,2012, 116(2): 352-361.

[ 7 ]Ding Q, Ying Z, Gómez-Pinilla F. Exercise influences hippocampal plasticity by modulating brain-derived neurotrophic factor processing[J]. Neuroscience, 2011,192:773-780.

[ 8 ]Pang PT, Teng HK, Zaitsev E, et al. Cleavage of proBDNF by tPA/plasmin is essential for long-term hippocampal plasticity[J]. Science,2004,306(5695): 487-491.

[ 9 ]Sun Y, Lim Y, Li F, et al. ProBDNF Collapses Neurite Outgrowth of Primary Neurons by Activating RhoA[J]. PLoS One,2012, 7(4): e35883.

中圖分類(lèi)號(hào)R971+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

通訊作者梁超，E-mail: superwm226@aliyun.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81400930)；上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：20144Y0234)；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：2014ZSQN27)；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院優(yōu)秀青年計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：2015ZSYXQN19)