李彥瑋　于瑋　滕飛　韓麗媛　陳東　王偉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院病理科, 北京　100029)

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·論著·

北京地區(qū)2131例胃鏡活檢人群幽門螺桿菌感染分析

李彥瑋于瑋滕飛韓麗媛陳東王偉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院病理科, 北京100029)

摘要目的： 探討幽門螺桿菌(helicobacter pylori, Hp)感染在不同年齡、性別、取材部位的陽性檢出率。方法： 采用EnVision法對北京地區(qū)2131例門診患者的胃鏡活檢標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，按性別、年齡、取材部位不同分別計(jì)算陽性檢出率。結(jié)果： 采用免疫組化EnVision法檢測胃鏡活檢組織Hp感染，其染色背景清晰、質(zhì)量穩(wěn)定、流程標(biāo)準(zhǔn)化。北京地區(qū)2131例胃鏡活檢人群Hp感染陽性檢出率為35.6%，男性患者Hp感染陽性檢出率為40.9%，女性患者為30.5%。男性患者各年齡組Hp陽性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以30歲以下男性感染率最高(60.86%, P<0.05)；女性各年齡組陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各年齡組內(nèi)，男性患者陽性檢出率均高于女性(P<0.05)。胃小彎中部Hp感染陽性檢出率最高(36.0%)，胃竇大彎側(cè)最低(24.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 北京地區(qū)胃鏡活檢人群中男性Hp感染患者多于女性，以30歲以下男性感染率最高；且Hp感染好發(fā)于胃小彎中部。

關(guān)鍵詞EnVision兩步法;免疫組化;幽門螺桿菌;陽性檢出率

EnVision System for Detecting Helicobacter Pylori Infection in 2131 Gastroscopic Biopsy Cases in Beijing

LIYanweiYUWeiTENGFeiHANLiyuanCHENDongWANGWei

DepartmentofPathology,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100029,China

AbstractObjective： To explore the positive rate of detectinghelicobacterpylori(Hp) infection in different groups regarding gender, age and site of biopsy.Methods： Immunohistochemistry staining was conducted by EnVision two-step method for biopsy specimens from 2131 clinical patients in Beijing, and the positive rate of detectingHpinfection was evaluated regarding gender, age and site of biopsy, respectively.Results： The method of immunohistochemistry EnVision showed characteristics including clear background, stable quality and standard procedure for detectingHpinfection in gastroscopic biopsy. In 2131 patients, the overall positive rate of detectingHpinfection in 2131 gastroscopic biopsy cases in Beijing was 35.6%. The positive rate was 40.9% in male group while it was 30.5% in female group. There were significant differences regardingHpinfection positive rate of males among groups with different age level, and the infection rate in males younger than 30 years was the highest (60.86%,P<0.05). There was no significant difference regarding positive rate of females among groups with different age level (P>0.05). On each age level, the positive rate in males was higher than that in females (P<0.05). The positive rate ofHpinfection in the middle site of lesser curvature of stomach was the highest(36.0%), while that in greater curvature of gastric antrum was the lowest(24.0%), and the difference was significant(P<0.05).Conclusions： Among the gastroscopic biopsy in Beijing, theHpinfection positive rate in males was higher than that in females. And the peak positive rate of infection occurred in male younger than 30 years. Furthermore,Hpinfection was more common in the middle site of lesser curvature of stomach.

Key WordsEnVision two-step method;Immunohistochemistry;HelicobacterPylori;Positive rate

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)，屬彎曲桿菌目螺旋桿菌科螺旋桿菌屬，是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的細(xì)菌。1994年世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將Hp定為Ⅰ類致癌原[1]。大量研究資料[2-4]表明：Hp與消化道疾病密切相關(guān), 是慢性活動性胃炎和十二指腸潰瘍的致病因素，與胃潰瘍密切相關(guān)，與淺表萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃增生性息肉和胃十二指腸的黏膜相關(guān)性淋巴樣組織(MALT) 淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)，與胃癌可能有關(guān)。因此，Hp感染的快速、準(zhǔn)確的診斷對于臨床治療有著重要的意義。目前，有多種方法可以檢測Hp感染[5-7]，而使用全自動免疫組化染色胃鏡活檢組織中的Hp感染少有報(bào)道。本研究利用免疫組化EnVision兩步法檢測2131例門診患者胃鏡活檢組織的Hp感染結(jié)果，分析了Hp感染在不同性別、年齡段及取材部位的陽性檢出率差異，為Hp感染的治療提供診斷依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料2014年6月-2015年6月我院病理科接收的門診胃鏡檢查的活體組織共2131例，其中男性945例，年齡24~89歲，平均58.7歲；女性1186 例，年齡22~86 歲，平均59.6歲。其中30歲以下41例，男性23例，女性18例；30~49 歲96 例，男性53 例，女性43例；40~49 歲252例，男性131例，女性121例；50~59 歲673例，男性276例，女性397 例；60~69歲634例，男性258例，女性376例；70~79歲360例，男性159例，女性201例；80~89 歲75例，男性45例，女性30例。不同年齡段的男、女性兩組人群的年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋。

1.2試劑與儀器HpRTU一抗(兔多抗)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記RTU二抗、脫蠟修復(fù)一體液、DAB顯色劑、蘇木素、沖洗緩沖液(20×)均購于丹麥Dako公司；GS-無苯封片膠(格林,黑龍江)；組織切片機(jī)(Leica RM223,德國)；全自動免疫組化染色機(jī)(Dako Autostainer Link48,丹麥)；多頭顯微鏡(Leica Microsystems DM2500,德國)；顯微照相機(jī)(Leica Microsystems DM3000,德國)；烤片機(jī)(SAKURA, PS-52,日本)。

1.3免疫組化染色將甲醛固定、石蠟包埋的活檢胃鏡組織塊制成厚4 μm切片，60℃烤片30 min。由Dako Autostainer Link48全自動免疫組化染色機(jī)完成染色。免疫組化染色方法是EnVision兩步法。

組織脫蠟、修復(fù)程序：脫蠟修復(fù)一體液預(yù)熱至65℃，將切片置片架上，放入PT Link修復(fù)儀中。升溫至95℃，修復(fù)20 min，逐步降溫至65℃，完成脫蠟及修復(fù)。EnVision兩步法染色程序：清洗緩沖液沖洗；FLEX過氧化物酶封閉試劑封閉5 min；清洗緩沖液沖洗；Hp一抗孵育20 min；清洗緩沖液沖洗；FLEX/ HRP標(biāo)記二抗孵育20 min；清洗緩沖液沖洗5 min；DAB顯色10 min；清洗緩沖液沖洗；蘇木素復(fù)染5 min；蒸餾水沖洗；清洗緩沖液沖洗浸泡5 min；蒸餾水沖洗。

染色完成后，梯度乙醇脫水、透明、中性樹膠封片。以清洗緩沖液分別代替一抗和二抗作為染色的陰性對照。

1.4結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)高倍鏡下，以在胃黏膜上皮細(xì)胞表面或胞漿中找到散在或簇狀分布的彎曲短桿狀、逗點(diǎn)狀、“S”形或“C”形的棕黃色顆粒作為免疫組化染色陽性的判讀標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立判讀，結(jié)果取平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，依據(jù)數(shù)據(jù)類型的不同分別采取χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、方差分析。檢驗(yàn)水平α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1活檢組織Hp感染鏡下表現(xiàn)如圖1示，HE染色(圖1A)鏡下觀察Hp感染需要高倍鏡下仔細(xì)查找。而免疫組化染色(圖1C)清晰地顯示出Hp感染的部位，能夠協(xié)助判斷感染的陽性程度。與陰性結(jié)果(圖1B)相比，陽性染色結(jié)果的顯色與非陽性部位對比明顯，易于觀察。

A: Hp感染的HE染色結(jié)果(×400)；B: Hp感染的免疫組化染色結(jié)果，陰性(Envision兩步法，×400)；C: Hp感染的免疫組化染色結(jié)果，陽性(Envision兩步法，×400)圖1　胃鏡活檢組織Hp感染染色結(jié)果

2.2男女性Hp陽性檢出率的比較2131例患者中共檢出Hp感染623例，陽性檢出率為29.24%。其中945例男性患者中檢出Hp感染291例，陽性檢出率為30.79%。男性中，除30歲以下的陽性檢出率為60.86%，其他年齡組的陽性檢出率均不超過40%；男性各年齡組間陽性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1186例女性患者中檢出Hp感染332例，陽性檢出率為27.99%，陽性檢出率最高的是30~39歲組。女性各年齡組間陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各年齡組內(nèi)，男性患者Hp陽性檢出率高于女性(P<0.05)。見表1。

表1　不同年齡段男女性Hp感染陽性檢出率情況

2.3不同胃鏡活檢部位Hp感染陽性檢出率的對比按照悉尼標(biāo)準(zhǔn)[8]，本研究分析了2131例胃鏡活檢組織的胃竇大彎側(cè)、胃竇小彎側(cè)、胃體大彎側(cè)、胃體小彎中部、胃角5個(gè)部位的Hp陽性檢出率。其中，Hp感染陽性檢出率最高值在胃體小彎中部為36.0%，在胃竇大彎側(cè)最低為24.0%。胃體小彎中部的陽性檢出率明顯高于胃竇大彎側(cè)的陽性檢出率(P<0.05)。見表2。

圖2　不同取材部位Hp感染陽性檢出率

3討論

本研究挑選2014年6月—2015年6月在我院進(jìn)行胃鏡活檢的患者，均為北京市自然居民。研究結(jié)果顯示，在北京地區(qū)人群中，從2131例病例中檢出Hp感染623例，陽性檢出率為29.24%，明顯低于中國自然人群Hp的感染率(54.76%)[9]。其中，945例男性患者檢出Hp感染291例，陽性檢出率為30.79%。除30歲以下的陽性檢出率為60.86%，其他年齡組的陽性檢出率均不超過40%；男性各年齡組陽性檢出率差異明顯(P<0.05)。1186例女性患者檢出Hp感染332例，陽性檢出率為27.99%，陽性檢出率最高的是30~39歲組。女性各年齡組陽性檢出率差異不明顯(P>0.05)。在7個(gè)年齡組中，男性的陽性檢出率明顯高于女性的陽性檢出率(P<0.05)。2131例病例Hp感染的陽性檢出率為29.24%，與王其國[10]報(bào)道的感染率(56.84%)相比較低，與其男性Hp感染率顯著高于女性的結(jié)果一致。綜上所述，Hp感染存在著年齡及性別差異，男性感染率高于女性。

確定是否存在Hp感染，病理實(shí)驗(yàn)室常常首先對患者標(biāo)本進(jìn)行HE染色。HE染色結(jié)果需要在高倍鏡下仔細(xì)觀察，Hp感染部位可能有染色過程中的雜質(zhì)混在一起，引起識別困難。而在免疫組化染色法中，Hp感染的部位大多為深棕色，胞核為藍(lán)色，兩種顏色對比度大，更有利于觀察組織中的Hp感染[11]。本研究利用Dako Link48全自動免疫組化染色機(jī)按照EnVision兩步法[12-13]染色流程，檢測胃鏡活檢組織中的Hp感染，具有靈敏度高、背景清晰、質(zhì)量穩(wěn)定、染色結(jié)果可靠、流程標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)。在EnVision兩步法中，多聚葡聚糖骨架將第二抗體和辣根過氧化物酶(HRP)聯(lián)接成一個(gè)多聚體(即EnVision)。多聚葡聚糖骨架相當(dāng)于信號擴(kuò)大系統(tǒng)，可同時(shí)連接更多的鼠、兔來源的免疫球蛋白，因此提高了染色的敏感性。同時(shí)，EnVision 兩步法將傳統(tǒng)的第二抗體與第三抗體分別孵育優(yōu)化為1次孵育，既避免了內(nèi)源性生物素干擾，使得染色背景清晰，又極大地縮短了染色時(shí)間。

免疫組化染色法顯示有的菌體粗大成團(tuán)、成片或顆粒狀，并不像典型的單個(gè)彎曲短桿狀、逗點(diǎn)狀、“S”形或“C”形的棕黃色顆粒，可能由于Hp表面有許多種抗原物質(zhì)，如尿素酶、黏附素、鞭毛外鞘、Hsp60、Cag A和空包毒素等物質(zhì)，以及兔源抗Hp多克隆抗體識別并顯示出球形Hp而形成。免疫組化染色不僅可證實(shí)Hp感染, 還能檢測出球形Hp感染。因此，全自動免疫組化染色機(jī)EnVision兩步法檢測胃鏡活檢組織中Hp感染是病理實(shí)驗(yàn)室適用的檢測手段。

內(nèi)鏡檢查時(shí)，根據(jù)悉尼標(biāo)準(zhǔn)[8]，通常要包含5個(gè)部位，分別在胃竇距幽門2~ 3 cm 處選取胃竇大彎側(cè)和胃竇小彎側(cè)，距胃角大約4 cm處選取胃體大彎側(cè)，距賁門大約8 cm選取胃體小彎中部，胃角切跡及病變部位。從Hp感染陽性檢出率的分布來看，最高值在胃體小彎中部(36.0%)，其次為胃體大彎側(cè)(34.0%)，胃竇小彎側(cè)為(26.0%)，胃竇大彎側(cè)最低(24.0%)。胃體小彎中部的陽性檢出率明顯高于胃竇大彎側(cè)的陽性檢出率(P<0.05), 這與國外報(bào)道的Hp在胃內(nèi)分布胃竇較多而胃底、胃體較少的結(jié)果不大一致[14-15]，其原因尚不清楚。Hp感染在不同部位的分布差異，可能與宿主免疫反應(yīng)的多樣性、菌種類型有關(guān)，需進(jìn)一步研究來闡明。

綜上所述，北京地區(qū)胃鏡活檢人群中男性Hp感染患者多于女性，以30歲以下男性感染率最高，且Hp感染好發(fā)于胃小彎中部。

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中圖分類號R446.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

通訊作者王偉，E-mail: azwangwei6323@163.com