李軍1. 廣東工程職業(yè)技術學院，廣東 廣州 510520；2. 廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520

植物揮發(fā)性有機化合物研究方法進展

李軍1， 2
1. 廣東工程職業(yè)技術學院，廣東 廣州 510520；2. 廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520

植物產生的揮發(fā)性有機化合物在調節(jié)植物與周圍環(huán)境間的信息交流中起著重要作用，是生態(tài)系統(tǒng)中重要的化學信號物質。植物揮發(fā)性有機化合物在植物間的化學通訊、植物化感作用，植食性昆蟲的寄主選擇及天敵對植食性昆蟲的定位等生態(tài)過程中發(fā)揮著重要的作用，是植物和昆蟲長期協(xié)同進化、互相適應的結果。文章主要介紹植物揮發(fā)性有機化合物的收集方法——固相微萃取法和固體吸附法的原理、方法和應用注意事項等，比較了不同收集方法的優(yōu)缺點。同時介紹了植物揮發(fā)性有機物化合物常用的氣相色譜或氣相色譜-質譜聯用分析測定方法及植物揮發(fā)性有機化合物對昆蟲和天敵行為的影響等，并在此基礎上展望了今后植物揮發(fā)性有機化合物研究方法方向，為下一步開展植物揮發(fā)性有機化合物研究方法提供參考依據。

植物揮發(fā)性有機物；昆蟲行為；收集；功能

引用格式：李軍. 植物揮發(fā)性有機化合物研究方法進展［J］. 生態(tài)環(huán)境學報， 2016， 25（6）: 1076-1081.

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植物揮發(fā)性有機化合物（Volatile organic compounds，VOCs）是植物通過次生代謝途徑產生的低沸點、易揮發(fā)的小分子化合物，植物可以通過釋放揮發(fā)性有機化合物吸引害蟲天敵（Ton et al.，2007；Dudareva et al.，2013；Maeda et al.，2015；Goh et al.，2016；Wang et al.，2016），以避免或減輕害蟲的危害，同時植物揮發(fā)性有機化合物可在植物內部或植物間傳遞化學信息（Baldwin et al.，2006；Beckers et al.，2007；章金明等，2007；Delory et al.，2016；Hoe et al.，2016）。有關植物揮發(fā)性有機化合物的生物學功能研究已有幾十年的歷史，隨著研究技術和分析方法的提高，植物揮發(fā)性有機化合物的研究取得長足發(fā)展并得以應用，揭示了植物揮發(fā)性有機化合物在植物-昆蟲協(xié)同進化中的作用。本文就近年來植物揮發(fā)性有機化合物研究方法的主要進展進行綜述。

1　植物揮發(fā)性有機化合物的收集方法

過去，植物揮發(fā)物的提取技術多借鑒于食品風味化學的研究手段（Bicchi et al.，2000）。傳統(tǒng)的方法有溶劑提取、水蒸汽蒸餾提取、吸附提取等。隨后經過濃縮富集，得到可達到儀器檢測限的樣品?，F代植物揮發(fā)性有機化合物的提取方法有固相萃取、固相微萃?。⊿olid-phase microextraction， SPME）、超臨界流體萃取等，一般可不經過濃縮，直接進樣分析（Bicchi et al.，2000）。無論采用何種方法都是試圖鑒定植物揮發(fā)性有機化合物的真實組成，具體選擇何種收集及分析方法，取決于研究目的和研究對象。首先要確定揮發(fā)物的測定和收集是在實驗室還是在田間進行。為了說明植物揮發(fā)性有機化合物的生態(tài)學或生理學意義，多采用在田間收集植物的揮發(fā)性化合物，其收集方法要求方便、快速和簡單。與之相比，在實驗室條件下，其收集裝置較復雜，包括計算機控制的收集和采樣系統(tǒng)，但在實驗室條件下可減少污染，同時可精確控制溫度、濕度、光照強度和光周期等環(huán)境因素，有利于研究單一因子對植物揮發(fā)性化合物的影響，如蟲害對植物揮發(fā)物釋放的影響（Bicchi et al.，2000）。

目前植物揮發(fā)性有機化合物的收集方法主要有兩類：固相微萃取和固體吸附法。根據其使用動力與否，前者也叫做靜態(tài)頂空法，后者叫做動態(tài)頂空法。兩者的相同點是在取樣過程中對樣品進行了富集。

1.1靜態(tài)頂空法——SPME法

SPME法可以快速、靈敏、高效地對植物揮發(fā)物進行收集。SPME裝置包括手柄和萃取頭兩部分，其中萃取頭上有萃取纖維，萃取纖維可吸附揮發(fā)或半揮發(fā)的有機化合物。根據纖維的不同，可以萃取不同極性的揮發(fā)物。萃取程度不僅與纖維的厚度有關，還與待測物本身的化學性質有關，即與它們的分配系數有關。萃取揮發(fā)物后，可以直接插入氣相色譜-質譜聯用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）的進樣口熱解吸進樣。SPME可用于分析整株植物或者花、樹皮（Flamini et al.，2002；Rohloff et al.，2005）以及揮發(fā)油等（Tomova et al.，2005）。Aharoni et al.（2003）等發(fā)展了一種自動SPME-GC高通量分析揮發(fā)物組成的方法，研究了擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型、突變體及轉基因植株的花、葉子部位的揮發(fā)物。與其它萃取方法相比，SPME不需要有機溶劑的洗脫，具有簡單、環(huán)保和快捷的優(yōu)點。但SPME法不能吸附足夠量的未知化合物進行結構鑒定。研究表明隨著時間的增加，測定體系的溫度、濕度等均可發(fā)生變化，尤其在光照條件下，會影響到植物揮發(fā)性有機化合物的釋放速率。同時植物揮發(fā)性有機化合物的所有組分并不是在同一時間釋放，所以SPME法難以用于觀測植物揮發(fā)性有機化合物隨時間的變化規(guī)律（Tomova et al.，2005）。

1.2動態(tài)頂空法——固體吸附法

動態(tài)頂空法是將空氣作為載氣，源源不斷地通過樣品容器的頂部空間，再通過裝有吸附材料的吸附管，將樣品產生的揮發(fā)有機化合物收集到吸附管上。該方法相當于擴大了樣品容積，采樣量比靜態(tài)頂空法大。載氣既可以循環(huán)進行（密閉式），也可以排空（開放式），取樣時間取決于分析的檢測限，甚至可收集到足夠用于結構鑒定的樣品。在開放式系統(tǒng)里，通過空氣的不斷流動，可以消除在靜態(tài)頂空法存在的溫度、濕度等環(huán)境條件變化的問題，但所用的空氣必需經過干燥、過濾，防止帶來系統(tǒng)污染（Dettmer et al.，2002；Kos et al.，2013）。

在動態(tài)頂空法中，吸附劑是收集揮發(fā)物的關鍵。吸附劑是以碳為主的材料或者是人工合成的有特殊吸附特性的有機聚合物。從最初的活性炭到如今廣泛應用的Super-Q填料及各種混合填料，都在植物揮發(fā)性有機化合物的測定中得到應用（Kos et al.，2013）。吸附在填料上的揮發(fā)性有機化合物最后被定量的有機溶劑洗脫下來，再用氣相色譜儀進行測定。同時也可將吸附管直接放入氣相色譜進樣口進行熱解吸，這種方法相對而言需要更昂貴的儀器，但卻能有效地降低溶劑效應（Kos et al.，2013）。固體吸附法存在的主要問題是幾乎所有填料都無法完全吸附植物產生的揮發(fā)性有機化合物，特別是在研究蟲害誘導對植物揮發(fā)性有機化合物的影響時，要注意填料的選擇（Kumar et al.，2007；Schnitzler et al.，2004）。

1.2.1閉環(huán)吸附系統(tǒng)

閉環(huán)吸附系統(tǒng)是將植物組織或植物樣品放入密閉的玻璃器皿內，器皿內的空氣連續(xù)不斷地通過吸附管并在系統(tǒng)內循環(huán)，植物所產生的揮發(fā)性有機化合物在密閉容器中通過空氣的閉路循環(huán)而不斷得到吸附（Chen et al.，2003）。該方法比較適合植物揮發(fā)性有機化合物含量低的分析。如擬南芥的小花釋放的揮發(fā)性有機化合物明顯比香氣濃的花要少，所以要將多個離體的花放入干燥器中，才能收集到足夠量的樣品（Chen et al.，2003）。閉環(huán)系統(tǒng)的優(yōu)點是可同時收集多個植株的揮發(fā)物，但是為防止系統(tǒng)濕度發(fā)生大的變化，要經常釋放系統(tǒng)內的氣體。Chen et al.（2003）和Tholl et al.（2005）采用這種方法檢測到少量花中的萜烯類化合物。同時在研究利馬豆（Phaseolus lunatus）蟲害誘導的揮發(fā)物或離體的花產生的揮發(fā)性有機化合物時，也較多應用閉環(huán)吸附系統(tǒng)（Tholl et al.，2005；Dudareva et al.，2014）。

1.2.2“拉動”或“推-拉”系統(tǒng)

“拉動”或“推-拉”系統(tǒng)是通過動力將外部空氣帶入系統(tǒng)，將能被吸附劑吸附的植物揮發(fā)性有機化合物保留在收集管中。早期的“拉動”系統(tǒng)比較簡單，只是將吸附管放在植物或植物器官旁，沒有將植物進一步封閉（Burger et al.，1988）。在頂部開放的容器里，將植物或其某一部分放入容器中，空氣未經過濾就直接進入系統(tǒng)。Halitschke et al. （2000）用此法研究了蟲害誘導水培煙草的揮發(fā)物，該方法具有裝置簡單、經濟且便于攜帶的優(yōu)點，適合同時收集多個容器內的樣品，也適用于野外田間測定（Kessler et al.，2001）。該方法也可用于在固定的時間間隔內自動實時監(jiān)控植物揮發(fā)性有機化合物的變化。如測定紫茉莉（Mirabilis jalapa）48 h內揮發(fā)性有機化合物釋放的節(jié)律性（Effmert et al.，2005）以及蟲害誘導的玉米（Zea mays）揮發(fā)物的實時監(jiān)測（Degenhardt et al.，2000）。同理地，Dudareva et al.（2013）用該方法分別測定了金魚草（Antirrhinum majus）和仙女扇（Clarkia breweri）花的揮發(fā)性有機化合物?！袄瓌印被颉巴?拉”系統(tǒng)方法比較適合揮發(fā)物釋放量大的植物，將植物或植物器官封閉在玻璃容器中，外部空氣經過活性碳吸附和干燥劑干燥，再通過系統(tǒng)，可減少外來污染對檢測結果的影響（Dicke et al.，1999；Kunert et al.，2005）。

2　植物揮發(fā)性有機物化合物的測定方法

植物揮發(fā)性有機物化合物一般采用氣相色譜（Gas Chromatography，GC）或氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）分析測定（Dewulf et al.，2002；Merfort，2002；Kos et al.，2013；Impraga et al.，2016；Wintermans et al.，2016）。

2.1GC法

應用GC分析法，樣品既可以作為溶劑萃取液以分流或無分流的方式進樣，也可以熱解吸（250～300 ℃）的方式直接放入進樣口。目前也有將GC與熱脫附系統(tǒng)聯用的實時測定系統(tǒng)。同時，還有將植物的組織或器官放入微型瓶中，再將它放入改裝過的氣相進樣口中，直接加熱測定植物的揮發(fā)性有機化合物（Jurgens，2004）。但在熱脫附的過程要注意樣品的分解。通常選擇非極性的二甲基聚硅氧烷為固定相的色譜柱（如DB-1，DB-5，CPSil 5）。植物的揮發(fā)性有機物分離后可選擇各種檢測器。由于火焰離子化檢測儀（Flame ionization detector，FID）的線性和穩(wěn)定性比較好，是分析植物揮發(fā)性有機物常用的檢測器（Xu et al.，2002；Xin et al.，2004）。

2.2GC-MS聯用

質譜儀（Mass Spectrometer，MS）是植物揮發(fā)性有機物分析中常用的檢測器。定量模式可選用全掃描（Full Scan）也可用單離子檢測掃描（Single Ion Monitoring，SIM）模式，并針對每種化合物進行校正。對植物揮發(fā)性有機物的定性分析可使用一些常用色譜庫（如Wiley和NIST MS）或者用保留指數數據庫（如Kovats指數系統(tǒng)）。但單憑譜庫的數據或保留值均不能獲得十分滿意的結果，至少要在極性不同的兩根色譜柱上測定Kovats指數，并且待測物出現與標準品匹配的譜圖才能獲得可信的結果。用 CI源進行離子化比 EI源更容易獲得分子離子峰。相比植物揮發(fā)性有機物的結構鑒定，研究者更想知道化合物的手性，因為揮發(fā)物的旋光性與它們的化學信號功能密切相關（Bicchi et al.，2000；Schurig，2001；K?nig et al.，2004）。

2.3其它技術

由于植物揮發(fā)性有機化合物的組成和化學性質都很復雜，包含很多異構體，單靠GC或MS技術不足以解決植物揮發(fā)性有機化合物的鑒定問題。目前已經出現的新技術，如串連質譜（Tandem Mass Spectrometry）可以分析復雜的 GC峰，紅外光譜（Infrared Spectroscopy，IR）可以補充質譜的不足（Ragunathan et al.，1999；Granero et al.，2004）。同時，如果植物揮發(fā)性有機化合物在一根色譜柱上不能很好地分離，可使用二維毛細管氣相色譜分析。這種方法已在揮發(fā)物的測定中得到應用，Sj?din et al.（1996）用一根傳統(tǒng)的色譜柱和一根手性柱串連使用，分析了歐洲云杉（Picea abies）葉片中的單萜類碳水化合物。同時將兩根極性不同的柱串連使用，尤其適用于植物揮發(fā)油的化學成分分析（Adahchour et al.，2014）。此外，快速色譜技術（Fast Chromatographic Technique）（Matisová et al.，2003），GC與核磁共振波譜法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）聯用技術在植物揮發(fā)性有機化合物的鑒定中也得到了廣泛地應用（K?nig et al.，2004；Nojima et al.，2004）。

3　有關植物揮發(fā)性有機化合物對昆蟲和天敵影響的研究方法

3.1行為反應

利用“通管”嗅覺儀，可以測定昆蟲對植物揮發(fā)性有機化合物的趨性反應，包括昆蟲的取向以及其對某種揮發(fā)性有機化合物的響應時間。嗅覺儀分為“I”型兩通管（單刺激源）、“Y”型三通管（雙刺激源）以及多通管（多刺激源）（杜家緯，1988）。嗅覺儀可一臂接蟲籠，另幾臂接揮發(fā)性有機化合物刺激源。測定時，氣流由刺激源臂流向蟲籠臂，觀測昆蟲接受揮發(fā)性有機化合物刺激后的反應。揮發(fā)性有機化合物刺激源可以是活體植物（許寧等，1999）、揮發(fā)性粗提物（胡國文等，1994）、揮發(fā)物單體或將植物-植食性昆蟲放置在一起等（Veyrat et al.，2016）。植物揮發(fā)物的提取物或揮發(fā)物單體的載體一般為濾紙，為保證它們能長時間、穩(wěn)定地揮發(fā)，可用醫(yī)用毛細管作為載體。對于較大的昆蟲可采用較大的玻璃缸體代替蟲籠臂，從而解決裝置空間限制的問題（楊新根等，2006；章金明等，2007）。丁紅建等（1996）設計的四臂嗅覺儀結合紅外錄像設備，可用于研究夜行性昆蟲的活動節(jié)律。周強等（2003）用自行設計的“Y”型嗅覺儀測定了褐飛虱對水稻揮發(fā)物的行為反應。為了確定對昆蟲行為產生影響的具體植物揮發(fā)性有機化合物，在嗅覺儀的臂和氣味源管道之間裝有carbotrap-C或silica填料的吸附過濾管，混合氣通過這些填料后可以用來鑒定它的化學結構和對昆蟲行為的影響。同時這個裝置可以換用不同的填料，從而確定影響昆蟲行為的關鍵化合物（D'Alessandro et al.，2005）。

風洞是研究昆蟲性信息素的常用手段，它可較大程度地模擬室外真實環(huán)境，系統(tǒng)地研究昆蟲對植物揮發(fā)性有機化合物的行為反應，在植物-昆蟲間關系研究中也得到廣泛應用。徐濤等（2002）等采用自行設計的飛行箱測定不同誘導，如機械損傷、褐飛虱（Nilaparvata lugens）危害、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）危害等，處理水稻（Oryza sativa）植株及健康植株釋放的揮發(fā)物對褐飛虱行為反應的影響。顏增光等（2005）也利用風洞測試了棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）和煙青蟲（Heliothis assulta）取食煙草（Nicotiana tabacum）后誘導的揮發(fā)物對棉鈴蟲齒唇姬蜂（Campoletis chlorideae）的行為影響。

3.2觸角嗅覺電位反應

昆蟲觸角的嗅覺感受細胞在接受有效刺激后，細胞膜通透性會發(fā)生改變，導致膜內外電勢差的變化。利用電生理記錄儀記錄電勢差變化，并將其放大進行比較，可確定植物揮發(fā)性有機化合物對昆蟲嗅覺的刺激是否有效，并確定具有電生理活性的揮發(fā)性有機化合物的組分（杜永均等，1994；李為爭等，2015；石慶型等，2015）。觸角電位技術（Electroantennography，EAG）可記錄觸角某一（幾）類嗅覺感器全細胞或全觸角電位的變化，采用的電極一般為毛細管玻璃電極（吳峰等，1996）。單細胞記錄技術（Single-Cell Recording，SCR）可記錄感受細胞單細胞電位的變化，使用的電極是更細的玻璃微電極（杜永均等，1994）。用于 EAG測定的昆蟲大多為鱗翅目等觸角較大的昆蟲。SCR可突破昆蟲大小的限制，同時也能在 EAG研究的基礎上進一步揭示昆蟲嗅覺反應的本質。與普通嗅覺儀相比，通過測定嗅覺感受細胞電位來尋找活性成分的效率要高，且費用相對較低。石慶型等（2015）利用觸角電位儀（EAG）、觸角電位聯用儀（GC-EAD）、氣質聯用儀（GC-MS）及“Y”型嗅覺儀研究了玉米和棉鈴蟲幼蟲體表提取物的信息化合物。使用“Y”型嗅覺儀研究了玉米以及棉鈴蟲幼蟲體表揮發(fā)物對中紅側溝繭蜂成蟲（Microplitis mediator）行為反應的影響。研究表明，不同學習訓練的棉鈴蟲雄成蟲對苯乙醛和乙酸苯甲酯兩種關鍵花香氣味和綠葉氣味順-3-己烯-1-醇的 EAG反應值之間不存在顯著性差異。花香氣味伴隨食物資源的聯系性學習經歷，顯著增強了棉鈴蟲成蟲對花香氣味的選擇偏好（李為爭等，2015）。

4　展望

目前，植物揮發(fā)性有機化合物已成為植物間化學通訊、植物與昆蟲的協(xié)同進化等研究的焦點，其中植物揮發(fā)性有機物的收集和測定方法以及蟲害誘導的揮發(fā)性有機化合物的研究方法和技術在不斷發(fā)展，并且與儀器分析技術和分子生物學技術的發(fā)展緊密相連，在揮發(fā)性性有機化合物的組分鑒定，揮發(fā)性化合物的合成途徑、中間代謝產物及相關酶的功能，外源信號物質、蟲害誘導的化學信號在植物體內的傳遞等方面都有新的方法技術不斷涌現。同時植物揮發(fā)性化合物的研究更趨向于研究其生態(tài)學功能，并力求在野外田間條件下進行，以期為最終闡明植物揮發(fā)性化合物的生態(tài)學意義奠定基礎。

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Research Progress in the Volatile Organic Compounds of Plant

LI Jun1， 2
1. Guangdong Engineering Polytechnic， Guangzhou 510520， China； 2. Guangdong Academy of Forestry， Guangzhou 510520， China

Volatile organic compounds （VOCs） released from plant play an important role in mediating plants to communicate and interact with the environment. VOCs are one of the important chemical signals in the ecosystem. VOCs acting as signal chemicals also played an important role in plant communication， plant allelopathy， host selection of phytophagous insects， host orientation of natural enemies and so on. VOCs are consequences of long-term plant-insect interactions and coevolution. In this paper， we introduced and analyzed the two techniques for the collection of VOCs， the solid-phase microextraction （SPME） method and the absorbent method. We compared the principles， procedures， key points and examples of the two collection methods and pointed out their advantages and disadvantages. At the same time， we introduced analysis method of gas chromatography （GC） and gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） for analysis the chemical compounds of VOCs. At last， research methods related to analysis and determination the influence of volatiles compounds on insect herbivore and its natural enemy has also been introduced. Based on this， the research directions were put forward to plant volatile organic compounds in the future and providing useful information for further studies in the field.

plant volatile organic compounds； insect behavior； collection； function

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.06.023

Q149

A

1674-5906（2016）06-1076-06

廣東省重大科技專項計劃項目（2013A011404003）

李軍（1966年生），男，高級工程師，博士，主要從事生態(tài)學研究。E-mail: gdlj128@126.com

2016-06-12