蘇春淪, 王宏偉, 謝星光, 張　偉, 李孝剛, 王興祥, 戴傳超,*

1 南京師范大學生命科學學院, 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心, 江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室, 南京　210023 2 中國科學院土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室(南京土壤研究所), 南京　210008 3 中國科學院紅壤生態(tài)實驗站, 江西省紅壤生態(tài)研究重點實驗室, 鷹潭　335211

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內(nèi)生真菌與蒼術(shù)粉對連作花生根際微生物區(qū)系和微量元素的影響

蘇春淪1, 王宏偉1, 謝星光1, 張偉1, 李孝剛2,3, 王興祥2,3, 戴傳超1,*

1 南京師范大學生命科學學院, 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心, 江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室, 南京210023 2 中國科學院土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室(南京土壤研究所), 南京210008 3 中國科學院紅壤生態(tài)實驗站, 江西省紅壤生態(tài)研究重點實驗室, 鷹潭335211

摘要:通過盆栽試驗，研究了內(nèi)生真菌擬莖點霉B3(Phomopsisliquidambari)及蒼術(shù)(Atractylodeslancea)粉聯(lián)合施用對連作花生根際土壤微生物區(qū)系、酶活性及有效態(tài)微量元素(Mo、B、DTPA-Fe、Zn、Cu、Mn)含量的影響。結(jié)果表明：內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理比內(nèi)生真菌B3處理的莢果和秸稈產(chǎn)量分別增加10.28%和14.11%，內(nèi)生真菌B3處理與正常施肥相比顯著提高了根瘤數(shù)量、莢果和秸稈產(chǎn)重，各處理組與正常施肥對照相比分枝數(shù)和根長無顯著差異。B3處理與對照相比顯著提高了種子期、結(jié)莢期和成熟期根際土壤可培養(yǎng)細菌和放線菌數(shù)量，B3和蒼術(shù)粉復合處理與對照相比顯著提高種子期、花期和成熟期可培養(yǎng)真菌和放線菌數(shù)量；細菌DGGE指紋圖譜聚類分析表明， B3和蒼術(shù)粉復合處理相對于正常施肥處理，顯著改變種子期、苗期、花期和成熟期花生根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，同時苗期、花期和結(jié)莢期的細菌條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)也有所提高，真菌DGGE指紋圖譜聚類分析表明，B3和蒼術(shù)粉復合處理對真菌群落影響較大，除種子期以外的生育期真菌條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)都有明顯提高，花期真菌群落結(jié)構(gòu)變化最大，相似度僅為49.6%。花生關(guān)鍵生育期(花期和結(jié)莢期)根際土壤脲酶和蔗糖酶活性B3處理和復合處理都顯著高于正常施肥對照，促進了連作花生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動。B3和蒼術(shù)粉復合處理促進了花生生長發(fā)育必需微量元素Mo、B、Fe、Zn、Mn的活化，花生葉片和籽粒中微量元素Mo、B、Fe的積累顯著增加。研究結(jié)果表明，內(nèi)生真菌和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用能有效改善連作花生根際微生物區(qū)系，提高土壤酶活性，促進微量元素的活化和吸收，對緩解花生連作障礙具有重要意義。

關(guān)鍵詞：花生；蒼術(shù)；內(nèi)生真菌；微生物區(qū)系；PCR-DGGE；微量元素

There were no significant differences in peanut root length and branch numbers between the treatments and the control. In addition, the B3 treatment resulted in significantly more culturable bacteria and actinomycetes in peanut rhizosphere soil at seed, podding, and mature growth stages than did the control. The B3 andA.lanceapowder treatment resulted in a significantly larger population of culturable fungi and actinomycetes at seed, flowering, and mature growth stages than the control. 16S rDNA PCR-DGGE analysis showed that the B3 andA.lanceapowder treatment significantly changed the soil bacteria community structure at seed, seedling, flowering, and mature growth stages and increased bacterial diversity during the seedling, flowering, and podding growth periods compared with the control, as estimated by the Shannon and band number indices. The B3 andA.lanceapowder and B3 treatments markedly increased the activities of soil urease and sucrase during the flowering and podding growth periods, which promote material cycle and energy flow in the monoculture peanut ecosystem.

It is worth noting that B3 andA.lanceapowder activated essential trance elements (Mo, B, Fe, Zn, and Mn) in peanut rhizosphere soil at various growth stages and dramatically promoted absorption of Mo, B, and Fe in peanut leaves and kernels, particularly Mo and Fe. The results of this study suggested that the combined application of endophytic fungi andA.lanceapowder could effectively improve the continuous peanut cropping soil microflora, promote enzyme activity, and increase the absorption of important trace minerals. These effects are important for minimizing or even eliminating obstacles associated with continuous peanut cropping.

花生是中國重要的油料作物，占中國油料市場份額的三分之一左右，作為中國南方低丘紅壤區(qū)的主要經(jīng)濟作物和油料作物，近20年來種植面積約占夏季旱作面積的60%—85%。但是，連作障礙嚴重制約了我國花生種植及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，長期連作導致花生總生物量、莢果產(chǎn)量和品質(zhì)顯著降低[1- 3]。微生物區(qū)系失衡是導致花生連作障礙的重要原因之一，有學者認為連作障礙的根本原因是根際土壤微生物結(jié)構(gòu)失衡和惡化[4]。王小兵等研究發(fā)現(xiàn)紅壤旱地長期連作花生導致根際微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)趨于單一，主要以鞘氨醇單胞菌屬為主，花生病原青枯菌數(shù)量增加，群落多樣性豐富度指數(shù)及香農(nóng)-威納指數(shù)降低，土壤微生物區(qū)系變劣[5]，Chen等人利用克隆文庫分析了連作花生土壤細菌群落變化發(fā)現(xiàn)，土壤有益微生物如伯克氏菌目(Burkholderiales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)等種群簡單化是導致花生連作減產(chǎn)的主要因素[6]。連作花生往往導致土壤酶活性降低，土壤中有效養(yǎng)分減少，最終導致花生連作障礙。黃玉茜等發(fā)現(xiàn)北方花生主產(chǎn)區(qū)連作6a與正茬相比顯著降低了脲酶、蔗糖酶等的活性，分別下降20.42%和63.09%，土壤環(huán)境惡化，連作障礙嚴重[7]。

Fe、Mn、Cu、Zn、B 和 Mo是豆科植物生長發(fā)育過程中必需元素，它們參與氮、磷和碳代謝以及許多酶系統(tǒng)活動，缺乏時嚴重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[8]。土壤微量元素比例失調(diào)與連作障礙的產(chǎn)生有直接密切的關(guān)系，大豆根際土壤中鋅、鉬和硼含量隨連作年限增長而下降，連作12a鉬、硼含量比正茬分別下降了54.84%和22.92%[9]。番茄連作4a根際和非根際土壤有效態(tài)銅含量分別減少43.0%和34.8%，連作10a有效態(tài)鋅、錳和鐵含量嚴重缺乏，連作年限越長，土壤質(zhì)量下降越顯著[10]。目前解決微量元素不足的主要措施是葉面噴施或者基施微肥[11- 13]，雖然在一定程度上促進花生增產(chǎn)，但是這些措施無疑增加了生產(chǎn)成本和勞動量。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，連作花生土壤中施加內(nèi)生真菌擬莖點霉(Phomopsisliquidambari)B3可以顯著提高花生莢果產(chǎn)量，花生根瘤數(shù)量增加30%，同時改善了連作花生土壤環(huán)境，在一定程度上緩解花生連作障礙[14]。袁志林等人對內(nèi)生真菌B3促生機理研究發(fā)現(xiàn)，B3菌株能分泌IAA、ABA和VB1，同時富含亞油酸和多種游離氨基酸[15]，B3菌株還能與水稻建立共生關(guān)系促進其氮素吸收與積累[16- 17]。藥材蒼術(shù)與花生間作作為一種新穎的緩解花生連作障礙的套種模式，在江西花生產(chǎn)區(qū)取得了一定成效，間作降低了連作土壤中酚酸物質(zhì)的含量，提高了土壤脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性，PLFA分析發(fā)現(xiàn)花生根際土壤中革蘭氏陰性細菌種群增加了31.2%—79.9%，花生產(chǎn)量和土壤微生態(tài)環(huán)境都得到顯著改善[18- 19]。此外，蒼術(shù)間作花生同時接種內(nèi)生真菌B3能夠顯著減少土壤霉菌數(shù)量、增加土壤細菌數(shù)量和土壤蔗糖酶活性，增加花生超氧化物歧化酶活性，同時花生產(chǎn)量進一步提高，比單獨接種B3 處理高28%[20]。但是，蒼術(shù)與花生的生長時期不同，江西花生主產(chǎn)區(qū)3—6月降水較多，不利于蒼術(shù)生長，而且隨著機械化生產(chǎn)的普及，蒼術(shù)間作花生在生產(chǎn)操作中遇到一定困難，因為蒼術(shù)為多年生草本植物，商品化一般以三年生根莖為佳[21]，而花生播種之前都要進行機械化翻地，未收獲的蒼術(shù)影響了機械化生產(chǎn)。此外，蒼術(shù)根莖富含茅術(shù)醇、β-桉油醇、蒼術(shù)酮等倍半萜類化合物，而萜類化合物對枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.)等病原菌具有抗菌和抑制孢子萌發(fā)的作用[22]。因此，本研究的目的：探討蒼術(shù)粉是否可以代替蒼術(shù)活體植株發(fā)揮作用，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉是否可以發(fā)揮協(xié)同作用緩解連作花生障礙，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理對連作花生土壤微環(huán)境特別是微量礦質(zhì)營養(yǎng)和微生物區(qū)系的影響。

1材料與方法

1.1供試材料

花生盆栽土壤取自江西鷹潭市中國科學院紅壤生態(tài)實驗站(北緯28°13′，東經(jīng)116°55′)周邊一分場示范基地，為第四紀紅黏土發(fā)育的紅壤，連作花生10a，土壤基本理化性質(zhì)：有機質(zhì)13.35g/kg，全氮0.75 g/kg，堿解氮17.50mg/kg，速效磷62.67 mg/kg，速效鉀260.64 mg/kg，pH5.6(1∶5水)。

供試植物內(nèi)生真菌B3菌株(Phomopsisliquidambari)分離自大戟科重陽木(Bischofiapolycarpa)莖內(nèi)皮，屬于擬莖點霉屬，保藏于南京師范大學江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室。將保藏的B3菌株轉(zhuǎn)接至新鮮馬鈴薯固體培養(yǎng)基上25℃活化5d，用接種針刮起少量菌絲轉(zhuǎn)移至100mL液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，180 r/min 25 ℃ 培養(yǎng)5d，濾紙過濾后獲得濕菌絲，使用去離子水清洗3次，抽濾后用于花生盆栽試驗。

蒼術(shù)粉：取適量蒼術(shù)(Atractylodeslancea)干燥根莖機械粉碎至粉末?；ㄉ?Archishypogaea) 為江西省鷹潭市常規(guī)品種“贛花5號”。

1.2試驗設(shè)計

花生盆栽試驗布置于南京師范大學植物園(北緯31°14′，東經(jīng) 118°22′)，試驗共4個處理，每個處理10次重復，處理分別為：正常施肥(CK)、正常施肥和施加內(nèi)生真菌B3(A)、正常施肥和施加蒼術(shù)粉(B)、正常施肥和施加內(nèi)生真菌B3、蒼術(shù)粉(C)。正常施肥包括尿素1.5g、鈣鎂磷肥4g、氯化鉀肥1.5g、硼砂0.1g、有機肥50g。蒼術(shù)粉2g/盆、內(nèi)生真菌B3菌絲約2.5g/盆。試驗盆缽高23cm，直徑25cm，每盆裝連作紅壤8kg，花盆埋入土壤中，距地面5cm，隨機區(qū)組排列。按照試驗設(shè)計將肥料、蒼術(shù)粉、內(nèi)生真菌B3菌絲與土壤拌勻后，于2013年5月13播種花生，每盆4粒種子，花生出苗后每盆留2株幼苗，正常田間管理。

分別在播種前1d(5.12)、種子期(5.18)取盆栽土壤，在苗期(6.11)、花期(7.2)、結(jié)莢期(8.15)和成熟期(9.18)取花生根際土壤用于微生物數(shù)量、多樣性，土壤酶活和有效態(tài)微量元素分析，根際土壤按照張超等人[23]的方法進行采集，即先取出具有花生完整根系的土體，輕輕抖落大塊土壤，然后用力將附著在根系的土壤抖落并收集到塑料自封袋中。成熟期花生植株用于籽粒和葉片微量元素分析及農(nóng)藝性狀測定。根際土壤立即帶回實驗室，使用UltraCleanTMSoil DNA Isolation試劑盒(Mo BIO Laboratories) 提取土壤總DNA，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。剩余土樣于4℃保存，用于微生物數(shù)量、土壤酶活和有效態(tài)微量元素分析。

1.3測定項目與方法

1.3.1土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量

采用稀釋平板法分離根際土壤中的細菌、真菌和放線菌，細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離，真菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基分離，放線菌采用高氏一號培養(yǎng)基分離。

1.3.2土壤細菌、真菌PCR-DGGE

使用UltraCleanTMSoil DNA Isolation試劑盒(Mo BIO Laboratories) 提取土壤總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR-DGGE引物和擴增條件見表1[24]，反應體系為50μL: 2× Taq PCR MasterMix(Taq DNA polymerase 0.05units/μL,MgCl24mmol/L,dNTPs 0.4mmol/L，Beijing Zoman Biotechnology Co.,Ltd.) 25μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，ddH2O 21μL，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測。

a(CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G); b(CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCG GCC CGC CGC CCC CGC CCC)

變性梯度凝膠電泳(DGGE)使用CBS-DGGE電泳系統(tǒng)(CBS Scientific Co.)進行。細菌使用8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度35%—65%，真菌使用6%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度20%—50%，電泳緩沖液為1×TAE(40 mmol/L Tris，40 mmol/L 冰乙酸，1. 0 mmol/L EDTA pH 8.0)，PCR產(chǎn)物上樣量20μL， 60℃100 V 電泳12 h，電泳結(jié)束后EB 染色20 min，UVP凝膠影像分析系統(tǒng)拍照。

DGGE指紋圖譜使用GelcomparⅡ軟件分析[25]，聚類分析使用UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic averages) 方法。用于計算群落生物多樣性的指標有: 1) Shannon 指數(shù)H=-∑(ni/N)ln(ni/N)，式中,ni為單一條帶的峰面積；N為所有峰的總面積。 2) 條帶數(shù)量S，為所在泳道的條帶總數(shù)目[26]。

1.3.3土壤酶活性

土壤脲酶采用苯酚鈉比色法，其活性以37℃條件下24h后1g風干土中NH3-N的毫克數(shù)表示；土壤蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法，其活性以37℃條件下24h后1g 風干土中葡萄糖的毫克數(shù)表示。

1.3.4土壤有效態(tài)微量元素含量

花生根際土壤有效態(tài)Fe、Zn、Cu、Mn采用DTPA(pH7.30)浸提法[27]，土液比1∶5，用原子吸收分光光度計測定(AA-6300C 日本島津SHIMADZU JAPAN)；土壤有效鉬采用pH3.3草酸銨-草酸溶液超聲波溶樣、APDC-MIBK萃取，石墨爐原子吸收法測定[28](GFA-EX7i日本島津SHIMADZU JAPAN)；土壤有效硼采用沸水浸提姜黃素比色法測定[29]。

1.3.5花生葉片及籽粒微量元素含量

花生葉片和籽粒機械粉碎過100目篩，準確稱取1.0000g樣品于瓷坩堝中，預灰化至無煙后轉(zhuǎn)移至高溫馬弗爐，緩慢加熱至500℃，干灰化保持4h?；一蠼抵潦覝睾蠹?mL濃硝酸使樣品完全溶解，最后定容至50mL，搖勻待測。同時做好空白對照。全Fe、Zn、Cu、Mn使用原子吸收分光光度計測定[30](AA-6300C 日本島津SHIMADZU JAPAN)，全鉬采用石墨爐原子吸收法測定(GFA-EX7i日本島津SHIMADZU JAPAN)[31]，全硼采用甲亞胺比色法測定[32]。

1.3.6花生農(nóng)藝性狀

花生結(jié)莢期和成熟期取樣，測定花生的株高、主根長、分枝數(shù)、根瘤數(shù)、莢果數(shù)、莢果干重和秸稈干重。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用Office EXCEL軟件分析各組數(shù)據(jù)的平均值和標準差，繪制圖形。應用SPSS 13.0軟件進行方差分析(One-Way ANOVA)，不同數(shù)據(jù)組間顯著性差異采用Duncan法檢驗(P=0.05)。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌B3、蒼術(shù)粉處理對花生農(nóng)藝性狀的影響

從表2可知，施加內(nèi)生真菌B3處理的花生主要農(nóng)藝指標都高于正常施肥處理(CK)，根瘤數(shù)、莢果數(shù)量、莢果干重和秸稈干重達到顯著水平，分別提高65.45%、83.67%、47.33%和40.49%。施加蒼術(shù)粉處理與正常施肥處理相比并沒有顯著提高根瘤和莢果數(shù)量，但顯著提高了莢果和秸稈干重，施加內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理比施加內(nèi)生真菌B3處理增產(chǎn)效果更顯著，莢果干重和秸稈干重分別提高10.28%和14.11%，說明蒼術(shù)粉可以協(xié)助內(nèi)生真菌B3發(fā)揮作用緩解花生連作障礙，促進花生產(chǎn)量的提高。根瘤的生物固氮作用是花生氮素的主要來源之一，施加內(nèi)生真菌B3處理與正常施肥處理相比顯著提高了花生根瘤數(shù)量，值得注意的是，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理在一定程度上減少了根瘤數(shù)量，但是花生產(chǎn)量未受到影響，這可能與花生與根瘤菌定殖之間對營養(yǎng)的供需平衡有關(guān)，適量的根瘤在消耗較少能量的同時為花生提供生長發(fā)育所需的氮源。

CK：正常施肥conventional fertilizer treatment；A：正常施肥和施加內(nèi)生真菌B3 endophytic fungi B3 and conventional fertilizer treatment；B：正常施肥和施加蒼術(shù)粉Atractylodeslanceapowder and conventional fertilizer treatment；C：正常施肥、施加內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉endophytic fungi B3,Atractylodeslanceapowder and conventional fertilizer treatment;同一列不同字母表示處理間顯著差異(P<0.05,Duncan多范圍檢驗)

2.2內(nèi)生真菌B3、蒼術(shù)粉處理對連作花生根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響

總的來看，苗期和結(jié)莢期花生根際土壤細菌數(shù)量處于相對較高水平，種子期、花期和成熟期細菌數(shù)量處于相對較低水平(表3)。內(nèi)生真菌B3處理與對照(CK)相比顯著提高種子期、結(jié)莢期和成熟期細菌數(shù)量，分別提高了16.02%、40.86%和23.53%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用與施加蒼術(shù)粉處理相比，除苗期外的其他生育期都顯著提高細菌數(shù)量，結(jié)莢期達到最高值(8.60±0.56)×107CFU/g干土，提高了52.75%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用與施加內(nèi)生真菌B3處理相比效果基本一致，種子期和苗期細菌數(shù)量無顯著差異，花期和成熟期細菌數(shù)量前者高于后者，結(jié)莢期細菌數(shù)量后者高于前者。

從表3可知，種子期、苗期和成熟期花生根際土壤放線菌數(shù)量處于較低水平，花期和結(jié)莢期放線菌數(shù)量處于較高水平。內(nèi)生真菌B3處理與對照(CK)相比顯著提高種子期、結(jié)莢期和成熟期放線菌數(shù)量，分別提高了10.69%、42.15%和32.87%，苗期和花期放線菌數(shù)量無顯著差異。蒼術(shù)粉處理對根際土壤放線菌數(shù)量無顯著影響，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用與正常施肥相比，在種子期、花期和成熟期顯著提高放線菌數(shù)量，分別提高了15.72%、50.56%和76.92%。

從表3可知，苗期花生根際土壤真菌數(shù)量達到最高水平，隨著花生的生長真菌數(shù)量逐漸降低減少，成熟期顯著降低。內(nèi)生真菌B3處理與正常施肥對照(CK)相比顯著提高苗期、結(jié)莢期和成熟期真菌數(shù)量，分別提高了61.17%、95.63%和35.77%，種子期和花期差異不顯著。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用與蒼術(shù)粉處理相比顯著提高了種子期、花期、結(jié)莢期和成熟期真菌數(shù)量，分別提高了24.29%、60.11%、130.77%和45.30%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用與施加內(nèi)生真菌B3處理相比，在花期前者真菌數(shù)量高于后者，在結(jié)莢期后者高于前者，成熟期無顯著差異。

表3內(nèi)生真菌擬莖點霉B3和蒼術(shù)粉對花生根際可培養(yǎng)細菌、放線菌、真菌數(shù)量的影響

Table 3Effects of endophytic fungi B3 andAtractylodeslanceapowder on culturable bacteria, actinomycetes and fungi in peanut rhizosphere soil

2.3內(nèi)生真菌B3、蒼術(shù)粉處理對連作土壤微生物區(qū)系的影響

(1)細菌的DGGE指紋圖譜聚類分析(圖1)表明，內(nèi)生真菌B3處理與正常施肥相比細菌群落結(jié)構(gòu)在種子期、苗期和結(jié)莢期發(fā)生了顯著變化，花期和成熟期CK和A處理聚為一類，相似度分別為80.4%和80.7%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用相對于正常施肥處理，顯著改變了種子期、苗期、花期和成熟期花生根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)。由圖1可知，種子期A和C處理聚為一類，種子期、花期和結(jié)莢期B和C處理聚為一類，說明蒼術(shù)粉處理與內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合處理對根際土壤細菌微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較為相似，蒼術(shù)粉協(xié)同內(nèi)生真菌B3改善了花生植株根際微生態(tài)環(huán)境。

從表4可知，花生根際土壤細菌群落多樣性分析表明，內(nèi)生真菌B3處理與正常施肥處理相比條帶數(shù)和Shannon指數(shù)都有所提高，花期和結(jié)莢期細菌Shannon指數(shù)達到最高，分別為3.63和3.71，比正常施肥處理提高23.47%和20.45%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用與內(nèi)生真菌B3處理相比條帶數(shù)更多，在花生關(guān)鍵生長期花期和結(jié)莢期分別提高6.25%和9.09%，Shannon指數(shù)在種子期、苗期和結(jié)莢期略有提高。

S: 條帶數(shù)Band number,H: Shannon指數(shù)Shannon index

(2)真菌DGGE指紋圖譜聚類分析(圖2)表明，種子期和苗期內(nèi)生真菌B3處理與正常施肥處理花生根

際土壤真菌群落聚為一類，相似度分別為93.5%和81.7%，結(jié)莢期和成熟期蒼術(shù)粉處理和正常施肥處理的真菌群落結(jié)構(gòu)較相似，相似度分別為92.4%和91.7%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用與正常施肥處理相比，花期真菌群落相似度僅為49.6%，說明真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了強烈的變化。

由表4可知，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用處理與內(nèi)生真菌B3處理相比，種子期、結(jié)莢期和花期的Shannon指數(shù)分別提高11.50%、9.87%和10.36%，真菌群落多樣性略有改善。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)和施用處理與蒼術(shù)粉處理相比也提高了種子期、苗期和花期真菌群落多樣性，Shannon指數(shù)分別提高17.21%、33.19%和45.70%。成熟期真菌群落多樣性較高，這與土壤中凋落物增加有關(guān)，多種多樣的真菌可以有效降解凋落物，促進養(yǎng)分循環(huán)。

2.4內(nèi)生真菌B3、蒼術(shù)粉處理對連作土壤酶活性的影響

2.4.1脲酶

從圖3可知，播種前及種子期花生盆栽土壤脲酶活性處于較低水平，隨著花生生長至苗期，脲酶活性逐漸升高，花期脲酶活性達到最高值，結(jié)莢期至成熟期又逐漸降低。內(nèi)生真菌B3處理顯著提高了花期、結(jié)莢期和成熟期脲酶活性，與正常施肥(CK)相比分別提高15.58%、18.86%和15.99%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理與蒼術(shù)粉處理(B)相比顯著提高了脲酶活性，同時效果優(yōu)于單獨施加內(nèi)生真菌B3處理，與施加內(nèi)生真菌B3相比花期、結(jié)莢期和成熟期脲酶活性分別提高5.83%、3.07%和4.45%。

2.4.2蔗糖酶

從圖3可知，花生盆栽土壤蔗糖酶活性從種子期開始升高，苗期、開花期至結(jié)莢期都保持較高活性，結(jié)莢期蔗糖酶活性達到最高值，成熟期活性有所下降，但依然保持較高水平。內(nèi)生真菌B3處理顯著提高花生從種子萌發(fā)至成熟收獲整個生育期的蔗糖酶活性，分別提高了37.99%、93.60%、174.83%、51.27%和53.37%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理苗期和成熟期蔗糖酶活性低于單獨內(nèi)生真菌B3處理，但是在花生生長關(guān)鍵期花期和結(jié)莢期顯著提高了蔗糖酶活性，分別提高了19.00%和18.49%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理與蒼術(shù)粉處理(B)相比顯著提高蔗糖酶活性。

2.5連作花生根際土壤有效態(tài)微量元素的動態(tài)變化

由圖4可知，內(nèi)生真菌B3處理在花生苗期、花期和結(jié)莢期顯著提高了土壤中有效鉬含量，結(jié)莢期有效鉬的含量最高，達到0.32±0.03mg/kg風干土。花期和結(jié)莢期內(nèi)生真菌B3處理比對照(CK)提高了49.87%和39.85%，成熟期除了CK外各處理之間無顯著差異，有效鉬含量在0.15—0.18 mg/kg風干土之間。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理與蒼術(shù)粉處理相比顯著促進苗期和花期土壤中鉬的活化，苗期和花期有效鉬含量分別提高72.25%和34.39%，與內(nèi)生真菌B3處理相比無顯著差異。

由圖4可知，花生根際土壤有效硼的變化趨勢較復雜，縱觀花生整個生育期，內(nèi)生真菌B3處理對土壤中硼的活化影響較小，甚至在種子期和苗期低于對照組。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理與蒼術(shù)粉處理相比顯著增加苗期和結(jié)莢期有效硼含量，分別提高34.39%和19.85%。在花生生長前期，施加內(nèi)生真菌B3的基礎(chǔ)上添加蒼術(shù)粉更有利于土壤硼的活化，為花生后期生長發(fā)育提供充足的硼營養(yǎng)。

由圖4可知，連作花生土壤有效鐵含量較高，播種前有效鐵含量在23.27—25.83mg/kg風干土。處理后至苗期有效鐵有一定程度增加，含量在39.67—43.13mg/kg風干土。內(nèi)生真菌B3處理與對照(CK)相比顯著提高了花期土壤有效鐵的含量，從苗期到花期一直維持在較高水平，為花生光合作用提高了充足鐵營養(yǎng)。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理與蒼術(shù)粉處理相比顯著提高了花期和結(jié)莢期土壤有效鐵的含量，分別提高了35.07%和45.53%，蒼術(shù)粉協(xié)同內(nèi)生真菌B3活化土壤中的鐵，在結(jié)莢期為花生提供了源源不斷的鐵營養(yǎng)。

由圖4可知，內(nèi)生真菌B3處理與對照(CK)相比在花期顯著提高了土壤有效鋅的含量，對鋅的活化影響不大。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理在花生種子期迅速顯著地提高了有效鋅含量，與蒼術(shù)粉處理相比顯著提高了花期和結(jié)莢期有效鋅含量，分別提高了38.33%和98.14%。

由圖4可知，連作花生土壤中有效銅的含量在整個生育期變化不大，基本與播種前水平一致。內(nèi)生真菌B3處理對有效銅基本無影響，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理在結(jié)莢期和成熟期與蒼術(shù)粉處理相比顯著提高了有效銅含量，分別提高50.68%和37.26%。

由圖4可知，花生根際土壤有效錳含量在花期和結(jié)莢期升高，內(nèi)生真菌B3處理與對照(CK)相比顯著提高了苗期和花期土壤有效錳含量，分別提高了14.76%和22.60%。內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理與蒼術(shù)粉處理顯著提高了苗期和花期有效錳含量，與內(nèi)生真菌B3處理相比顯著提高苗期和結(jié)莢期有效錳含量。

2.6花生葉片和籽粒中微量元素的含量

由表5可知，蒼術(shù)粉處理與正常施肥對照(CK)相比促進了葉片中Fe和Zn的積累，內(nèi)生真菌B3處理對花生葉片微量元素Mo、B、Fe、Zn、Mn的積累具有顯著促進作用，同樣，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用與正常施肥處理相比顯著促進了葉片中必需微量元素Mo、B、Fe、Zn、Mn的積累，與對照相比分別增加了48.78%、38.22%、24.75%、187.11%、75.37%，為花生的光合作用提供了較充足的礦質(zhì)營養(yǎng)來源，微量元素的積累與花生莢果和秸稈產(chǎn)量增加結(jié)果相一致。

花生籽粒具有較高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素和微量元素等。由表5可知，蒼術(shù)粉處理與正常施肥對照相比對籽粒中微量元素積累沒有顯著影響，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用與對照相比顯著促進了花生籽粒中Mo、Fe、B和Zn的積累，尤其是Mo和Fe，分別增加41.18%和76.66%?？傮w上看，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用促進了花生葉片和籽粒中微量元素(Mo、Fe、B等)的積累，為花生的生長發(fā)育提供了必需的微量礦質(zhì)營養(yǎng)。

3討論

3.1內(nèi)生真菌和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用對連作花生根際土壤微生物數(shù)量和多樣性的影響

土壤微生物是土壤質(zhì)量和植物健康的生物指示物，是土壤生態(tài)系統(tǒng)健康可持續(xù)發(fā)展和植物健康生長的關(guān)鍵因子[33]。目前對連作花生障礙的研究普遍認為土壤真菌化是導致連作花生減產(chǎn)的主要原因，連作改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，使土壤由細菌型向真菌型轉(zhuǎn)變[5,34- 36]。王小兵等對連作花生不同生育期的微生物區(qū)系變化研究發(fā)現(xiàn)，有機肥和有效菌劑處理可以顯著提高細菌和放線菌數(shù)量[5]，本研究同樣發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理的放線菌數(shù)量在種子期、花期和成熟期顯著高于對照，內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉能協(xié)同促進土壤中細菌和放線菌的增加，有利于土壤環(huán)境的改善。黃玉茜[34]等人發(fā)現(xiàn)隨著連作年限的增加，根際和非根際土壤中細菌、放線菌數(shù)量明顯減少，真菌數(shù)量明顯增加，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理增加了真菌數(shù)量，在花生生長關(guān)鍵時期(花期、結(jié)莢期)達到顯著水平，這與前人的研究不同，可能是因為內(nèi)生真菌B3對土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生刺激作用，前人發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌B3處理導致酵母菌[20]、木霉和被孢霉[19,37]等有益真菌大量繁殖，這種刺激機制有待于進一步的研究。PCR-DGGE方法能夠在分子水平上對微生物多樣性進行分析[38- 40]，目前在研究土壤微生物種群的多樣性和對種群動態(tài)監(jiān)測應用較廣泛，因此，本研究采用PCR-DGGE對花生根際土壤微生物區(qū)系進行研究。王宏偉等對花生開花期土壤細菌與真菌進行DGGE分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌B3顯著提高了細菌和真菌的條帶數(shù)和Shannon指數(shù)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)得到顯著改善[14]，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉復合處理的條帶數(shù)和Shannon指數(shù)高于對照，細菌的群落結(jié)構(gòu)在種子期、苗期、花期和成熟期發(fā)生顯著性改變，真菌的群落結(jié)構(gòu)在花期發(fā)生顯著性改變，這可能與土壤環(huán)境以及不同種類微生物的繁殖能力相關(guān)。總的來說，本研究復合處理有效地提高了土壤中微生物的多樣性(Shannon指數(shù)和條帶數(shù))，改善了微生物群落結(jié)構(gòu)，在一定程度上改善了連作花生土壤微環(huán)境。

3.2內(nèi)生真菌和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用對土壤酶活的影響

土壤酶是土壤有機體的代謝動力，在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動方面扮演重要的角色[41]。土壤蔗糖酶能夠增加土壤中小分子糖類的含量，與土壤中有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化和呼吸強度密切相關(guān)，其活性強弱能反映土壤的熟化程度和肥力水平。土壤脲酶能夠?qū)⒛蛩剞D(zhuǎn)化為氨供植物利用，其活性能夠在一定程度上反映土壤的供氮能力。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌蒼術(shù)粉復合處理提高了花期、結(jié)莢期和成熟期脲酶活性以及種子期、花期和結(jié)莢期蔗糖酶活性，改善了連作花生土壤的肥力，為花生生長發(fā)育提供了必需的碳氮源。尹淑麗等人對黃瓜根際土壤酶活的研究也發(fā)現(xiàn)微生態(tài)菌劑能夠提高脲酶和蔗糖酶的活性[42- 43]，這與本研究發(fā)現(xiàn)相同。本課題組謝慧[20]等人發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)間作花生同時接種內(nèi)生真菌B3處理土壤蔗糖酶和脲酶活性最高，本研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，復合處理在花期和結(jié)莢期兩種酶活性也達到最高值，說明蒼術(shù)粉可以代替活體蒼術(shù)植株提高土壤酶活性，改善連作土壤環(huán)境。究其原因，土壤酶活性的提高與土壤微生物數(shù)量的增加，微生物群落結(jié)構(gòu)的改善有關(guān)，內(nèi)生真菌對花生根系分泌物的刺激可能也是土壤酶活性提高的原因。

3.3內(nèi)生真菌和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用對花生根際土壤和花生葉片籽粒微量元素的影響

微量元素(Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo)涉及到植物細胞幾乎全部新陳代謝過程，例如能量代謝，初級和次級代謝等，細胞的自我保護、基因調(diào)節(jié)、激素感知和信號傳導都需要微量元素的參與[44- 45]。前人的研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌能促進宿主植物對微量元素的吸收，Labidi等人發(fā)現(xiàn)碳酸鈣脅迫下叢枝菌根真菌促進根部對鐵、鋅和銅的吸收[46]，王藝等人也發(fā)現(xiàn)外生菌根真菌能促進宿主馬尾松對微量元素鐵、錳、銅和鋅的吸收，進而促進苗木生長，提高苗木抗旱性[47]。本研究對花生全生育期土壤中鉬、硼、鐵、鋅、銅和錳的動態(tài)變化進行監(jiān)測，在花生成熟期對葉片和籽粒中微量營養(yǎng)含量進行定量分析，結(jié)果表明，復合處理可以顯著促進連作土壤中有效態(tài)微量元素的活化，促進鉬鐵在花生葉片和籽粒中的積累，提高花生產(chǎn)量的同時對其品質(zhì)有顯著的改善作用。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌促進豆科植物花生對微量元素鉬鐵的吸收與積累，改善了花生的生理代謝水平，最終促進花生的產(chǎn)量和品質(zhì)的提高。

3結(jié)論

內(nèi)生真菌B3和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用促進了根際微生物數(shù)量的增加，特別是在放線菌和真菌的數(shù)量，PCR-DGGE聚類分析顯示聯(lián)合施用有效地提高了土壤中微生物的多樣性，改善了微生物群落結(jié)構(gòu)。同樣，聯(lián)合施用顯著促進了花期和結(jié)莢期脲酶和蔗糖酶活性，加速了物質(zhì)循環(huán)過程，除此之外，聯(lián)合施用還促進根際土壤微量元素的活化，促進鉬鐵在花生葉片和籽粒中的積累，提高花生產(chǎn)量的同時對其品質(zhì)有顯著的改善作用。本研究的結(jié)果顯示，內(nèi)生真菌和蒼術(shù)粉聯(lián)合施用對改善連作花生土壤環(huán)境及緩解花生連作障礙具有重要意義。

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Effects of endophytic fungi andAtractylodeslanceapowder on rhizosphere microflora and trace elements during continuous peanut cropping

SU Chunlun1, WANG Hongwei1, XIE Xingguang1, ZHANG Wei1, LI Xiaogang2,3, WANG Xingxiang2,3, DAI Chuanchao1,*

1JiangsuKeyLaboratoryforMicrobesandFunctionalGenomics,JiangsuEngineeringandTechnologyResearchCenterforIndustrializationofMicrobialResources,CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing210023,China2KeyLaboratoryofSoilEnvironmentandPollutionRemediation,InstituteofSoilScience,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,China3JiangxiKeyLaboratoryofEcologicalResearchofRedSoil,ExperimentalStationofRedSoil,ChineseAcademyofSciences,Yingtan335211,China

Key Words:Archishypogaea;Atractylodeslancea; endophytic fungi; microflora; PCR-DGGE; trace element

Abstract：A pot experiment was conducted to study the effects of the endophytic fungiPhomopsisliquidambaristrain B3 andAtractylodeslanceapowder on rhizosphere soil microflora, enzyme activity, and available trace elements under continuous peanut cropping. The results showed that strain B3 andA.lanceapowder significantly increased peanut straw and pod yield by 14.11% and 10.28%, respectively, relative to B3 treatment alone. B3 treatment significantly increased peanut root nodules as well as straw and pod yield relative to the control, which was grown under conventional fertilizer treatment.

基金項目:國家自然科學基金資助項目(41371290, 31370507)

收稿日期:2014- 09- 17; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015- 08- 05

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: daichuanchao@njnu.edu.cn

DOI:10.5846/stxb201409171842

蘇春淪, 王宏偉, 謝星光, 張偉, 李孝剛, 王興祥, 戴傳超.內(nèi)生真菌與蒼術(shù)粉對連作花生根際微生物區(qū)系和微量元素的影響.生態(tài)學報,2016,36(7):2052- 2065.

Su C L, Wang H W, Xie X G, Zhang W, Li X G, Wang X X, Dai C C.Effects of endophytic fungi andAtractylodeslanceapowder on rhizosphere microflora and trace elements during continuous peanut cropping.Acta Ecologica Sinica,2016,36(7):2052- 2065.