楊立霞, 馬欣然, 王玉英, 閆紹鵬, 王秋玉,*

1 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱　150040 2 呼倫貝爾學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，呼倫貝爾　021000

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三種白腐菌生物學(xué)特性與木質(zhì)纖維素酶基因遺傳多樣性

楊立霞1,2, 馬欣然1, 王玉英1, 閆紹鵬1, 王秋玉1,*

1 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040 2 呼倫貝爾學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，呼倫貝爾021000

摘要:以采自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的3種白腐真菌——木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)、鮑姆鮑姆木層孔菌(Phellinusbaumiibaumii)和火木層孔菌(Phellinusigniarius)為材料，用菌落直徑測(cè)量法比較3種白腐菌在馬鈴署葡萄糖固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度，采用菌絲體干重法比較其在馬鈴署葡萄糖液體培養(yǎng)基中的生物量變化。結(jié)果顯示：馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基上3種白腐菌均為快速生長(zhǎng)類型，其生長(zhǎng)速度木蹄層孔菌>火木層孔菌>鮑姆鮑姆木層孔菌；馬鈴署葡萄糖液體培養(yǎng)基中生物量增長(zhǎng)速度木蹄層孔菌>鮑姆鮑姆木層孔菌>火木層孔菌。用比色法測(cè)量其木質(zhì)纖維素酶活性，結(jié)果顯示：木蹄層孔菌產(chǎn)錳過氧化物酶和漆酶量較高，鮑姆鮑姆木層孔菌和火木層孔菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶量較高；木蹄層孔菌、鮑姆鮑姆木層孔菌和火木層孔菌3種白腐菌的3種主要木質(zhì)素酶(錳過氧化物酶、漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶)的表達(dá)量，種間差異顯著(F=3.75*、5.20**、3.01*)，白樺木屑誘導(dǎo)處理與對(duì)照間差異顯著(F=3.84*、4.19*、5.28*)；兩種主要纖維素酶(葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶)的表達(dá)量，種間差異不顯著，受碳源影響作用顯著(F=3.99*、4.04*)。篩選29對(duì)引物組合，對(duì)3種白腐菌幾種主要木質(zhì)纖維素酶基因進(jìn)行TRAP-PCR分子標(biāo)記檢測(cè)，比較3菌種間遺傳差異，擴(kuò)增總條帶數(shù)為357條，多態(tài)性條帶數(shù)為255條，多態(tài)性條帶的比例為71.43%，其中木質(zhì)素降解酶基因總多態(tài)位點(diǎn)比率為73.77%，纖維素降解酶基因總多態(tài)位點(diǎn)比率為68.97%。3種白腐菌的木質(zhì)纖維素降解酶基因在種間均存在較高的遺傳差異。因此，特定基因的TRAP分子標(biāo)記可以用于木腐菌的遺傳變異分析。

關(guān)鍵詞：白腐菌；木質(zhì)纖維素降解酶；TRAP分子標(biāo)記；遺傳差異

木腐菌是生態(tài)系統(tǒng)中森林微生物的重要組成部分，其分泌的多種酶能降解木材中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，將木纖維分解為簡(jiǎn)單的碳水化合物，營(yíng)木質(zhì)有機(jī)物腐生[1- 2]。按其對(duì)木纖維降解類型不同，木腐菌分為白腐菌、褐腐菌和軟腐菌三類[3]。白腐菌因腐朽木材呈白色而得名，屬于擔(dān)子菌門的真菌，在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過程中形成了一套獨(dú)特的木質(zhì)素降解系統(tǒng)，是自然界中木質(zhì)素的最有效降解物[4]。

早期木腐菌研究主要集中于形態(tài)學(xué)與分類學(xué)，側(cè)重于從自然界中篩選和人工誘變選育高酶活菌株[5]。隨著生物化學(xué)和分離技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)木腐菌的木質(zhì)纖維素酶組分的分離和降解機(jī)制研究逐漸展開，目前對(duì)結(jié)晶纖維素的水解機(jī)制已有初步了解[6- 9]。但由于天然木材中半纖維素和木質(zhì)素與纖維素間緊密相連的特殊結(jié)構(gòu)，天然木質(zhì)纖維素難被降解的原因仍未被闡明[10- 12]。20世紀(jì)80年代初Kirk和Gold分別從白腐菌模式菌種——黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素過氧化物酶(簡(jiǎn)稱LiP酶)和錳過氧化物酶(簡(jiǎn)稱MnP酶)，提出白腐真菌在降解木質(zhì)素過程中，需要纖維素或葡萄糖作為木質(zhì)素的共底物，是木質(zhì)素生物降解研究的突破。LiP酶、MnP酶與后來發(fā)現(xiàn)的漆酶(簡(jiǎn)稱Lac酶)，共同構(gòu)成了白腐菌的木質(zhì)素降解酶系。因白腐菌具有木質(zhì)纖維素降解特性，故在生物質(zhì)能源利用、農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)利用、造紙廢液處理和環(huán)境保護(hù)、生物制漿、紡織印染、洗滌劑生產(chǎn)、食品飲料加工等領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景[13- 17]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，白腐菌作為重要林木病原真菌，其群體遺傳學(xué)的研究已進(jìn)入分子水平，包括同工酶分析、氨基酸序列測(cè)定以及DNA序列變異分析等。分子標(biāo)記技術(shù)為大規(guī)模進(jìn)行林木病原真菌的遺傳變異研究創(chuàng)造了有利的條件。靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(Target Region Amplification Polymorphism，TRAP)分子標(biāo)記，是由Hu和Vick在SRAP分子標(biāo)記基礎(chǔ)上提出的新型分子標(biāo)記技術(shù)[18- 19]。TRAP分子標(biāo)記基于已知基因的cDNA或EST序列信息設(shè)計(jì)錨定引物，選擇性擴(kuò)增靶基因序列，隨機(jī)引物富含AT或GC堿基，可與模板DNA中內(nèi)含子或外顯子區(qū)域配對(duì)，擴(kuò)增產(chǎn)物可對(duì)靶基因序列進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性高、費(fèi)用低、靶基因區(qū)域針對(duì)性強(qiáng)，是遺傳多樣性研究中較為理想的分子標(biāo)記技術(shù)[20- 21]。

本研究以帽兒山采集的木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)、鮑姆鮑姆木層孔菌(Phellinusbaumiibaumii)和火木層孔菌(Phellinusigniarius)為對(duì)象，測(cè)定其生長(zhǎng)速度、生物量變化以及木質(zhì)纖維素相關(guān)酶活性，為木材腐朽機(jī)理研究和工業(yè)生產(chǎn)菌株選擇提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；采用TRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)3種白腐菌的木質(zhì)纖維素酶相關(guān)基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，為從特定基因水平上研究木腐菌遺傳變異提供有用的信息。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與處理

本試驗(yàn)所用3種白腐菌為木蹄層孔菌、鮑姆鮑姆木層孔菌和火木層孔菌，采自黑龍江省東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，三者均為白色腐朽菌類型[22]，基本特征如表1所示。

無菌條件下，以75%酒精清洗腐朽菌子實(shí)體表面，用解剖刀分離出菌種子實(shí)體內(nèi)部污染較少、生長(zhǎng)旺盛的小菌塊，用75%的酒精溶液消毒1 min，無菌水清洗3次，濾紙吸干后接種于馬鈴薯葡萄糖固體平板培養(yǎng)基，23℃氣候箱中避光培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，選擇無雜菌污染的菌絲連續(xù)轉(zhuǎn)接2次，轉(zhuǎn)接入含白樺木屑或麥麩試管內(nèi)，23℃氣候箱繼續(xù)培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿試管，4℃冰箱內(nèi)保存待用[23]。

1.2菌絲生長(zhǎng)特性比較

采用菌落直徑法和菌絲干重法比較3種白腐菌的生物學(xué)特性[24]。分別將3種白腐菌純菌絲點(diǎn)種在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(90 mm徑培養(yǎng)皿)平板中央位置，28℃氣候箱避光倒置培養(yǎng)；每12 h測(cè)量菌落直徑變化，直至菌絲長(zhǎng)滿平板。分別將3種白腐菌菌餅(直徑90 mm)接種于100 mL三角瓶?jī)?nèi)的40 mL馬鈴署葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃ 150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)；每48 h取菌絲體，濾紙過濾得到粗菌絲體，用蒸餾水沖洗3次，100℃干燥箱中烘干至恒重，稱量干重，比較3種白腐菌菌絲體生物量變化。每處理3次重復(fù)。

1.3酶活性鑒定

1.3.1木質(zhì)素降解酶活性的測(cè)定

木質(zhì)素降解酶粗酶液制備：無菌操作條件下，將3種白腐菌菌餅接種于100 mL三角瓶?jī)?nèi)40 mL 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌種2個(gè)處理，處理樣中加白樺木屑，對(duì)照樣無木屑；28℃ 150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，定期取菌樣培養(yǎng)液，4℃ 15000 r/min離心10 min取上清液，得木質(zhì)素降解相關(guān)酶粗酶液[25]。每3d取1次菌樣測(cè)定酶活，連續(xù)取7次測(cè)定，每次測(cè)定每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù)菌樣。每個(gè)處理中分別測(cè)定3種酶活，錳過氧化物酶(MnP酶)活性測(cè)量見參考文獻(xiàn)[26]、漆酶(Lac酶)的活性測(cè)量見參考文獻(xiàn)[27]、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP酶)活性測(cè)量見參考文獻(xiàn)[28]。

1.3.2纖維素降解酶活性的測(cè)定

產(chǎn)纖維素酶固體培養(yǎng)基配置：向50 mL三角瓶中加入1 g碳源物質(zhì)和10 mL培養(yǎng)液，每個(gè)菌種2個(gè)處理，其碳源物質(zhì)分別為白樺木屑和麥麩；培養(yǎng)液中各種無機(jī)鹽的質(zhì)量百分含量分別為：2% (NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.5% MgSO4·7H2O、0.01% CaCl2、0.01% NaCl、0.005% FeSO4·7H2O、0.0016% MnSO4·H2O、0.0014% ZnSO4·7H2O、0.002% CoCl2。纖維素降解酶粗酶液制備：無菌操作條件下，將3種白腐菌接種于產(chǎn)纖維素酶固體培養(yǎng)基，28℃氣候箱中培養(yǎng)，定期取菌樣制備粗酶液，向培養(yǎng)瓶中加入5倍質(zhì)量的蒸餾水浸泡12h，雙層紗布過濾得濾液，4℃ 15000 r/min離心10 min取上清液，所得為纖維素降解相關(guān)酶粗酶液。每隔4d取1次菌樣測(cè)定酶活，連續(xù)取7次測(cè)定，每次測(cè)定每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù)菌樣。每個(gè)處理中分別測(cè)定2種酶活，葡聚糖內(nèi)切酶(EG酶)和葡聚糖外切酶(EC酶)，活性測(cè)定見參考文獻(xiàn)[29]。

1.4木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶基因TRAP標(biāo)記遺傳變異檢測(cè)

采用改良的CTAB法提取3種白腐菌的總DNA[30]。以來自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶基因?yàn)榘袠?biāo)基因序列，設(shè)計(jì)固定引物，引物信息如表2所示。篩選具有較好擴(kuò)增條帶多態(tài)性的引物對(duì)，用于3菌種TRAP-PCR分子標(biāo)記檢測(cè)，每個(gè)處理3次重復(fù)。PCR最佳反應(yīng)條件：反應(yīng)體系20 μL,模板DNA 100 ng、固定引物(10 μmol/L) 2.0 μL、隨機(jī)引物(10 μmol/L) 2.0 μL、dNTP (2 mmol/L) 2.0 μL、MgCl2(25mmol/L) 2.0 μL、1×Buffer (含K+，不含Mg2+) 2.0 μL、Taq DNA聚合酶0.15 μL、ddH2O 7.85 μL,PCR程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 1min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1×TAE緩沖液，1.8%瓊脂糖凝膠，100 V緩沖電壓電泳，UPS凝膠成像系統(tǒng) (Universal HoodⅡ, BioRad) 檢測(cè)電泳結(jié)果。

1.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)3種白腐菌的幾種主要木質(zhì)纖維素酶活性進(jìn)行種間和處理間方差及顯著性分析。

多態(tài)性百分率是描述群體遺傳變異量的參數(shù)，是指群體內(nèi)多態(tài)性基因座的比例:

P=k/n×100%

式中,P為多態(tài)位點(diǎn)百分比，k為多態(tài)位點(diǎn)數(shù)，n為測(cè)定的位點(diǎn)總數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.13種白腐菌菌絲生長(zhǎng)速度和生物量變化

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基中，在16d培養(yǎng)過程中,3種白腐菌菌落直徑變化如圖1所示。3菌種菌絲生長(zhǎng)速度均勻，木蹄層孔菌和火木層孔菌的生長(zhǎng)速度較快，菌絲的平均生長(zhǎng)速度分別是7.5 mm/d和6.9 mm/d，鮑姆鮑姆木層孔菌生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，菌絲的平均生長(zhǎng)速度是5.6 mm/d，三者之間生長(zhǎng)速度差異不明顯，均屬于快速生長(zhǎng)的類型。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)條件下，3種白腐菌的菌絲生物量變化如圖1所示。生長(zhǎng)14 d后，木蹄層孔菌生物量最高，達(dá)到6.14 g/L，其次為鮑姆鮑姆木層孔菌，達(dá)到5.02 g/L，為同期木蹄層孔菌的81.75%，火木層孔菌生物量最低，為2.31 g/L，僅為同期木蹄層孔菌的37.62%。木蹄層孔菌和鮑姆鮑姆木層孔菌的生長(zhǎng)調(diào)整期相對(duì)較短，時(shí)間為6 d，對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速度相對(duì)較快?；鹉緦涌拙纳L(zhǎng)調(diào)整期相對(duì)較長(zhǎng)，時(shí)間為10d，對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢。

火木層孔菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度比鮑姆鮑姆木層孔菌快，而在固體培養(yǎng)基中的生物量卻比鮑姆鮑姆木層孔菌小，由此可見火木層孔菌可能更適合在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

2.2木質(zhì)纖維素降解酶活性變化

2.2.13種白腐菌木質(zhì)素降解酶活性變化

不同培養(yǎng)條件下3種白腐菌產(chǎn)木質(zhì)素降解相關(guān)酶活性變化如圖2所示。培養(yǎng)初期3種菌產(chǎn)LiP酶、MnP酶、Lac酶量低，經(jīng)6—9 d調(diào)整期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶的表達(dá)量開始增加，18—21 d后進(jìn)入衰退期，產(chǎn)酶量逐漸下降。

木蹄層孔菌產(chǎn)MnP酶、Lac酶量高于鮑姆鮑姆木層孔菌和火木層孔菌，并隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增高；鮑姆鮑姆木層孔菌和火木層孔菌產(chǎn)LiP酶量高于木蹄層孔菌；3種白腐菌MnP酶、Lac酶、LiP酶的表達(dá)量種間差異顯著(F=3.75*、5.20**、3.01*)。

3菌種的MnP酶、Lac酶、LiP酶的表達(dá)量在處理與對(duì)照間差異顯著(F=3.84*、4.19*、5.28*)。圖2顯示木蹄層孔菌的MnP酶和Lac酶活性木屑誘導(dǎo)組略高于對(duì)照組；鮑姆鮑姆木層孔菌表達(dá)Lac酶活性極低，處理間差異不明顯；火木層孔菌屑誘導(dǎo)組的MnP酶、Lac酶活性木高于對(duì)照組，白樺木屑對(duì)MnP酶、Lac酶誘導(dǎo)作用的種間差異顯著(F=3.85*、5.27**)。木蹄層孔菌白樺誘導(dǎo)組LiP酶活性高于對(duì)照組，鮑姆鮑姆木層孔菌和火木層孔菌的對(duì)照組LiP酶活性高于白樺誘導(dǎo)組，白樺木屑誘導(dǎo)促進(jìn)木蹄層孔菌LiP酶表達(dá)，抑制鮑姆鮑姆木層孔菌和火木層孔菌LiP酶表達(dá)，白樺木屑對(duì)LiP酶表達(dá)誘導(dǎo)作用的種間差異顯著(F=4.16*)(圖2)。

2.2.23種白腐菌纖維素降解酶活性變化

不同培養(yǎng)底物誘導(dǎo)下，3種白腐菌產(chǎn)纖維素降解相關(guān)酶活性變化如圖3所示。3菌種在培養(yǎng)初期均開始產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶(EG)和葡聚糖外切酶(EC)，酶的表達(dá)量逐漸增加，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期達(dá)到峰值后逐漸下降，但麥麩培養(yǎng)基中火木層孔菌的EC酶活性，在測(cè)量后期仍繼續(xù)增長(zhǎng)。麥麩作為碳源的培養(yǎng)基中3種白腐菌的酶活峰值出現(xiàn)時(shí)間晚于木屑做碳源的培養(yǎng)基。

3菌種的EG酶、EC酶表達(dá)量的種間差異不明顯(F=1.63、1.65，P<0.05)。碳源影響纖維素降解相關(guān)酶的表達(dá)量，白樺木屑作為碳源的培養(yǎng)基中，3菌種表達(dá)的EG酶和EC酶活性較低，活性變化較小，菌種長(zhǎng)勢(shì)一般；麥麩作為碳源的培養(yǎng)基中，3菌種表達(dá)的兩種酶活性較高，活性變化較大，菌種長(zhǎng)勢(shì)旺盛，EG酶、EC酶活性處理間差異顯著(F=3.99*、4.04*)。

2.3木質(zhì)纖維素降解酶基因TRAP標(biāo)記遺傳變異

2.3.1TRAP引物篩選結(jié)果

根據(jù)來自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶基因設(shè)計(jì)固定引物，通過TRAP-PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選針對(duì)7個(gè)木質(zhì)纖維素酶基因的引物對(duì)，結(jié)果從64對(duì)引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較好的引物對(duì)29對(duì)。其中以木質(zhì)素降解酶基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)有15對(duì)，可標(biāo)記MnP基因的1對(duì)，標(biāo)記Lac基因的6對(duì)，LiP基因的8對(duì)；以纖維素降解酶基因?yàn)榘谢虻囊飳?duì)有14對(duì)，可標(biāo)記CBH基因的引物10對(duì)，標(biāo)記CDH基因的3對(duì)，標(biāo)記EG基因的1對(duì)。所篩選引物對(duì)如表3所示。

2.3.23種白腐菌木質(zhì)纖維素降解酶基因TRAP標(biāo)記的遺傳多態(tài)性

圖4為3菌種木質(zhì)纖維素相關(guān)酶基因TRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的部分電泳結(jié)果，表4為各酶基因的擴(kuò)增條帶的多態(tài)性統(tǒng)計(jì)。以3菌種的LiP酶基因?yàn)榘谢虻?對(duì)引物擴(kuò)增共產(chǎn)生94個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為67條，木蹄層孔菌多態(tài)性比率為74.29%，鮑姆鮑姆木層孔菌多態(tài)性比率為73.53%，火木層孔菌多態(tài)性比率為64.00%，該基因總多態(tài)性條帶比率為為71.27%；以MnP酶基因?yàn)榘谢虻?個(gè)引物對(duì)共擴(kuò)增3個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為2條，該基因總多態(tài)性條帶比率為66.67%； 以Lac酶基因?yàn)榘谢虻?個(gè)引物對(duì)共擴(kuò)增80個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為62條，木蹄層孔菌多態(tài)性比率為72.73%，鮑姆鮑姆木層孔菌多態(tài)性比率為79.31%，火木層孔菌多態(tài)性比率為79.31%，該基因總多態(tài)性條帶比率為77.50%； 以CBHⅠ酶基因?yàn)榘谢虻?個(gè)引物對(duì)共擴(kuò)增58個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為40條，木蹄層孔菌多態(tài)性比率為66.67%，鮑姆鮑姆木層孔菌多態(tài)性比率為71.43%，火木層孔菌多態(tài)性比率為68.42%，該基因總多態(tài)性條帶比率為68.97%； 以CBHⅡ酶基因?yàn)榘谢虻?個(gè)引物對(duì)共擴(kuò)增65個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為47條，木蹄層孔菌多態(tài)性比率為66.67%，鮑姆鮑姆木層孔菌多態(tài)性比率為75.00%，火木層孔菌多態(tài)性比率為73.91%，該基因總多態(tài)性條帶比率為72.31%； 以CDHⅠ酶基因?yàn)榘谢虻?個(gè)引物對(duì)共擴(kuò)增40個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為25條，木蹄層孔菌多態(tài)性比率為58.33%，鮑姆鮑姆木層孔菌多態(tài)性比率為70.59%，火木層孔菌多態(tài)性比率為54.55%，該基因總多態(tài)性條帶比率為62.5%； 以EG2酶基因?yàn)榘谢虻?個(gè)引物對(duì)共擴(kuò)增11個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為8條，木蹄層孔菌多態(tài)性比率為80.00%，鮑姆鮑姆木層孔菌多態(tài)性比率為66.67%，火木層孔菌多態(tài)性比率為66.67%，該基因總多態(tài)性條帶比率為72.73%；由此可見，除MnP酶基因外，3種白腐菌的木質(zhì)纖維素降解酶基因在種間均存在較高的遺傳差異。

3討論

白腐菌既可以表達(dá)木質(zhì)素酶也可以表達(dá)纖維素酶，用于木質(zhì)纖維素的降解。但不同的菌種間各種酶的表達(dá)存在很大差異，差異主要表現(xiàn)在表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間上。

本研究的3種白腐菌分泌的3種主要木質(zhì)素酶在表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間上，種間存在很大差異。從表達(dá)量上看，木蹄層孔菌的Lac酶表達(dá)量很高，而鮑姆鮑姆木層孔菌的Lac酶表達(dá)量極低，不論是木屑誘導(dǎo)還是對(duì)照都幾乎不表達(dá)；木蹄層孔菌偏好產(chǎn)MnP酶、Lac酶，鮑姆鮑姆木層孔菌和火木層孔菌偏好產(chǎn)LiP酶。白樺木屑對(duì)3種白腐菌中MnP酶、Lac酶表達(dá)有誘導(dǎo)促進(jìn)作用，對(duì)鮑姆鮑姆木層孔菌和火木層孔菌產(chǎn)LiP酶有誘導(dǎo)抑制作用，誘導(dǎo)作用種間差異顯著。從表達(dá)時(shí)間上看，白樺木屑誘導(dǎo)作用在種間差異顯著，白樺木屑誘導(dǎo)作用在不同菌種的不同酶中出現(xiàn)或早或晚，到達(dá)產(chǎn)酶峰值出現(xiàn)時(shí)間或促進(jìn)或延遲，種間差異顯著。原因可能是不同菌種間的遺傳差異以及對(duì)誘導(dǎo)物的響應(yīng)各不相同所致。

本研究的3種白腐菌產(chǎn)纖維素降解酶能力的種間差異不明顯，但酶的表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間受碳源影響明顯，不同處理間差異顯著。原因可能在于纖維素降解酶系是多組分酶系，與其他的酶促反應(yīng)有很大的區(qū)別，各組分之間存在復(fù)雜的協(xié)同反應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而影響了EG酶和EC酶的表達(dá)量和活性變化。

以來自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶基因?yàn)榘袠?biāo)基因序列，設(shè)計(jì)固定引物，通過TRAP-PCR篩選能產(chǎn)生多態(tài)性條帶的引物以用于菌種間遺傳變異研究。針對(duì)7個(gè)木質(zhì)纖維素酶相關(guān)基因使用篩選出的29對(duì)引物，對(duì)3種白腐菌進(jìn)行TRAP-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生總條帶數(shù)為357條，多態(tài)性條帶數(shù)為255條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)為12.31條，條帶的大小范圍在100—2000 bp之間。其中以木質(zhì)素降解相關(guān)酶基因?yàn)榘谢虻?5個(gè)引物對(duì)，共擴(kuò)增183個(gè)條帶，135條為多態(tài)性條帶，木蹄層孔菌多態(tài)性比率為73.33%，鮑姆鮑姆木層孔菌多態(tài)性比率為75.76%，火木層孔菌多態(tài)性比率為71.93%，木質(zhì)素降解酶基因總多態(tài)位點(diǎn)比率為73.77%；以纖維素降解相關(guān)酶基因?yàn)榘谢虻?4個(gè)引物對(duì)共擴(kuò)增174個(gè)條帶，120條為多態(tài)性條帶，木蹄層孔菌多態(tài)性比率為66.04%，鮑姆鮑姆木層孔菌多態(tài)性比率為72.31%，火木層孔菌多態(tài)性比率為67.86%，纖維素降解酶基因總多態(tài)位點(diǎn)比率為68.97%。本研究表明3種白腐菌均顯示較高的木質(zhì)素和纖維素降解酶基因的遺傳多態(tài)性。因此，特異基因的TRAP分子標(biāo)記方法可用于木材腐朽菌種間遺傳變異研究。

從形態(tài)分類學(xué)角度看，火木層孔菌和鮑姆鮑姆木層孔菌均為銹革菌科木層孔菌屬菌種，而木蹄層孔菌為多孔菌科層孔菌屬菌種。但從它們木質(zhì)纖維素酶的胞外表達(dá)量和表達(dá)趨勢(shì)，以及7個(gè)木質(zhì)纖維素酶靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果上看，火木層孔菌與木蹄層孔菌多態(tài)性條相似度高，木蹄層孔菌與鮑姆鮑姆木層孔菌的條帶相似程度低；而鮑姆鮑姆木層孔菌的特異性條帶多，火木層孔菌與木蹄層孔菌特異性條帶少。原因可能與火木層孔菌與木蹄層孔菌具有相同的寄主有關(guān)；同時(shí)，從基因進(jìn)化關(guān)系上，木蹄層孔菌與火木層孔菌可能更近，與鮑姆鮑姆木層孔菌進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

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Biological characteristics of three white-rot fungi and genetic diversity of lignocellulose enzyme related genes

YANG Lixia1,2, MA Xinran1, WANG Yuying1, YAN Shaopeng1, WANG Qiuyu1,*

1CollegeofLifeScience,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China2BiologyandEnvironmentalDepartmentHulunbuirCollege,Hulunbuir021000,China

Key Words:white-rot fungi； lignocellulose degradation enzymes； TRAP molecular marker； genetic variation

Abstract：We used three types of white-rot fungi, namely,Fomesfomentarius,Phellinusbaumiibaumii, andPhellinusigniarius, as the study materials. The colony diameters and mycelial dry weights in different culture media were measured to compare their growth characteristics. Further, the activities of five lignocellulose degradation enzymes of the fungi were detected using colorimetry. The results showed that all the fungi were fast growing types: colony growth ofP.baumiibaumiiin Potato Dextrose Agar medium was faster than that ofP.igniariusandF.fomentarius, but mycelial biomass accumulation ofF.fomentariusin liquid Potato Dextrose medium was the highest, followed byP.baumiibaumiiandP.igniarius. The manganese peroxidase (MnP) and laccase (Lac) productions ofF.fomentariuswere higher than that of the other two species, while the lignin peroxidase (Lip) yields ofP.baumiibaumiiandP.igniariuswere higher than that ofF.fomentarius. TheF-test value of three ligninolytic enzymes expressions among the three fungi species was 3.75*, 5.20**and 3.01*for lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase respectively, and the value for manganese peroxidase reaching a highly significant level. The wood chip induced treatment had significant difference from the control, andF-test value for lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase was 3.84*, 4.19*and 5.28*respectively. No clear variations among fungi species for the expressions of endoglucanase and exoglucanase were noted, while the expressions were obviously affected by the carbon source in the medium, and theF-test value was 3.99*and 4.04*for endoglucanase and exoglucanase respectively, both values reached a significant level. Target region amplification polymorphism (TRAP) was used to analyze the lignocellulose degradation enzyme gene polymorphisms in the three white-rot fungi by using 29 sets of selected primers. By using TRAP, we amplified 357 bands, including 255 polymorphic bands, with 71.43% of the total polymorphic loci percentage, where the polymorphic loci percentage of the lignin and cellulose degradation enzyme genes reached 73.77% and 68.97%, respectively. This result indicated that the lignocellulose degradation enzyme genes of the three white-rot fungi have high interspecific variations. Thus, we showed that TRAP molecular markers are useful for the analysis of variations among species of wood-rot fungi at the gene level.

基金項(xiàng)目:國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金——科研訓(xùn)練及科研能力提高項(xiàng)目(015-41312309)

收稿日期:2014- 09- 27;

修訂日期:2015- 05- 04

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: wqyll@sina.com

DOI:10.5846/stxb201409271911

楊立霞, 馬欣然, 王玉英, 閆紹鵬, 王秋玉.三種白腐菌生物學(xué)特性與木質(zhì)纖維素酶基因遺傳多樣性.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(7):2034- 2043.

Yang L X, Ma X R, Wang Y Y, Yan S P, Wang Q Y.Biological characteristics of three white-rot fungi and genetic diversity of lignocellulose enzyme related genes.Acta Ecologica Sinica,2016,36(7):2034- 2043.