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淺談上海市臨床PCR實(shí)驗(yàn)室的建立和管理

楊德平1,2

(1.上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201318；2.上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，上海 200092)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是由美國(guó)Kary Mullis于1983年發(fā)明的[1]。它有非常高的檢測(cè)靈敏度，并且還有快速、簡(jiǎn)便、特異等優(yōu)點(diǎn)，能將研究所需要的基因在試管內(nèi)迅速擴(kuò)增至幾十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)倍。由于PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)多，被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，很多醫(yī)療機(jī)構(gòu)相繼建立了臨床PCR實(shí)驗(yàn)室。因業(yè)務(wù)需要上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院也建立了PCR實(shí)驗(yàn)室，筆者參與了從PCR實(shí)驗(yàn)室的建立到接受上海市專家審核組審核，再到正常運(yùn)行的全過(guò)程，在實(shí)驗(yàn)室的建立和管理上累積了一定的經(jīng)驗(yàn)，并產(chǎn)生了自己的看法?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下，以供上海市需要開(kāi)展PCR實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)療機(jī)構(gòu)參考。

1PCR實(shí)驗(yàn)室的創(chuàng)建和完善

PCR技術(shù)現(xiàn)已被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用在臨床實(shí)驗(yàn)室，由于PCR技術(shù)對(duì)檢測(cè)的核酸進(jìn)行了大批量的擴(kuò)增，這就容易導(dǎo)致PCR實(shí)驗(yàn)室污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；另外由于PCR技術(shù)要求高，中間環(huán)節(jié)比較多，如果檢測(cè)過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題(如忘加樣品)就可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，臨床上要想開(kāi)展該項(xiàng)技術(shù)，就必須要通過(guò)有關(guān)部門的技術(shù)審核，同時(shí)在管理方面一定要規(guī)范化。要想順利通過(guò)專家審核把實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展起來(lái)，就要認(rèn)真對(duì)照申報(bào)上海市PCR實(shí)驗(yàn)室必需具備的條件逐條進(jìn)行分析、完善。

1.1PCR實(shí)驗(yàn)室申報(bào)前準(zhǔn)備首先要了解在上海市申辦PCR實(shí)驗(yàn)室需要準(zhǔn)備的材料，需要的條件，然后對(duì)照要求一一完成。上海市PCR實(shí)驗(yàn)室申辦必需具備的材料和條件如下所述。(1)醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證副本首頁(yè)及校驗(yàn)登記復(fù)印件(加蓋單位公章)。(2)該醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用能力在醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證扉頁(yè)登記情況復(fù)印件(加蓋單位公章，復(fù)審、擴(kuò)項(xiàng)需提交)。(3)與該技術(shù)有關(guān)的技術(shù)人員資格證書復(fù)印件(加蓋單位公章)；挑選業(yè)務(wù)水平較好的有資格的人員[2]，均經(jīng)過(guò)原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心或區(qū)臨床檢驗(yàn)中心理論和操作培訓(xùn)并通過(guò)考試取得合格證[3]。(4)與該技術(shù)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室平面圖；在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)上，建立單流向、一體化的臨床定量PCR實(shí)驗(yàn)室是安全準(zhǔn)確進(jìn)行基因擴(kuò)增檢驗(yàn)和保障生物安全的重要措施[4]；實(shí)驗(yàn)室平面圖主要包括3個(gè)部分(Ⅰ區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)，Ⅱ區(qū)標(biāo)本制備區(qū)，Ⅲ區(qū)擴(kuò)增區(qū))。(5)醫(yī)療機(jī)構(gòu)醫(yī)學(xué)倫理審查報(bào)告(相關(guān)技術(shù)審核辦法規(guī)定的，初審、擴(kuò)項(xiàng)需提交；另附倫理委員會(huì)成員姓名、專業(yè)、職務(wù)、職稱等情況)。(6)醫(yī)療機(jī)構(gòu)相關(guān)臨床科室出具的臨床評(píng)價(jià)報(bào)告(加蓋單位醫(yī)務(wù)部門公章，初審、擴(kuò)項(xiàng)需提交)；可以從需要開(kāi)展項(xiàng)目的臨床需求，可以解決的臨床問(wèn)題，以及臨床意義出發(fā)。臨床科室提供、有臨床主任簽字、醫(yī)務(wù)科蓋章。(7)與該項(xiàng)目相關(guān)的試劑注冊(cè)證書復(fù)印件(初審、擴(kuò)項(xiàng)需提交)。(8)擬開(kāi)展檢測(cè)項(xiàng)目方法學(xué)驗(yàn)證報(bào)告(初審、擴(kuò)項(xiàng)需提交)；若要開(kāi)展的項(xiàng)目結(jié)果是數(shù)值型的，則項(xiàng)目的性能驗(yàn)證參數(shù)包括正確度、精密度、線性范圍、檢測(cè)下限；若要開(kāi)展的項(xiàng)目結(jié)果報(bào)告是陰陽(yáng)性，則項(xiàng)目的性能驗(yàn)證參數(shù)包括精密度、符合率。(9)參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)反饋結(jié)果復(fù)印件，或證明其檢測(cè)質(zhì)量的其他相關(guān)資料(加蓋單位公章)。(10)擬開(kāi)展檢測(cè)項(xiàng)目報(bào)告樣單(初審、擴(kuò)項(xiàng)需提交)。(11)該技術(shù)的質(zhì)量手冊(cè)、程序文件、作業(yè)指導(dǎo)書(初審、擴(kuò)項(xiàng)需提交)；在上海市這條很重要，每個(gè)臨床PCR實(shí)驗(yàn)室要根據(jù)自己開(kāi)展項(xiàng)目的具體要求，結(jié)合自身的實(shí)際情況進(jìn)行編寫，專家來(lái)初審的時(shí)候比較關(guān)注，需要認(rèn)真準(zhǔn)備，包括基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(SOP)和相關(guān)的各種表格。(12)衛(wèi)生行政部門要求的其他相關(guān)文件。(13)國(guó)內(nèi)外有關(guān)該技術(shù)研究和使用情況的檢索報(bào)告及技術(shù)資料(申請(qǐng)?jiān)诒臼惺状伍_(kāi)展的醫(yī)療技術(shù)即新技術(shù)初審、擴(kuò)項(xiàng)需提交)，這條在上海市主要是提交的申請(qǐng)表里面需要填寫。在準(zhǔn)備上述條件的同時(shí)，還要購(gòu)買PCR擴(kuò)增儀、高速離心機(jī)、恒溫金屬浴等儀器設(shè)備和相應(yīng)的項(xiàng)目試劑。

1.2PCR實(shí)驗(yàn)室審核流程上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)分子診斷計(jì)數(shù)審核工作流程圖，見(jiàn)圖1。其中在現(xiàn)場(chǎng)審核過(guò)程中將按照以下幾個(gè)步驟進(jìn)行。(1)首次會(huì)議：①參加人員包括審核組全體成員、PCR實(shí)驗(yàn)室全體成員；②審核組工作安排介紹；③實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人介紹實(shí)驗(yàn)室基本情況(提供一份書面提綱)。(2)現(xiàn)場(chǎng)參觀：參加人員包括審核組全體成員。(3)現(xiàn)場(chǎng)審核：①參加人員包括審核組全體成員；②《上海市臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)審核檢查表》中規(guī)定內(nèi)容；③有關(guān)記錄；④現(xiàn)場(chǎng)提問(wèn)；⑤現(xiàn)場(chǎng)樣品測(cè)試。(4) 審核組會(huì)議：評(píng)審專家獨(dú)立出具審核意見(jiàn)，參加人員包括審核組全體成員。(5)末次會(huì)議：①參加人員包括審核組全體成員、PCR實(shí)驗(yàn)室全體成員；②審核組宣布整改要求及審核意見(jiàn)；③實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人講話。需特別注意的是在專家審核組提出整改意見(jiàn)后，一定要在1個(gè)月內(nèi)把整改報(bào)告提交到上海市臨床檢驗(yàn)中心。

圖1　　上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)分子診斷新技術(shù)審核工作流程圖

1.3不斷改進(jìn)完善對(duì)評(píng)審專家在現(xiàn)場(chǎng)審核過(guò)程中提出的整改意見(jiàn)和合理建議及時(shí)地進(jìn)行改進(jìn)完善。

2PCR實(shí)驗(yàn)室的日常管理

PCR實(shí)驗(yàn)室最常見(jiàn)也是最重要的問(wèn)題是污染問(wèn)題，它直接影響著檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，要嚴(yán)格控制每一個(gè)操作環(huán)節(jié)，最大限度地減少實(shí)驗(yàn)室污染問(wèn)題。

2.1儀器設(shè)備的管理PCR擴(kuò)增儀、高速離心機(jī)、恒溫金屬浴和生物安全柜是PCR實(shí)驗(yàn)室的主要儀器，每次工作前后對(duì)這些儀器設(shè)備進(jìn)行擦拭清潔(宜用75%的乙醇，不用次氯酸鈉)，工作結(jié)束后用紫外線燈進(jìn)行照射消毒，同時(shí)要確保儀器設(shè)備有良好的工作性能，如有問(wèn)題及時(shí)報(bào)修，并同時(shí)做好記錄。

2.2試劑耗材的管理試劑耗材的好壞直接影響檢測(cè)結(jié)果，所以試劑耗材的管理也相當(dāng)重要，最好選用高質(zhì)量的PCR儀器配套試劑和PCR實(shí)驗(yàn)室專用耗材(例如帶濾芯的槍頭)。如果試劑耗材的選購(gòu)沒(méi)有問(wèn)題,接下來(lái)就要考慮試劑耗材的儲(chǔ)存,試劑耗材的儲(chǔ)存條件和儲(chǔ)存位置也非常講究,要嚴(yán)格按照要求來(lái)做，以試劑標(biāo)本不混放，防止試劑大規(guī)模污染，先用效期短的試劑后用效期長(zhǎng)的試劑，不浪費(fèi)、不使用過(guò)期試劑，不同批號(hào)試劑不混放，不同項(xiàng)目試劑區(qū)別存放，新舊試劑不混放為原則[5]。

2.3環(huán)境衛(wèi)生的管理嚴(yán)格遵守從Ⅰ區(qū)→Ⅱ區(qū)→Ⅲ區(qū)的單一方向制度，不得反向進(jìn)入前一個(gè)區(qū)。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服和物品(如不同顏色)，當(dāng)工作人員離開(kāi)時(shí)不得將本區(qū)的工作服和物品帶至其他區(qū)域，盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性[6]。每個(gè)區(qū)都應(yīng)該有獨(dú)立的清潔工具，每個(gè)區(qū)的清潔工具不能混用，清潔的時(shí)候應(yīng)該從Ⅰ區(qū)→Ⅱ區(qū)→Ⅲ區(qū)單一方向進(jìn)行清潔消毒，工作結(jié)束后用75%的乙醇擦拭工作臺(tái)面，然后用紫外線燈進(jìn)行照射,最后要注意實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)換氣。從上述要求可以看出要想得到準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)結(jié)果，把好PCR實(shí)驗(yàn)室環(huán)境衛(wèi)生這一關(guān)也是非常重要的。

2.4人員培訓(xùn)的管理人員是PCR實(shí)驗(yàn)室的核心，控制著實(shí)驗(yàn)室的每一個(gè)環(huán)節(jié),每一個(gè)錯(cuò)誤或不當(dāng)?shù)呐e動(dòng)都有可能影響檢測(cè)結(jié)果，所以對(duì)人員的要求相當(dāng)高。PCR實(shí)驗(yàn)室的工作人員必須是取得PCR上崗證的人員，對(duì)那些剛進(jìn)入PCR實(shí)驗(yàn)室還沒(méi)有拿到PCR上崗證的人員，必須在取得PCR上崗證的同事的指導(dǎo)下進(jìn)行工作，最后檢測(cè)報(bào)告由取得PCR上崗證的人員出具，同時(shí)新員工要盡快參加國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)或上海市臨床檢驗(yàn)中心的培訓(xùn)，爭(zhēng)取在最短的時(shí)間內(nèi)取得PCR上崗證。另外，要求員工能善于發(fā)現(xiàn)并解決問(wèn)題，能嚴(yán)格按照PCR實(shí)驗(yàn)室的操作規(guī)程操作。

3PCR實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理

3.1室內(nèi)質(zhì)量管理室內(nèi)質(zhì)控就是用一種穩(wěn)定物質(zhì)，通過(guò)自己重復(fù)檢測(cè)得到這種物質(zhì)在儀器檢測(cè)系統(tǒng)上的一個(gè)檢測(cè)值，然后通過(guò)統(tǒng)計(jì)方法建立質(zhì)控范圍，用來(lái)監(jiān)控室內(nèi)精密度的質(zhì)控方法。標(biāo)本采集和核酸提取是PCR檢測(cè)流程中最重要的兩步,每一步都應(yīng)有相應(yīng)的質(zhì)量控制措施。在開(kāi)展質(zhì)控前,每位工作人員要對(duì)質(zhì)控的重要性、基礎(chǔ)知識(shí)、一般方法有充分的了解，并在質(zhì)控的實(shí)際工作中進(jìn)行不斷提高。因此，室內(nèi)質(zhì)控要求實(shí)驗(yàn)人員做好記錄，持之以恒，不斷總結(jié)提升。

3.2室間質(zhì)量管理室間質(zhì)控就是用一種穩(wěn)定物質(zhì)，分發(fā)到各個(gè)實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別用各自的儀器檢測(cè)該物質(zhì)，得到一組檢測(cè)值，用統(tǒng)計(jì)方法得到該物質(zhì)的檢測(cè)值可接受范圍，用來(lái)評(píng)判檢測(cè)系統(tǒng)是否與其他檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果一致的質(zhì)控方法。因此，為了出具的報(bào)告結(jié)果可信，參加室間質(zhì)控也非常重要。對(duì)于在室間質(zhì)控中出現(xiàn)的問(wèn)題，要認(rèn)真的分析原因，找出問(wèn)題所在，針對(duì)問(wèn)題進(jìn)行改進(jìn),通過(guò)不斷的學(xué)習(xí)總結(jié)檢驗(yàn)水平才會(huì)提高。

4小結(jié)

隨著PCR技術(shù)的不斷成熟發(fā)展，它在臨床實(shí)驗(yàn)室中的運(yùn)用也越來(lái)越多，給臨床醫(yī)生對(duì)疾病的診斷治療提供了很大的幫助。但由于PCR技術(shù)的特殊性，想要開(kāi)展PCR實(shí)驗(yàn)室就必須嚴(yán)格按照要求建立和管理。只要能按照PCR實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)建立實(shí)驗(yàn)室，采取標(biāo)準(zhǔn)化的的管理,就可以保證操作的安全性和結(jié)果的可靠性，就可以為臨床提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.067

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1673-4130(2016)05-0714-03

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