陳　晨，周艷容，明宏艷，王小晉，廖鳳蘭，朱云楓，王　勁

(1.廣東國際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東廣州 510623；2.淮安出入境檢驗檢疫局，江蘇淮安 223021)

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·論著·

近紅外熒光標記-免疫磁珠偶聯(lián)法定量檢測結核分枝桿菌ESAT-6蛋白

陳晨1，周艷容1，明宏艷1，王小晉2，廖鳳蘭1，朱云楓1，王勁1

(1.廣東國際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東廣州 510623；2.淮安出入境檢驗檢疫局，江蘇淮安 223021)

摘要:目的建立定量檢測結核分枝桿菌早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)的近紅外熒光標記-免疫磁珠偶聯(lián)法。方法以近紅外熒光染料(Dylight 800)標記靶向ESAT-6的單克隆抗體，靶向ESAT-6的多克隆抗體包被在納米磁珠表面。采用雙抗體夾心法，磁性分離結合物和游離物，采用便攜式高靈敏度低噪聲激發(fā)式熒光檢測儀檢測磁性結合物的熒光強度，從而檢測待檢樣品中ESAT-6水平。結果該方法的檢測線性范圍為2.4～750.0 ng/mL，最低檢測限為0.48 ng/mL；10 ng/mL水平加樣回收率為96%，50 ng/mL水平加樣回收率為95%；批間變異系數(shù)(CV)為5.8%，批內(nèi)CV為4.3%。該方法檢測胸腔積液標本ESAT-6的特異度為80%，靈敏度為95%。結論該方法檢測ESAT-6的線性范圍廣、靈敏度高、穩(wěn)定性好。

關鍵詞:近紅外熒光；免疫磁珠；結核分枝桿菌早期分泌抗原靶-6；定量檢測

結核病是一種古老的傳染性疾病，目前全世界約有1/3的人口感染結核分枝桿菌，每年有近800萬人死于肺結核[1]；耐藥和多重耐藥菌株的大量出現(xiàn)，又為結核病的控制帶來更大的困難。此外，更多的研究還證實結核分枝桿菌能增強人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的復制，因此在艾滋病患者中雙重感染者眾多，成為導致患者死亡的主要原因。目前對于結核分枝桿菌感染的實驗室診斷主要是基于涂片抗酸染色、細菌培養(yǎng)、核酸檢測及相關抗體的檢測，以上方法存在著靈敏度低、特異性差、耗費時間或檢測成本高的缺點。近年來隨著蛋白質(zhì)組學研究的深入，多種與結核分枝桿菌相關的蛋白被發(fā)現(xiàn)，這些蛋白是否能夠成為結核分枝桿菌感染診斷的特異性抗原標志物激發(fā)了大家的興趣。結核分枝桿菌早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)是結核分枝桿菌在感染早期的分泌性抗原，也是結核分枝桿菌短期培養(yǎng)物的過濾后蛋白質(zhì)中具有免疫保護力的抗原。既是重要的T淋巴細胞抗原，也具有刺激B淋巴細胞反應的抗原決定簇。它只存在于結核分枝桿菌復合群和少量致病性分枝桿菌中，且在卡介苗中缺失[2]。李新玲等[3]曾建立了基于時間分辨熒光的方法來檢測ESAT-6、CFP100融合蛋白，取得了滿意的結果。本文建立了一種定量檢測結核分枝桿菌ESAT-6的方法，將納米磁珠偶聯(lián)與近紅外熒光標記法結合起來，利用納米磁珠表面羧基活化后可與抗體表面的氨基共價結合，從而將抗體固定到納米磁珠表面，發(fā)揮了納米磁珠比表面積大，吸附性強，懸浮穩(wěn)定性好，有利于抗原抗體反應順利進行的特點；同時，近紅外熒光染料具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，它的激發(fā)光及發(fā)射光光譜均在近紅外區(qū)域，可最大限度減少環(huán)境中雜散熒光物質(zhì)的干擾。

1材料與方法

1.1標本來源臨床胸腔積液標本搜集自廣州市胸科醫(yī)院，其中結核性胸腔積液標本20份，惡性胸腔積液標本20份，均采集自臨床明確診斷病例，符合相關診斷標準。

1.2儀器與試劑便攜式流動進樣熒光檢測器(中科院理論物理所制備的樣機，該設備固化為激發(fā)光波長777 nm，發(fā)射光波長790 nm)；Dylight 800購自美國Thermofisher公司；鼠抗ESAT-6單克隆抗體(100 μg/100 μL)、兔抗鼠ESAT-6多克隆抗體(1 mg/mL)均購自美國Pierece 公司；納米磁珠購自武漢哇哇噻納技術開發(fā)有限公司北京生物技術研究所；ESAT-6(全片段重組蛋白，1.5 mg/mL)購自杭州啟泰生物公司；結核分枝桿菌標準株(H37Rv ATCC27294)、牛分支桿菌卡介苗(BCG)株、牛結核分枝桿菌株、偶然分枝桿菌株、恥垢分枝桿菌株為臨床分離株，均來自于淮安市疾病控制中心。

1.3方法

1.3.1制備近紅外熒光染料標記的ESAT-6單克隆抗體按照產(chǎn)品說明書要求，將Dylight800用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋10倍，取1.4 μL與20 μg鼠抗ESAT-6單克隆抗體(1 mg/mL)輕柔混合均勻后于室溫避光反應2 h；反應結束后，將標記產(chǎn)物放入透析袋中，4 ℃，PBS透析4 h。標記好的抗體溶液中添加終濃度為1.5%胎牛血清(BSA)、0.1%吐溫20(Tween-20)及0.1‰疊氮化鈉(NaN3)，4 ℃保存；使用前將標記產(chǎn)物以PBS稀釋2 000倍。

1.3.2制備ESAT-6多克隆抗體包被的納米磁珠按照納米磁珠使用說明書進行處理。(1)預處理：輕輕混勻磁珠懸浮液，吸取0.01 mL懸浮液(25 mg/mL)加入1.5 mL EP管中；再加入0.1 mL雙蒸水(ddH2O)，輕輕混勻并將試管架置于磁板上，靜置2 min后吸取上清液；重復上述步驟1次；加入1 mL 0.1 mol/L的2-N-嗎啡啉乙磺酸溶液(MES，pH5.0)，重懸磁珠。(2)活化：將上述EP管置于磁板上，用1 mL MES洗滌2次，棄上清；臨用前配制終濃度為0.1 mol/L的MES，其內(nèi)含碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的濃度均為40 g/L(加入上述兩種物質(zhì)后，置于振蕩器上充分混勻15 min，待用)。用該MES液重懸磁珠，用磁板吸附磁珠，棄上清，重復該步驟1次，即得活化磁珠。(3)磁珠與蛋白的偶聯(lián)：在上述已活化的磁珠中加入50 μL ESAT-6多克隆抗體(1 mg/mL)和500 μL偶合液(pH5.5 PBS)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2 h；用PBS緩沖液(pH5.5，0.05% Tween-20)清洗3次，吸附棄上清；加入封閉液(1 mL Tris緩沖液，0.1 mol/L，含0.1% BSA)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2 h；加入1 mL PBS緩沖液(pH5.5，0.05% Tween-20)，靜置2 min，棄上清，重復3次；棄上清時，試管需置于磁板上；加入1 mL保存液(PBS，pH7.4，含0.05% Tween-20、0.1% BSA、0.05 NaN3)待用。

1.3.3檢測流程取50 μL待檢樣品與50 μL熒光標記的ESAT-6單抗，于EP管中混勻，37 ℃反應30 min；將包被了多抗的磁珠稀釋10倍后，取50 μL加入該EP管，37 ℃反應15 min；再加入500 μL ddH2O，磁板上靜置2 min，棄上清，重復該步驟3次；管中加入100 μL PBS(pH7.4)，混勻，用便攜式流動進樣熒光檢測器進行熒光強度測定。

1.3.4ESAT-6檢測的標準曲線將ESAT-6全片段重組蛋白用PBS稀釋成0.48、2.40、12.00、60.00、300.00、750.00、1 500.00 ng/mL的7種不同濃度樣品，每個濃度設置兩個平行樣，按照1.3.3所示方法進行檢測，繪制檢測ESAT-6的標準曲線。

1.3.5方法的性能評價挑取培養(yǎng)基中結核分枝桿菌標準株(H37Rv ATCC27294)、牛結核分枝桿菌株、偶然分枝桿菌株、恥垢分枝桿菌株、BCG的單個菌落，分別溶于1 mL PBS中離心取上清進行測定，以確定檢測體系的特異性；將ESAT-6倍比稀釋以確定檢測限量；配制10 ng/mL和50 ng/mL的ESAT-6標準溶液計算回收率，采用同日內(nèi)連續(xù)20次檢測和連續(xù)20 d檢測的方法計算批內(nèi)(批間)變異系數(shù)(CV)，評價其準確性、穩(wěn)定性。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，采用最小二乘法對標準曲線進行擬合。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，計算ROC曲線下面積(AUC)。

2結果

2.1近紅外熒光標記-免疫磁珠偶聯(lián)法定量檢測結核分枝桿菌ESAT-6的標準曲線將ESAT-6全片段重組蛋白用PBS稀釋成濃度為0.48、2.40、12.00、60.00、300.00、750.00、1 500.00 ng/mL的樣品，其線性范圍為2.4～750.0 ng/mL，檢測限量為0.48 ng/mL；以ESAT-6濃度的對數(shù)值為縱坐標，以儀器熒光示數(shù)值為橫坐標，繪制標準曲線，擬合相關系數(shù)r2=0.991 8，函數(shù)方程為Y=1.207 7X+0.261 1。見圖1。

圖1　近紅外熒光標記-免疫磁珠偶聯(lián)法檢測

2.2方法的特異性評價結核分枝桿菌標準株(H37Rv ATCC27294)熒光示數(shù)值為0.76，牛結核分枝桿菌株、偶然分枝桿菌株、恥垢分枝桿菌株的熒光示數(shù)值分別為0.01、0.01、0.02，BCG株熒光示數(shù)值為0，表明采用本方法檢測ESAT-6與其他結核株無交叉反應。

2.3方法的回收率評價將100 ng/mL的ESAT-6溶液，加入ESAT-6檢測為5.6 ng/mL的胸腔積液標本中，制成終濃度為10 ng/mL和50 ng/mL的兩個樣品，進行回收試驗測定，回收率分別為96%和95%。見表1。

表1　　回收率試驗結果

2.4批內(nèi)和批間精密度試驗將上述標準液，取平行樣，1 d內(nèi)連續(xù)進行20次測試，結果顯示批內(nèi)CV為4.3%；連續(xù)20 d進行重復測試，結果顯示批間CV為5.8%。

2.5臨床標本檢測結果取結核性胸腔積液和惡性胸腔積液各20份，分兩組，檢測其ESAT-6濃度。結果發(fā)現(xiàn)，結核性胸腔積液ESAT-6水平分布在8.5～217.0 ng/mL之間，均值為119.6 ng/mL；惡性胸腔積液ESAT-6水平分布在5.3～36.5 ng/mL之間，均值為18.6 ng/mL。繪制ROC曲線，AUC為0.900，以9.1 ng/mL為臨界值，該方法的靈敏度為95%，特異度80%。見圖2。

圖2　　檢測胸腔積液中ESAT-6 的ROC曲線

3討論

傳統(tǒng)的免疫學檢測方法常采用同位素、熒光素、生物素或者酶作為免疫反應的指示劑，反應支持介質(zhì)多為聚丙烯孔板、瓊脂等，具有一定的局限性，并且部分指示物具有環(huán)境污染性，或者宜受環(huán)境因素的影響，信號放大能力弱。此外，固體介質(zhì)作為反應支持物，可能對蛋白質(zhì)的構象展開有影響，不利于抗原抗體反應的進行。本研究首次采用Dylight 800這種新型近紅外熒光染料作為免疫反應的高效信號指示劑，利用其熒光強度強、熒光壽命長、穩(wěn)定性好、生物相容性優(yōu)的特點[4-6]，同時采用了納米磁珠作為反應支持平臺，將免疫反應的分離和富集連為一體，以ESAT-6作為檢測對象，建立了定量檢測的方法。

Dylight800標記抗體，操作簡便，標記效率高，據(jù)試劑盒提供的數(shù)據(jù)表明，其標記效率約為87%，優(yōu)于其他種類的標記物。本方法的批內(nèi)和批間CV分別為4.3%、5.8%，可以體現(xiàn)Dylight800熒光壽命長、穩(wěn)定性好的特點，因而其在臨界值灰區(qū)判定時可能具有優(yōu)勢。同時，穩(wěn)定的檢測結果可為臨床治療效果的評價及試驗結果的判斷提供可靠的參考依據(jù)。

Dylight 800作為免疫反應信號指示劑，由于其激發(fā)光和發(fā)射光波長均在近紅外波長區(qū)域內(nèi)，可見光波長范圍外，所以在本研究的特異性評價試驗中，除了結核分枝桿菌標準株(H37Rv ATCC27294)在測試時可檢出反射光以外，其他菌株或產(chǎn)生極其微弱的發(fā)射光或未檢出光強度，表明其抗外界干擾能力強。

納米磁珠在本研究中作為反應支持平臺，具有比表面積大，吸附性強，懸浮穩(wěn)定性好的優(yōu)點。與Dylight 800共同搭建起來的免疫反應系統(tǒng)，近似于液體環(huán)境，有利于蛋白質(zhì)空間構象的完整展開，將免疫反應的分離和富集連為一體，使得抗原抗體反應能夠順利進行。

胸腔積液是一個很好的培養(yǎng)基，結核菌在生長過程中產(chǎn)生的分泌蛋白不可避免地漏于其中，同時胸腔積液也是一個很好的富集環(huán)境，適于作為檢測樣品。在以ESAT-6為靶目標的結核分枝桿菌檢測臨床研究中，多數(shù)學者關注患者血清和腦脊液中ESAT-6的表達[3，7]，并取得了滿意的結果。在本研究中，初步嘗試用建立的方法對胸腔積液ESAT-6水平進行檢測，從而鑒別診斷胸腔積液的性質(zhì)，結果顯示檢測的特異度為80%，靈敏度為95%。但是，本研究由于缺少足夠量的臨床標本，因而所得結果具有一定的局限性，其臨床意義還需要大量的臨床標本檢測數(shù)據(jù)和方法學比對來進行驗證。

綜上所述，本研究僅對納米磁珠-近紅外熒光標記的免疫反應體系的應用進行了初步研究，結果表明其檢測性能滿意。

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Study on quantitatively detecting Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 antigen by using near-infrared fluorescent dye-immunomagnetic beads coupling method

ChenChen1，ZhouYanrong1，MingHongyan1，WangXiaojin2，LiaoFenglan1，ZhuYunfeng1，WangJin1

(1.GuangdongInternationalTravelHealthCareCenter,Guangzhou,Guangdong510623,China；2.HuaianEntry-exitInspectionAndQuarantineBureau,Huaian,Jiangsu223001,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a near-infrared fluorescent dye-immunomagnetic beads coupling method for quantitative detection of Mycobacterium tuberculosis early secretory antigenic target-6(ESAT-6).MethodsNear-infrared fluorescent dye,dylight 800,was used to mark ESTA-6-targeting monoclonal antibodies,and the surface of nano-magnetic beads were coated with ESAT-6-targeting polyclonal antibodies.Double antibody sandwich method was used for magnetic separation of conjugates and dissociants.Portable high-sensitivity and low-noise excitation fluorescence detector was used to detect the intensity of magnetic combination,so as to test the ESAT-6 content in test samples.ResultsThe detecting linear range of this method was 2.4-750.0 ng/mL,and the minimum detection limit was 0.48 ng/mL.The recovery rate was 96% at a concentration of 10 ng/mL,and at a concentration of 50 ng/mL the recovery rate was 95%.The between-run coefficient of variation(CV)value was 5.8%,and the within-run CV value was 4.3%.The specificity and sensitivity of this method for detecting ESAT-6 in clinical pleural effusion samples were 80% and 95%,respectively.ConclusionThis method might have wide linear range,high sensitivity and good stability in the detection of ESAT-6.

Key words:near-infrared fluorescent；immunomagnetic beads；Mycobacterium tuberculosis early secretory antigenic target-6；quantitative detection

(收稿日期：2015-12-19)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.018

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0623-03

作者簡介：陳晨，女，主治醫(yī)師，主要從事口岸出入境人員結核分枝桿菌的快速檢測研究。