葉楊芹，包裕杰，馬　珂，張?chǎng)┭?，奚　婷，陳芳?宗　明，范列英

(上海市東方醫(yī)院/同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200120)

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·論著·

表皮葡萄球菌生物膜形成與細(xì)菌耐藥性的相關(guān)性分析

葉楊芹，包裕杰，馬珂，張?chǎng)┭?，奚婷，陳芳?宗明，范列英

(上海市東方醫(yī)院/同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200120)

摘要:目的探討表皮葡萄球菌臨床分離株生物膜的形成情況,分析其生物膜形成與細(xì)菌耐藥性的相關(guān)性。方法收集2014年1月至2015年2月住院患者血標(biāo)本分離出的表皮葡萄球菌62株，采用生物膜形成試驗(yàn)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌生物膜，并采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果利用生物膜形成試驗(yàn)檢出生物膜陽(yáng)性菌株23株，檢出率為37.1%；PCR擴(kuò)增試驗(yàn)檢出icaA基因27株，檢出率為43.5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩種方法同時(shí)陽(yáng)性的菌株為14株。生物膜陽(yáng)性菌株對(duì)所測(cè)抗菌藥物的耐藥率普遍高于生物膜陰性菌株，其中對(duì)慶大霉素、青霉素G、苯唑西林、左旋氧氟沙星、頭孢西丁的耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，所有菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/達(dá)福普汀均敏感。結(jié)論兩種方法對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的檢出率無(wú)明顯差異，生物膜陽(yáng)性菌株耐藥率普遍高于生物膜陰性菌株。

關(guān)鍵詞:表皮葡萄球菌；生物膜；耐藥性；ica操縱子

表皮葡萄球菌是一類凝固酶陰性的革蘭陽(yáng)性球菌，是寄生于人體的正常菌群之一，屬于條件致病菌。近年來(lái)，隨著多種插管、透析技術(shù)、人工心瓣膜、人工晶體、人工關(guān)節(jié)等侵入性醫(yī)療材料的使用，表皮葡萄球菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一。表皮葡萄球菌容易黏附于異物表面，形成細(xì)菌生物膜，增加臨床治療難度，造成嚴(yán)重危害[1]。本研究以引起血流感染的表皮葡萄球菌為研究對(duì)象，利用生物膜形成實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)方法篩選生物膜陽(yáng)性細(xì)菌，并進(jìn)一步分析表皮葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥特征，以期更好地了解表皮葡萄球菌耐藥性與生物膜形成的相關(guān)性，為指導(dǎo)臨床有效地預(yù)防及控制表皮葡萄球菌感染奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株來(lái)源收集本院2014年1月至2015年2月住院患者血液標(biāo)本分離得到的表皮葡萄球菌62株(單瓶血培養(yǎng)瓶陽(yáng)性檢出視為污染菌，不作為實(shí)驗(yàn)用菌株)。以表皮葡萄球菌ATCC12228(SE ATCC12228)為生物膜形成的陰性對(duì)照株，以金黃色葡萄球菌ATCC25923為藥敏質(zhì)控菌株及icaA陰性對(duì)照菌株。

1.2儀器與試劑Micro-Scan Walkaway-96 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(德國(guó)西門(mén)子公司)，ABI-7000熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)，Biotek-Elx808U酶標(biāo)儀(美國(guó)伯滕儀器有限公司)。PCR反應(yīng)所需試劑及引物購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；LB肉湯、結(jié)晶紫、Bouin固定液、瓊脂糖均為國(guó)產(chǎn)分析純；抗菌藥物紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；血瓊脂平板、M-H瓊脂平板購(gòu)自北京賽默飛世爾有限公司。

1.3方法

1.3.2PCR擴(kuò)增檢測(cè)icaA基因(1)表皮葡萄球菌基因組DNA的提?。簩⑴R床分離的表皮葡萄球菌及指控菌株接種于血平板上，35 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。用接種環(huán)取適量菌于300 μL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后12 000 r/min離心5 min，去上清。在上清中加入300 μL無(wú)菌水，充分混勻，煮沸15 min，12 000 r/min離心5 min，留上清。(2)PCR擴(kuò)增檢測(cè)icaA基因：通過(guò)PCR的方法特異性擴(kuò)增icaA 基因。50 μL PCR擴(kuò)增體系：25 mmol/L氯化鎂(MgCl2)3 μL，10 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL，0.5 μL)，10×PCR(25 mmol/L，5 μL)，上游引物5′-GAT GGG CTC AAG GCG GGC AT-3′(50 pmol/L，1 μL)，下游引物5′-GAT GGG CTC AAG GCG GGC AT-3′(50 pmol/L，1 μL)，DNA模板5 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析：1%瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液，用0.5 μg/mL溴化乙錠染色，150 V電壓下電泳約30 min，將PCR擴(kuò)增所得特異性片段克隆測(cè)序，并在MegaBlast上進(jìn)行基因序列比對(duì)。

1.3.3藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)對(duì)所有表皮葡萄球菌臨床分離株及質(zhì)控菌株做藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI )2013版判斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[3]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用WHONET5.6軟件進(jìn)行細(xì)菌耐藥性分析。采用SAS6.12軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1半定量黏附試驗(yàn)結(jié)果利用生物膜形成實(shí)驗(yàn)檢出生物膜陽(yáng)性菌株23株，檢出率為37.1%，部分結(jié)果見(jiàn)圖1(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.2PCR擴(kuò)增結(jié)果62株表皮葡萄球菌臨床分離株中有27株檢出icaA，檢出率為43.5%，特異性片段長(zhǎng)度在300～400 bp之間，見(jiàn)圖2。將PCR擴(kuò)增得到特異性片段克隆測(cè)序，得到片段長(zhǎng)度為386 bp，經(jīng)與GeneBank比對(duì)為icaA基因。

泳道1~4、6、7、9：表皮葡萄球菌臨床分離株；泳道8：金黃色葡萄球菌ATCC25923；泳道5：DL500 ladder。

圖2PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3兩種方法檢測(cè)生物膜的結(jié)果比較ica基因檢測(cè)與半定量黏附試驗(yàn)檢測(cè)菌株生物膜陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.41，P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　　兩種方法檢測(cè)生物膜的結(jié)果比較(n)

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果生物膜陽(yáng)性菌株與生物膜陰性菌株對(duì)慶大霉素、青霉素G、苯唑西林、左旋氧氟沙星、頭孢西丁的耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)其余檢測(cè)藥物的耐性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　　表皮葡萄球菌臨床分離株細(xì)菌耐藥性比較[n(%)]

-：無(wú)數(shù)據(jù)。

3討論

生物膜具有保護(hù)細(xì)菌、對(duì)抗抗菌藥物、促進(jìn)細(xì)菌逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用，使細(xì)菌對(duì)抗菌藥物和機(jī)體免疫力的抵抗能力大大增強(qiáng)，出現(xiàn)耐藥，甚至多重耐藥，為臨床預(yù)防及治療細(xì)菌感染帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。因此，正確認(rèn)識(shí)表皮葡萄球菌的生物膜及其形成機(jī)制和相關(guān)因子的調(diào)控，將對(duì)臨床防治起到有效的指導(dǎo)作用。

3.1表皮葡萄球菌生物膜形成能力分析表皮葡萄球菌形成生物膜除了受周圍環(huán)境的影響外，還受到自身遺傳基因的調(diào)控。多糖胞間黏附素(PIA)是表皮葡萄球菌生物膜形成的必需成分[4-8]，表皮葡萄球菌可產(chǎn)生大量PIA。目前，明確的是PIA合成的基礎(chǔ)為ica基因，ica基因位點(diǎn)包含一個(gè)操縱子結(jié)構(gòu)icaADBC，4個(gè)基因序列依次排列，其中icaD基因位于icaA和icaB基因之間，且與二者有部分重疊。國(guó)內(nèi)邢銘友等[9]研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌ica操縱子的存在與生物膜表型密切相關(guān)，PIA的合成是生物膜形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本研究利用生物膜形成試驗(yàn)(半定量黏附試驗(yàn))檢測(cè)出的生物膜陽(yáng)性菌株為23株，檢出率為37.1%。；而利用PCR擴(kuò)增icaA基因檢測(cè)生物膜測(cè)得陽(yáng)性菌株27株，檢出率為43.5%?；驒z測(cè)的檢出率略高于生物膜形成試驗(yàn),但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩種方法檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有13株菌株icaA基因檢測(cè)陽(yáng)性，而生物膜形成試驗(yàn)結(jié)果為陰性。初步認(rèn)為可能的原因有以下兩種：(1)檢測(cè)到icaA 基因可能由于某種缺失或抑制等原因得不到充分的表達(dá)或完全沒(méi)有表達(dá)，因而無(wú)法形成生物膜；(2)本試驗(yàn)中檢測(cè)的ica基因?yàn)閕caA基因型，并沒(méi)有對(duì)icaD、icaC、icaB基因型進(jìn)行檢測(cè),而icaA、icaD和icaC這3個(gè)基因型，任何缺失或突變都有可能影響生物膜的形成，因此，所測(cè)菌株可能由于缺失或突變等原因不表達(dá)或弱表達(dá)icaD、icaC、icaB基因而無(wú)法形成生物膜。此外，icaA、icaD、icaB、icaC基因的表達(dá)還受其他生物因子(如SigB因子、RsbU因子)及環(huán)境因子(氯化鈉、乙醇)的影響[10]。確切原因涉及表皮葡萄球菌生物膜的基因調(diào)控等多方面因素，機(jī)制較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步學(xué)習(xí)、研究。本研究結(jié)果中還有9株菌株為生物膜形成試驗(yàn)陽(yáng)性而基因檢測(cè)結(jié)果為陰性。其原因可能是表皮葡萄球菌生物膜的形成受到除受icaA、icaD、icaB、icaC調(diào)控外，還受到其他調(diào)控機(jī)制的影響，值得深入探討[11-12]。

3.2表皮葡萄球菌生物膜形成與細(xì)菌耐藥性的相關(guān)性生物膜陽(yáng)性菌株對(duì)慶大霉素、青霉素G、紅霉素、左旋氧氟沙星的耐藥率均在65%以上，而對(duì)苯唑西林、克林霉素、頭孢西丁的耐藥率在50%以下。對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑和利福平也存在一定程度的耐藥。生物膜陰性菌株耐藥率整體低于生物膜陽(yáng)性菌株，其中對(duì)慶大霉素、青霉素G、苯唑西林、左旋氧氟沙星、頭孢西丁的耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示生物膜陽(yáng)性細(xì)菌對(duì)上述抗菌藥物的耐藥性更明顯。隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖及抗菌藥物的使用，敏感菌群受到抑制，而耐藥菌得到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，細(xì)菌形成生物膜后定植在體內(nèi)，難以清除，而生物膜又極大地限制了抗菌藥物的作用效果，增加了臨床治療難度。此外，未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素、奎奴普丁/達(dá)福普汀和利奈唑胺耐藥的菌株。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌臨床分離株有一定的生物膜形成能力，因本次試驗(yàn)所用菌株分離自住院患者血液，分析生物膜形成可能與細(xì)菌從皮膚定植部位入侵或靜脈留置針使用增加定植黏附風(fēng)險(xiǎn)等有關(guān)。形成生物膜的菌株較生物膜陰性菌株耐藥率高，提示應(yīng)該采取有效手段消毒滅菌，降低生物膜形成率，減少醫(yī)療及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

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Analysis on correlation between biofilm formation and bacterial resistance in Staphylococcus epidermidis

YeYangqin，BaoYujie，MaKe，ZhangWenyan，XiTing，ChenFangying，ZongMing，F(xiàn)anLieying

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiEastHospital/EastHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200120,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the formation of biofilm in clinical isolates of Staphylococcus epidermidis,and to analyse the correlation between biofilm formation and antibacterial resistance of Staphylococcus epidermidis.MethodsA total of 62 strains of Staphylococcus epidermidis isolated from blood specimens of inpatients with bloodstream infection,from January 2014 to February 2015,were collected.The biofilm formation of Staphylococcus epidermidis was detected by using the semi-quantitative adherence assay and polymerase chain reaction(PCR) amplification experiment.The antibacterial susceptibility test was carried out according to K-B method.ResultsThe positive rate of biofilm formation detected by using the semi-quantitative adherence assay and PCR for icaA gene were 37.1%(23 strains) and 43.5%(27 strains) respectively,and there was no statistically significant difference(P>0.05).There were 14 positive strains detected by both methods.The resistance rates of strains producing biofilm to antibacterial agents were generally higher than those of non-producing biofilm strains,and there were statistically significant differences in resistance rates of strains to gentamicin,penicillin,oxacillin,levofloxacin and cefoxitin(P<0.05).All bacteria were sensitive to vancomycin,linezolid and quinupristin/dalfopristin.ConclusionThere is no significant difference between the two methods in detecing biofilm formation.The resistance rates of strains producing biofilm to antibacterial agents were generally higher than those of non-producing biofilm strains.

Key words:Staphylococcus epidermidis；biofilm；drug resistance；ica operon

(收稿日期：2015-09-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.016

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)05-0618-03

作者簡(jiǎn)介：葉楊芹，女，主管檢驗(yàn)技師，主要從事臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)研究。