黃建敏，師煜博，陳忠華

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所，

廣西南寧 530021；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所，湖北武漢 430030)

?

·論著·

自然殺傷T淋巴細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)及殺傷功能實(shí)驗(yàn)研究

黃建敏1，師煜博2△，陳忠華3

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所，

廣西南寧 530021；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所，湖北武漢 430030)

摘要:目的探討自然殺傷T淋巴細(xì)胞(NKT細(xì)胞)在細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)及殺傷功能中的作用。方法建立混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)體系，B16F10-luc-G5細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以總淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞。(1)調(diào)節(jié)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)以NKT細(xì)胞或CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞為調(diào)節(jié)細(xì)胞，分為3組：NKT組、CD4+CD25+T組、靶細(xì)胞空白對(duì)照組；另設(shè)有1640空白對(duì)照組(RPMI1640溶液)。(2)殺傷效應(yīng)實(shí)驗(yàn)以NKT或自然殺傷(NK)細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，分為3組：NKT組、NK組、靶細(xì)胞空白對(duì)照組?；旌吓囵B(yǎng)24、48、72 h后，通過(guò)活體成像系統(tǒng)檢測(cè)該培養(yǎng)系統(tǒng)的靶細(xì)胞生物發(fā)光，以監(jiān)測(cè)NKT細(xì)胞的調(diào)節(jié)及殺傷效應(yīng)。結(jié)果(1)調(diào)節(jié)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)：NKT組及CD4+CD25+T組測(cè)定光子數(shù)分別與兩空白對(duì)照組比較，以及NKT組內(nèi)培養(yǎng)24 h與72 h時(shí)測(cè)得光子數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)殺傷效應(yīng)實(shí)驗(yàn)：NKT組及NK組與靶細(xì)胞空白對(duì)照組所測(cè)光子數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且培養(yǎng)24 、72 h時(shí)NKT組與NK組光子數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論NKT細(xì)胞具有抑制總淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，且抑制效應(yīng)具有時(shí)間性，其調(diào)節(jié)作用較CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞強(qiáng)。NKT細(xì)胞具有對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，但較NK細(xì)胞弱。

關(guān)鍵詞:自然殺傷T淋巴細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞；CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞；B16F10-luc-G5細(xì)胞；活體成像系統(tǒng)

人體體內(nèi)有少許T淋巴細(xì)胞表面能表達(dá)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)特有的標(biāo)志，這部分細(xì)胞稱(chēng)為自然殺傷T淋巴細(xì)胞(NKT細(xì)胞)。NKT細(xì)胞參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)、維持免疫穩(wěn)定、防止器官移植排斥，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用?？梢酝ㄟ^(guò)分析NKT細(xì)胞是否具有調(diào)節(jié)總淋巴細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，研究T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用。本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用活體成像系統(tǒng)(IVIS)，在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)中分析帶熒光素標(biāo)記的B16F10-luc-G5黑色素腫瘤細(xì)胞，通過(guò)平均光子數(shù)的變化驗(yàn)證NKT細(xì)胞是否具有抑制總淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，以及是否具備與NK細(xì)胞相似的殺傷靶細(xì)胞的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10-luc-G5購(gòu)自美國(guó)Xenogen公司；雄性健康封閉群BALB/c小鼠購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所動(dòng)物中心。

1.2方法凍存腫瘤細(xì)胞快速融化，加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，獲取BALB/c小鼠淋巴細(xì)胞后，與淋巴細(xì)胞分離液混合，分離并分選NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞。以總淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，B16F10-luc-G5腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為效靶比，建立MLC并進(jìn)行分組。NKT組：效靶比為20∶1，每孔加總淋巴細(xì)胞5×104個(gè)、靶細(xì)胞2.5×103個(gè)；CD4+CD25+T組：效靶比為10∶1，每孔加總淋巴細(xì)胞2.5×104個(gè)、靶細(xì)胞2.5×103個(gè)；靶細(xì)胞空白對(duì)照組：每孔加靶細(xì)胞2.5×103個(gè)；每組均3個(gè)復(fù)孔；1640空白對(duì)照組：僅為RPMI1640溶液。MLC建立后繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72 h檢測(cè)生物發(fā)光，加入細(xì)胞孔中顯像。

2結(jié)果

2.1NKT細(xì)胞和CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的分離與鑒定利用流式細(xì)胞儀分離Babl/c小鼠脾細(xì)胞獲得NKT細(xì)胞和CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度分別為94.6%、93.3%。見(jiàn)圖1～4(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.2NKT細(xì)胞的調(diào)節(jié)效應(yīng)NKT組及CD4+CD25+T組分別與兩空白對(duì)照組測(cè)定光子數(shù)比較，以及NKT組內(nèi)24 h與72 h時(shí)測(cè)得光子數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。通過(guò)IVIS法繪制MLC系統(tǒng)中靶細(xì)胞(B16F10-luc-G5細(xì)胞)生長(zhǎng)狀態(tài)圖，見(jiàn)圖5(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。表明混合培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，NKT細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞均抑制總淋巴細(xì)胞的殺傷功能。

2.3NKT細(xì)胞的殺傷效應(yīng)NKT組各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)光子數(shù)均低于CD4+CD25+T組和靶細(xì)胞空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而各時(shí)間點(diǎn)CD4+CD25+T組光子數(shù)與靶細(xì)胞空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。以IVIS結(jié)果繪制靶細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)圖，見(jiàn)圖6(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.4NKT與NK細(xì)胞直接殺傷靶細(xì)胞的效能比較NKT組和NK組各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)光子數(shù)與靶細(xì)胞空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且NKT組與NK組24及72 h時(shí)光子數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。以IVIS結(jié)果繪制靶細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)圖，見(jiàn)圖7(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

表1　　不同時(shí)間點(diǎn)調(diào)節(jié)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)MLC中靶細(xì)胞光子數(shù)比較

*：P<0.05，與1640空白對(duì)照組比較；#：P<0.05，與靶細(xì)胞空白對(duì)照組比較；△：P<0.05，與同組24 h時(shí)測(cè)得的光子數(shù)比較。

表2　　不同時(shí)間點(diǎn)殺傷效應(yīng)實(shí)驗(yàn)MLC中靶細(xì)胞光子數(shù)比較

*：P<0.05，與NKT組比較。

表3　　不同時(shí)間點(diǎn)直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)實(shí)驗(yàn)MLC靶細(xì)胞光子數(shù)比較

*：P<0.05，與靶細(xì)胞空白對(duì)照組比較；#：P<0.05，與NK組比較。

3討論

NKT參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)、維持免疫穩(wěn)定并防止器官移植排斥，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)的目的在于研究NKT細(xì)胞能否調(diào)節(jié)總淋巴細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，通過(guò)比較NKT細(xì)胞與經(jīng)典的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的體外調(diào)節(jié)功能，以及NKT細(xì)胞與NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷效應(yīng)，分析NKT細(xì)胞的功能。

體外研究表明，在抗原刺激下，NKT細(xì)胞可被CD1d提呈的糖脂類(lèi)抗原激活,α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(α-GalCer)為NKT細(xì)胞的一種高效、特異的刺激抗原。NKT細(xì)胞可迅速分泌大量具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，類(lèi)似于輔助性T淋巴細(xì)胞2(Th2)型分泌白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)、干擾素-γ(IFN-γ) 等，從而影響免疫反應(yīng)類(lèi)型，實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫應(yīng)答和自身免疫的調(diào)節(jié)。Kawano等[1]從人外周血中分離Vα24 NKT細(xì)胞，經(jīng)α-GalCer活化，與惡性黑色素瘤細(xì)胞株HMV-1、胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1等多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vα14+NKT細(xì)胞具體外殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)，活化的Vα24 NKT細(xì)胞對(duì)多數(shù)腫瘤細(xì)胞均有明顯的殺傷作用。在未預(yù)先致敏的情況下，白細(xì)胞介素-12(IL-12)與α-GalCer共同活化的NKT細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系和自體腫瘤組織均具有明顯的細(xì)胞毒活性。由IL-12治療誘導(dǎo)出的NK1.1+V142Jα281+NKT細(xì)胞可以介導(dǎo)腫瘤排斥，過(guò)往輸注經(jīng)IL-12活化的Vα14 NKT細(xì)胞可有效阻止小鼠B16黑色素瘤肝臟轉(zhuǎn)移灶的形成[2]。研究證明，NKT細(xì)胞被α-GalCer激活后分泌的IFN-γ在腫瘤排斥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[3]。Vα24+NKT細(xì)胞的細(xì)胞毒性是通過(guò)穿孔素介導(dǎo)的，并且T淋巴細(xì)胞受體(TCR)Vα24 、CD1d和α2腦苷脂也起一定作用[4]。NKT細(xì)胞并不直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而是通過(guò)IFN-γ介導(dǎo)下游效應(yīng)細(xì)胞，如NK細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的積聚并提高其對(duì)腫瘤的敏感性而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[5]。α-GalCer和IL-12激活的NKT細(xì)胞可增強(qiáng)NK和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的抗腫瘤活性，也可促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞(APC)活化與上調(diào)CD40L表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)IL-12的產(chǎn)生，使腫瘤免疫得到加強(qiáng)[6]。α-GalCer可抑制許多腫瘤的肝轉(zhuǎn)移，且為激活的NKT細(xì)胞的腫瘤殺傷效應(yīng)。NKT細(xì)胞既可通過(guò)識(shí)別靶細(xì)胞上的CD1d-ligand復(fù)合物直接介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)[6]，亦可通過(guò)分泌白細(xì)胞介素-2(IL-2)和IFN γ激活NK細(xì)胞，間接介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)[7]。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，NKT在體外進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)，可發(fā)揮對(duì)B16F10-luc-G5細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，該殺傷效應(yīng)具有時(shí)間性，隨時(shí)間的延長(zhǎng)達(dá)到更大的靶細(xì)胞殺傷作用。通過(guò)與NK細(xì)胞的平行比較發(fā)現(xiàn)，NKT與其有相似的抗腫瘤功能。NK細(xì)胞是細(xì)胞復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的重要組分，而NKT細(xì)胞是免疫細(xì)胞中一個(gè)具特定標(biāo)志的T淋巴細(xì)胞亞群，不同于NK細(xì)胞，兩者均有抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)。雖然NKT細(xì)胞在抗腫瘤能力上弱于NK細(xì)胞，兩者在機(jī)體內(nèi)的功能和作用機(jī)制是否與體外實(shí)驗(yàn)相似，還需進(jìn)一步研究。

另外，NKT細(xì)胞可下調(diào)機(jī)體的免疫監(jiān)視能力，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Moodycliffe等[8]發(fā)現(xiàn)，從紫外線照射的小鼠分離得到的NKT細(xì)胞，作為抑制性T淋巴細(xì)胞在調(diào)節(jié)紫外線誘發(fā)的皮膚癌細(xì)胞生長(zhǎng)中具有重要作用，可抑制體內(nèi)獲得性免疫的產(chǎn)生。紫外線輻射的致癌作用及引起的免疫抑制是通過(guò)NKT細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的[8]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MLC系統(tǒng)中，NKT可以抑制總淋巴細(xì)胞對(duì)B16F10-luc-G5細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，在培養(yǎng)24～48 h內(nèi)可達(dá)到一定的抑制效應(yīng)，但培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)48 h后，該抑制效應(yīng)明顯減弱，通過(guò)與經(jīng)典的調(diào)節(jié)T細(xì)胞(CD4+CD25+T細(xì)胞)進(jìn)行平行比較，NKT亦具有相似的抑制總淋巴細(xì)胞殺傷效應(yīng)的作用。本次實(shí)驗(yàn)可初步顯示NKT具有雙向效應(yīng)，既具備抗瘤作用又有免疫抑制作用。因此，筆者認(rèn)為需要對(duì)NKT進(jìn)行更深入的研究，特別是其釋放的細(xì)胞因子的濃度及相關(guān)蛋白質(zhì)組的變化，以期將針對(duì)NKT細(xì)胞的相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以利于臨床疾病的有效診治。

綜上所述，NKT細(xì)胞在腫瘤免疫調(diào)節(jié)及腫瘤殺傷中起一定作用，國(guó)外臨床上已有針對(duì)NKT進(jìn)行的腫瘤免疫靶向治療，已達(dá)到良好的效果，說(shuō)明NKT細(xì)胞在抑制某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中起著重要作用。

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Study on the immunoregulatory and lethal effects of natural killer T cells on melanoma cells in vitro

HuangJianmin1，ShiYubo2△，ChenZhonghua3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；2.InstituteofRespiratoryDisease,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；3.InstituteofOrganTransplantation,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430030,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the immunoregulatory and lethal effects of natural killer T lymphocytes(NKTs) in vitro.MethodsThe mixed lymphocyte cultured(MLC) system was established, in which the B16F10-luc-G5 cells were set as target cells, the total lymphocyte cells were set as effector cells.(1)In the experiment on immunoregulatory effects, NKT lymphocytes or CD4+CD25+ T lymphocytes were set as regulating cells, there was three groups, including the NKT group, CD4+CD25+ T group and pure target cell control group.Otherewise, the 1640 blank control group was set by only adding RPMI1640 solution.(2)In the experiment on antitumor effects, the NKT or natural killer(NK) lymphocytes were set as killer cells, there was three groups, including the NKT group, NK group and pure target cell control group.Mixed culturing 24, 48 and 72 hours, the bioluminescence of target cells in MCL system was detected by using the in vivo imaging system.Results(1)In the experiment on immunoregulatory effects,there were statistically significant differences in measured average photon numbers between NKT group, CD4+CD25+ T group and the two control groups(P<0.05).The statistically significant differences were also found in the NKT group between 24 hours and 72 hours (P<0.05).(2)In the experiment on antitumor effects,there were statistically significant differences in measured average photon numbers, when the NKT group and NK group were compared to the pure target cell control group(P<0.05).After culturing 24 and 72 hours,statistically significant differences were found between NKT group and NK group(P<0.05).ConclusionThe NKT cells could inhibit the lethal effects of lymphocyte cells on target cells, and the inhibitory effects are changed by the length of culturing.Compared with the CD4+CD25+T lymphocytes, NKT lymphocytes have strongger regulatory effects.Additionally, the NKT cells have lethal effects on target cells, which might be weaker than that of NK cells.

Key words:natural killer T cells；natural killer cells；CD4+CD25+ T lymphocytes；B16F10-luc-G5 cells；in vivo imaging system

(收稿日期：2015-12-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.014

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)05-0613-03

作者簡(jiǎn)介：黃建敏，男，講師，主要從事臨床免疫與微生物學(xué)檢驗(yàn)研究。△通訊作者，E-mail：phoenixdan@126.com。