隋玉飛，劉乃政，司　磊△.東營市河口區(qū)人民醫(yī)院，山東東營 5743；.聊城市人民醫(yī)院，山東聊城 5000)

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·論著·

慢病毒載體介導(dǎo)survivin基因siRNA對裸鼠移植人肺腺癌的體內(nèi)抗癌機制研究*

隋玉飛1，劉乃政2，司磊2△1.東營市河口區(qū)人民醫(yī)院，山東東營 257243；2.聊城市人民醫(yī)院，山東聊城 252000)

摘要:目的探討慢病毒載體介導(dǎo)survivin基因小片段干擾RNA(siRNA)對裸鼠移植人肺腺癌的體內(nèi)抑瘤活性。方法制備表達survivin-siRNA的慢病毒載體，構(gòu)建裸鼠移植人肺腺癌模型，將裸鼠分為空白組(PC組)、空白載體組(NC組)、實驗組(RNAi組)3組，分別給予生理鹽水、空白病毒載體和siRNA；siRNA組腫瘤組織局部注射表達survivin-siRNA的慢病毒載體，觀察腫瘤體積及其隨時間的生長變化曲線；分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白質(zhì)印跡法檢測各組裸鼠腫瘤組織中survivin基因的信史RNA(mRNA)及其表達的蛋白水平變化；采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞周期組方圖變化。結(jié)果慢病毒載體介導(dǎo)survivin-siRNA對裸鼠肺腺癌的抑瘤率為46.07%；siRNA組瘤重與NC組和PC組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而NC組與PC組瘤重比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；siRNA組survivin基因mRNA及蛋白表達較NC組和PC組明顯降低，抑制率分別為72.00%、53.00%；G1期細胞百分比明顯增加，S期細胞百分比則明顯減少。結(jié)論慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌survivin基因的表達，有效激發(fā)細胞凋亡。

關(guān)鍵詞:肺腺癌；survivin基因；小片段干擾RNA；慢病毒載體

RNA干擾(RNAi)技術(shù)可以有效地抑制特定基因的表達，惡性腫瘤組織中survivin基因多為高表達，且survivin基因高表達的惡性腫瘤多預(yù)后不良，而正常組織中該基因并不表達，基于選擇性表達的特性survivin基因成為腫瘤基因治療的研究熱點和新的診斷及治療靶點。有研究證實，抑制survivin基因的表達可明顯誘發(fā)腫瘤細胞凋亡[1]。另外有研究表明，可成功地借助RNAi技術(shù)在體內(nèi)實驗中明顯抑制腫瘤及其衍生血管的生長[2]。本研究采用轉(zhuǎn)染效率最高的慢病毒載體，將合成的靶向survivin基因的小片段干擾RNA(siRNA)通過慢病毒載體導(dǎo)入腫瘤細胞，構(gòu)建裸鼠移植瘤動物模型，采用體內(nèi)給藥的方式觀察腫瘤變化，并檢測該基因在體內(nèi)的表達，以研究RNAi技術(shù)在惡性腫瘤基因治療的體內(nèi)實驗臨床價值。

1材料與方法

1.1實驗動物BALB/C nu/nu裸鼠，4～6周齡，體質(zhì)量約20 g，購于北京中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。裸鼠飼養(yǎng)于恒溫(22～25 ℃)、恒定濕度的無特定病原體(SPF)層流罩中。經(jīng)高壓滅菌的標準飼料和水，供動物自由飲食。

1.2主要試劑慢病毒載體介導(dǎo)的survivin-siRNA由上海吉凱基因公司制備；A549細胞購自上海吉凱基因公司；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)相關(guān)試劑購自德國Qiagen公司；鼠抗人survivn及小鼠抗人β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HCRP)標記二抗購自美國Sigma公司；ECL+plusTM顯色試劑盒購自瑞典Amersham公司；其他試劑由本院中心實驗室提供。

1.3方法

1.3.1survivin-siRNA合成選擇survivin基因(基因序列號為NM_001168)互補DNA(cDNA)序列上的一個位點，利用BLAST確定序列特異性，根據(jù)目的信使RNA(mRNA)序列，設(shè)計3條RNA干擾靶序列(上海吉凱基因化學技術(shù)公司)并合成其短發(fā)夾狀RNA(shRNA)的DNA寡核苷酸(Oligo)，序列如下：正義鏈為5′-GAG GCT GGC TTC ATC CAC TGC-3′，反義鏈為5′-GCA GTG GAT GAA GCC AGC CTC-3′(基因序列位置：241)。把退火的DNA模板雙鏈連接到線性載體中。采用T4連接酶，插入片斷與載體的摩爾比約為3∶1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，在LB Amp培養(yǎng)基上涂板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取轉(zhuǎn)化的菌落PCR，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定具有shRNA編碼序列的陽性克隆。測序鑒定PCR陽性克隆的引物序列，上游引物：5′-GTG TCA CTA GGC GGG AAC AC-3′；下游引物：5′-TTA TTC CCA TGC GAC GGT ATC-3′。

1.3.2慢病毒載體制備綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的慢病毒載體pGCL-GFP 20 μg、pHelper1.0(gag/pol元件)載體15 μg、pHelper2.0(VSVG元件)載體10 μg混合包裝293T細胞，收集轉(zhuǎn)染72 h的293T細胞上清液，于4 ℃，3 000 r/min離心10 min；以0.45 μm濾器過濾后置于40 mL超速離心管中，4 ℃，25 000 r/min離心20 min；而后以冰磷酸鹽緩沖液(PBS)重旋病毒沉淀，于4 ℃溶解過夜。取6個Eppendorf管分裝病毒，每管中加入90 μL預(yù)熱的OptiMEM培養(yǎng)基，加10 μL病毒顆粒于第1管，混勻，從第1管取10 μL混合液于下一管，混勻，依次稀釋病毒顆粒至第6管；將96孔板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加45 μL病毒顆粒稀釋液(記為siRNA1～siRNA6)，37 ℃溫育8 h后，更換含100 ml/L胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡下檢測GFP表達量，計算病毒滴度。

1.3.3體內(nèi)實驗接種肺腺癌細胞懸液8×106個細胞于各BALB/C裸鼠皮下組織內(nèi)，待腫瘤生長至長徑×短徑約10 mm×5 mm時，將裸鼠隨機分為3組：空白組(PC組)、空白載體組(NC組)、實驗組(RNAi組)，每組6～8只，SPF級屏障系統(tǒng)內(nèi)設(shè)IVC環(huán)境飼養(yǎng)。稱體質(zhì)量標號后3組動物分別每只鼠瘤內(nèi)注射生理鹽水、空白載體、Lenti-survivin-siRNA 50 μL 1次。觀察裸鼠生長狀況、出瘤時間，腫瘤細胞接種后如有腫瘤生長，則每7天觀察腫瘤生長情況。當PC組腫瘤長至足夠大時(約500 mm3)，處死全部動物，取腫瘤。測量腫瘤最大直徑及相對應(yīng)的橫徑，根據(jù)公式V(mm3)=π/6×瘤直徑(mm)×瘤橫徑(mm)，計算腫瘤大小及各組抑制率。

1.3.4蛋白質(zhì)印跡法(WB)裂解緩沖液(Lysis Buffer)裂解細胞，取20 μg蛋白上樣，4 ℃，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，400 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)移120 min，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行灰度分析。

1.3.5RT-PCR方法按試劑盒說明書完成RNA的抽提純化和cDNA的合成。RT-PCR擴增survivin基因及內(nèi)參actin特異性引物，上游引物：5′-TCT GGA GGT CAT CTC GGC TGT TC -3′；下游引物：5′-TCA TCC TCA CTG CGG CTG TCT G -3′。擴增電泳并對條帶密度掃描后進行灰度分析。

1.3.6碘化丙錠(PI)染色10 mg/mL的熒光PI染色母液，1∶1 000稀釋加入細胞，37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，PI與細胞核結(jié)合后以PBS洗滌，熒光顯微鏡488 nm激發(fā)光下檢測細胞凋亡，拍照并統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。

1.3.7流式細胞術(shù)(FCM)胰酶收集細胞(1～5)×106/mL，PBS洗滌，70%乙醇固定，1 mL PI染液染色，PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488 nm，發(fā)射光波波長大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光進行流式分析，觀察細胞凋亡情況及細胞周期分布。

2結(jié)果

2.1各組腫瘤生長情況慢病毒載體介導(dǎo)的survivin-siRNA 50 μL瘤內(nèi)注射，模型構(gòu)建及腫瘤生長共計21 d，實驗周期裸鼠無死亡。裸鼠體質(zhì)量無明顯變化，RNAi組抑瘤率為46.07%，RNAi組瘤重與PC組、NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而NC組與PC組瘤重比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。移植人肺腺癌A549裸鼠腫瘤生長曲線，見圖1(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

*：P<0.05，與RNAi組比較。

2.2各組腫瘤組織survivin-mRNA表達情況對電泳條帶進行灰度分析，RNAi組survivin-mRNA表達較PC組、NC組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，抑制率為72.00%。β-Actin表達在各組中比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。見圖2(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.3各組中survivin蛋白的表達對電泳條帶進行灰度測定，并對各組survivin/β-Actin進行統(tǒng)計分析，RNAi組survivin蛋白表達較PC組、NC組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，抑制率為53.00%。β-Actin表達在各組中比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.4FCM檢測細胞周期分析可見PC組及NC組均有標準的G1/G0期二倍體峰及分裂增殖的G2/M期和S期四倍體峰，并無亞二倍體峰出現(xiàn)。RNAi組用門技術(shù)排除聚集碎片等干擾，導(dǎo)入siRNA后出現(xiàn)凋亡細胞，顯示G1/G0期前亞二倍體峰。見圖4(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)和表2。

3討論

RNAi技術(shù)又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默，通過siRNA或shRNA介導(dǎo)可對致病基因進行抑制，該項技術(shù)多用于基因功能及基因治療研究[3-4]。中山醫(yī)科大學與哈佛大學合作成功完成了RNAi體內(nèi)實驗，在小鼠肝炎模型中有效地抑制了Fas基因。國內(nèi)外多項研究提示，RNAi技術(shù)對腫瘤等疾病的治療具有價值[5-6]， RNAi通過抑制癌基因以降低腫瘤的發(fā)生率[7]。

腫瘤中survivin基因的過度表達可抵制細胞凋亡的發(fā)生，并借助有絲分裂促進腫瘤細胞的異常增殖[8]。survivin基因可直接抑制caspase-3和caspase-7的表達[9]，從而阻斷細胞凋亡。此外，survivin可基于細胞周期的依賴性表達，降低G2/M期凋亡發(fā)生， survivin的CDE和CHR可抑制G1期并調(diào)節(jié)G2/M期基因表達的半衰期[10]。其ATG上游200 bp可調(diào)節(jié)survivin的啟動子活性。細胞增殖信號介導(dǎo)survivin入核并結(jié)合Cdk4，激活Cdk2/Cyclin、survivin/Cdk4促使p21釋放，Cdk4與caspase作用而產(chǎn)生抑制凋亡的作用[7]。

慢病毒載體可有效介導(dǎo)大容量基因片段，并且慢病毒感染特性具有宿主免疫反應(yīng)低、安全性好、轉(zhuǎn)染效率高，尤其對腫瘤細胞及干細胞、神經(jīng)細胞等惰性細胞轉(zhuǎn)染率高，可長期穩(wěn)定整合的特點。為了最大效能地解決siRNA不能有效進入細胞內(nèi)的問題，筆者采用了慢病毒載體從而提高其抑制效率。生物治療的靶向性問題主要存在以下兩種：(1)如何在不破壞細胞結(jié)構(gòu)的前提下進入宿主細胞；(2)如何能特異選擇進入某一類型的細胞而不被其他細胞攝取。這兩個問題還需要對細胞表面分子標志及載體技術(shù)的進一步深入研究。目前的載體大多不具備細胞選擇性，在有效進入腫瘤細胞的同時也可以進入正常細胞，因此導(dǎo)致體內(nèi)實驗結(jié)果往往不如體外細胞學實驗理想，這也是國內(nèi)對于RNA干擾體內(nèi)實驗研究較少的原因之一。從本實驗過程來看，體內(nèi)實驗難度要遠大于細胞學實驗，抑制效果亦不如體外實驗明顯，通過該項研究筆者在體內(nèi)實驗積累了寶貴的基因治療資料，可為今后在個體水平應(yīng)用RNAi抑制組織基因特異性表達及疾病基因治療提供理論依據(jù)。

本研究通過構(gòu)建可介導(dǎo)survivin-siRNA的慢病毒載體，將其局部注射裸鼠肺腺癌組織后，腫瘤生長受到抑制，同時通過RT-PCR和WB檢測，survivin基因及蛋白表達水平均較對照組明顯抑制，但蛋白水平的抑制程度較基因水平抑制程度弱，表明可能與survivin基因的轉(zhuǎn)錄翻譯分子生物學機制尚不明確有關(guān)。實驗中腫瘤在經(jīng)過survivin-siRNA治療后，不僅腫瘤形態(tài)學等物理指標存在明顯改變，在分子水平上亦有抑制作用。同時FCM等細胞凋亡檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)，實驗組中survivin基因抑制促進了腫瘤細胞的凋亡。FCM檢測結(jié)果表明，survivin表達抑制后，G1期細胞百分比升高，S期、G2/M期細胞百分比相對減少，并檢測到凋亡細胞的亞二倍體峰，有30%～35%的腫瘤細胞凋亡。實驗結(jié)果表明，survivin-siRNA通過慢病毒載體導(dǎo)入腫瘤組織內(nèi)后，RNAi 技術(shù)可以明顯抑制腫瘤的生長，但是伴隨著時間延長一次給予的survivin-siRNA對腫瘤的抑制作用逐漸減弱。這可能與腫瘤伴隨多個癌基因激活和失活，使正常細胞不斷增生、轉(zhuǎn)化等因素有關(guān)，單獨抑制survivin尚不能完全消除腫瘤。同時可以說明RNAi在體內(nèi)實驗中同樣有降解的代謝途徑。因此，延長其在體內(nèi)的作用時間是下一步研究需要解決的問題。體內(nèi)實驗RT-PCR和WB檢測結(jié)果與體外實驗相比，由于關(guān)于基因在體內(nèi)的準確作用機制及慢病毒的體內(nèi)代謝機制尚存爭論，RNAi用于體內(nèi)實驗的效果較體外實驗稍差，但與其他載體相比慢病毒載體可穩(wěn)定提高其轉(zhuǎn)染效率。已有研究證實慢病毒載體可作為多種疾病模型及不同類型細胞的基因治療工具[11]。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)以RNAi作為體內(nèi)基因治療方法進行研究，尚需采用多劑量siRNA、多頻次給藥的深入研究，但該實驗不失為有益的嘗試，為腫瘤的基因靶向治療提供了動物實驗依據(jù)。

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The study on anticancer mechanism of the lentiviral vectors mediated siRNA targeting survivin gene on human lung adenocarcinoma xenografts in nude mice in vivo*

SuiYufei1，LiuNaizheng2，SiLei2△

(1.HekouDistrictPeople′sHospitalofDongyingCity,Dongying,Shandong257243,China；2.thePeople′sHospitalofLiaochengCity,Liaocheng,Shandong252000,China)

Abstract:ObjectiveTo explore tumor inhibitory effect of the lentiviral vectors mediated small interfering RNA(siRNA)targeting survivin gene on human lung adenocarcinoma xenografts in nude mice in vivo.MethodsThe lentiviral vector expressing survivin-siRNA was prepared.Then established human lung adenocarcinoma-bearing nude mice model,and divided nude mice into three groups,including the blank control group(PC group),blank vector group(NC group) and experiment group(RNAi group),treated with physiological saline,blank viral vector and siRNA respectively.The lentiviral vectors expressing survivin-siRNA were locally injected in tumor issues of nude mice in the RNAi group.Then observed the curve about changes of tumor volume in different time.The expression levels of protein and mRNA were detected by using Western blot and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The histogram of tumor cell cycle were examined by using flow cytometry.ResultsThe rate of tumor inhibition of lentiviral vectors mediated survivin-siRNA on lung adenocarcinoma in nude mice was 46.07%.There were significant differences in tumor weight between siRNA group and NC group,PC group(P<0.05),while no statistically significant difference was found between NC group and PC group(P>0.05).Compared with NC group and PC group,the expression levels of survivin mRNA and protein were decreased,and rates of inhibition were 72.00% and 53.00% respectively.The percentage of G1phase cells was increased,whereas the percentages of S phase cells was decreased.ConclusionThe lentiviral vectors mediated siRNA could effectively inhibit survivin gene expression on human lung adenocarcinoma xenografts in nude mice and markedly induce the apoptosis of tumor.

Key words:lung adenocarcinoma；survivin gene；small interfering RNA；lentiviral vector

基金項目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2014WS0042)。

作者簡介：隋玉飛，男，主管檢驗師，主要從事免疫和生物醫(yī)學研究。 △通訊作者，E-mail：sl8896@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.003

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0583-03

(收稿日期：2015-11-26)