童秀冰，鄭佳璇，廖 軍，黃萍萍，鄭春水

(福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福州 350122)

電針對頸椎病大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞及PI3K/Akt信號通路的影響*

童秀冰，鄭佳璇，廖 軍△，黃萍萍，鄭春水

(福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福州 350122)

目的:探討電針在頸椎病大鼠模型椎間盤軟骨細(xì)胞的凋亡，以及磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/ Akt)信號傳導(dǎo)通路中的兩個蛋白PI3K、Akt的影響。方法:將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成電針組、莫比可組、假手術(shù)組、模型組4組各8只，雌雄各半。電針組給予“頸夾脊”、“手三里”穴治療25 min/d/次，14 d為1個療程共2個療程，中間休息2 d;莫比可組用莫比可進(jìn)行灌胃處理;模型組、假手術(shù)組無任何治療只做固定，其治療療程同電針組。療程結(jié)束，取大鼠頸部椎間盤組織測生化相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果:電針治療后可見頸椎病大鼠模型軟骨細(xì)胞中PI3K、P-Akt、Bcl-2的蛋白含量表達(dá)上升且幅度大，Bax的表達(dá)則出現(xiàn)抑制。結(jié)論:電針能延緩頸椎病大鼠椎間盤軟骨細(xì)胞的凋亡過程，其機(jī)制與PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路與Bcl-2、Bax的含量可能有關(guān)。

電針;頸椎病;軟骨細(xì)胞凋亡;PI3K;AKT

頸椎病是臨床常見疾病，頸椎病發(fā)生病理改變，究其根本的原因是椎間盤的退變［1］。諸多研究［2-3］認(rèn)為，椎間盤退變始發(fā)于軟骨細(xì)胞的凋亡，也因此使得細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)的功能退化，從而加速了椎間盤退行性變的發(fā)生，通過對軟骨細(xì)胞的凋亡進(jìn)行干預(yù)，在治療椎間盤退行性相關(guān)疾病方面有一定的意義［4］。在頸椎病的治療中，電針是很有優(yōu)勢的方法之一，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制頸椎病大鼠的模型，觀察電針在軟骨細(xì)胞凋亡和PI3K/Akt的表達(dá)中起調(diào)控作用，進(jìn)而探究在椎間盤退變過程中相關(guān)因子可能起到的作用。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(100 g ±20 g)(上海斯克萊)，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

莫比可片(揚(yáng)子江藥業(yè));苯甲基磺酰氟(PMSF)、丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、Tris-HCL、Loading buffer、甘氨酸、Tris、TBST、二抗(碧云天); Bradford試劑盒(南京凱基);SDS、過硫酸胺、TEMED、二硫蘇糖醇(美國BIO-RAD);蛋白marker (Fermentas);一抗(PI3K、P-Akt、Akt，Cell Signaling Technology);二抗(Bax、Bcl-2，北京博奧森);電針儀(華佗牌);酶聯(lián)免疫檢測儀(上海中庸);移液器(德國EPPENDORF);AB204-N電子天平(梅特勒公司);脫水機(jī)(亞光醫(yī)用公司);BIO RAD凝膠成像分析儀(美國BIO-RAD公司);MDF-D5410低溫冰箱(日本三洋);LDZ5-2離心機(jī)(北京離心機(jī)廠)。

2 方法

2.1 分組及造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法在40只大鼠中選出10只作為假手術(shù)組，其余為造模組，每組中雌雄各半。根據(jù)王擁軍［5］等文獻(xiàn)資料造模，10%的水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。備皮并在大鼠頸背的正中間做一縱向手術(shù)切口，長度控制在2 cm，鈍性分離各層組織，橫向破壞右側(cè)肌肉和韌帶最后縫合。假手術(shù)組僅將皮膚切開、縫合，不需其他處理。術(shù)后正常飼養(yǎng)3個月，每組取出1只大鼠，HE染色及Toluidine blue染色用以確定造模是否成功［6］。課題前期研究提示，在TUNEL染色中模型大鼠椎間盤的細(xì)胞程序性死亡顯著高于假手術(shù)組［7］。模型復(fù)制成功，雌雄各半隨機(jī)分為電針組、莫比可組、假手術(shù)組、模型組，每組8只。

2.2 動物干預(yù)

2.2.1 電針組 模型大鼠成功后選頸夾脊、手三里穴位(兩側(cè))，治療時每次取同側(cè)，穴位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［8］，雙側(cè)交替進(jìn)行電針治療。具體如下:固定大鼠后針刺上述兩穴(用Φ0.3×15 mm華佗牌針灸針，深度4 mm左右)并連接電針儀，疏密波(2/ 100 Hz)，強(qiáng)度以局部輕微抖動為佳，25 min/d，1個月療程14 d，共2個療程，療程間休息2 d。

2.2.2 莫比可組 造模成功后用莫比可灌胃治療，每日1次，按照0.75 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)［9］做到時間相對固定，于上午8～10點(diǎn)進(jìn)行，每周1次大鼠體質(zhì)量監(jiān)測以調(diào)整藥物劑量，療程同電針組。

2.2.3 假手術(shù)組、模型組 無其他治療，只作固定處理，治療療程同電針組。

2.3 動物取材

干預(yù)療程結(jié)束后即采集標(biāo)本。以5 ml/kg的計(jì)量參照標(biāo)準(zhǔn)，用10%的水合氯醛對大鼠行麻醉處死，開始鈍性分離頸項(xiàng)部各層組織，并取下所需的頸椎間盤節(jié)段，用PBS沖洗并逐一標(biāo)記，迅速放入已經(jīng)備好的液氮罐里，再轉(zhuǎn)入－80℃的冰箱儲存。

2.4 免疫組化法檢測Bax和Bcl-2表達(dá)

石蠟切片并脫蠟，將枸櫞酸緩沖液用微波爐加熱沸騰，玻片放入其中燜5 min再加熱1 min，再燜5 min取出后冷卻至常溫;PBS浸泡3 min，反復(fù)3次，加3%H2O2反應(yīng)10 min;同上滴加封閉液;載玻片上加一抗(Bax和Bcl-2濃度均為1∶100)于4℃冰箱過夜;次日將玻片置于常溫回溫1 h后用PBS浸泡5 min，反復(fù)3次，加入二抗進(jìn)行反應(yīng)10 min;然后用PBS反復(fù)浸泡3次，每次5 min，加入過氧化物酶并在室溫反應(yīng)10 min后取出;最后是用DAB進(jìn)行顯色，蘇木精染色，常規(guī)條件下脫水進(jìn)行透明并封片，鏡下觀察結(jié)果。

2.5 Western Blot檢測

將頸椎間盤組織按照實(shí)驗(yàn)試劑說明書，經(jīng)蛋白提取、裂解和離心后得組織總蛋白產(chǎn)物，蛋白濃度測定(Bradford法);配膠后進(jìn)行電泳然后轉(zhuǎn)膜，在5%脫脂牛奶里加入 PVDF膜在室溫下?lián)u床反應(yīng)30 min;加一抗，兔抗大鼠PI3K(濃度1∶2000)、兔抗大鼠Akt(濃度1∶2000)、兔抗大鼠 P-Akt(濃度1∶1500)，并放置4℃冰箱搖床過夜，次日用1×TBST緩沖液沖洗10 min，反復(fù)3次;加二抗，山羊抗兔(濃度1∶2000)進(jìn)行搖床反應(yīng)至2 h，沖洗同上;膜上加入AB混合液顯色，最后用圖像分析軟件分析相應(yīng)蛋白表達(dá)情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，全部資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Bax、Bcl-2的組間表達(dá)分析

圖1、2表1顯示，大鼠頸椎間盤軟骨細(xì)胞內(nèi)有Bax、Bcl-2的表達(dá)，呈棕黃色陽性反應(yīng)。從每組陽性細(xì)胞數(shù)量及陽性蛋白表達(dá)來看，模型組與假手術(shù)組比較，Bax陽性蛋白表達(dá)升高(P＜0.05);電針組、莫比可組與模型組比較，Bax陽性蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05);Bcl-2陽性蛋白表達(dá)在假手術(shù)組最高，電針組、莫比可組次之，3組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Bax蛋白含量的表達(dá)比較分析圖(免疫組化×400)

表1 各組大鼠軟骨細(xì)胞Bax和Bcl-2比較(±s)

表1 各組大鼠軟骨細(xì)胞Bax和Bcl-2比較(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05

組 別 鼠數(shù)Bax Bcl-2假 手 術(shù) 組 8 6.63±2.13* 21.88±10.41*模 型 組 8 17.25±7.87 11.50± 4.66電 針 組 8 10.75±3.41* 20.75± 8.43*莫 比 可 組 8 11.09±5.95* 20.38± 7.65*

3.2 PI3K、P-Akt(Ser473)、Akt蛋白表達(dá)分析

圖3表2顯示，電針組、莫比可組及假手術(shù)組較模型組PI3K蛋白表達(dá)量均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 Bcl-2蛋白含量表達(dá)比較分析圖(免疫組化×400)

P-Akt表達(dá)顯示，電針組、莫比可組及假手術(shù)組較模型組P-Akt的蛋白表達(dá)量均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Akt表達(dá)顯示，每個組別之間Akt蛋白含量的表達(dá)無明顯差異。

圖3 PI3K、P-Akt、Akt蛋白含量表達(dá)比較

表2 PI3K、P-Akt、Akt蛋白含量表達(dá)比較(±s)

表2 PI3K、P-Akt、Akt蛋白含量表達(dá)比較(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05，#P＞0.05

組 別 鼠數(shù) PI3K P-Akt(Ser473)Akt假手 術(shù) 組 8 0.94±0.12* 1.06±0.25* 0.94±0.12#模 型 組 8 0.51±0.19 0.63±0.16 0.97±0.16電 針 組 8 0.82±0.13* 0.89±0.14* 0.94±0.17#莫比 可 組 8 0.81±0.15* 0.89±0.25* 0.97±0.18#

4 討論

PI3K/Akt通路被命名為“抗凋亡途徑”，多數(shù)專家學(xué)者肯定其作為軟骨細(xì)胞存活的重要通路作用。PI3K屬于胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有蛋白、脂類激酶的活性，當(dāng)酪氨酸激酶受體或G2蛋白耦聯(lián)受體將其激活后，可產(chǎn)生胞內(nèi)信使(PIP2及PIP3)，由此對細(xì)胞增生、凋亡及代謝等發(fā)揮重大作用［10］。PIP3與Akt相結(jié)合即磷酸化啟動，且Akt中Ser473位點(diǎn)之磷酸化是作為Akt最終活化的標(biāo)志。PI3K/Akt通路被激活后，使得Akt迅速活化，并進(jìn)一步磷酸化豐富的下游靶點(diǎn)，如核因子κB(NF-κB)、Bax、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、Survivin以及Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族成員FKHRL1，這些因子讓Bcl-2轉(zhuǎn)錄的能力增強(qiáng)，產(chǎn)生抗細(xì)胞程序性死亡的作用。Ulicietal［11］發(fā)現(xiàn)，添加PI3K抑制劑組的脛骨生長較另一組速度顯著緩慢，軟骨細(xì)胞程序性死亡的數(shù)量明顯增多，提示此途徑如果在正常情況下的表達(dá)能夠有效對抗軟骨細(xì)胞凋亡。本次實(shí)驗(yàn)中，模型組軟骨細(xì)胞的PI3K、P-Akt相對假手術(shù)組的蛋白含量表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，電針后軟骨細(xì)胞中的PI3K、P-Akt蛋白含量表達(dá)上升，Akt蛋白含量的表達(dá)在組間未見明顯差異。若Akt未經(jīng)磷酸化，PI3K/Akt無法激活，則Akt無法通過調(diào)控其下游因子，進(jìn)而影響細(xì)胞存活。由此暗示電針后Akt磷酸化、PI3K/Akt激活在調(diào)控軟骨細(xì)胞程序性死亡過程中有相當(dāng)重要的地位。

Bax和Bcl-2是PI3K/Akt信號途徑上的2個關(guān)鍵因子，它們作用于細(xì)胞的凋亡，并發(fā)揮各自的調(diào)節(jié)功能。其中Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2通過拮抗Bax使半胱氨酸蛋白酶的激活被阻斷，從而抑制凋亡的進(jìn)行［12］。馬春輝等［13］認(rèn)為，軟骨細(xì)胞的程序性死亡是骨關(guān)節(jié)炎性疾病的誘因之一，并觀察到Bax蛋白表達(dá)在炎性關(guān)節(jié)軟骨中的含量明顯升高，認(rèn)為Bax和Bcl-2共同參與該類疾病的調(diào)控。在此次實(shí)驗(yàn)中，模型組Bax蛋白含量明顯升高，軟骨細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯;電針組、莫比可組與模型組比較其蛋白的表達(dá)量下降，Bcl-2的表達(dá)情況則與之相反，說明電針對大鼠頸椎病軟骨細(xì)胞程序性死亡的調(diào)控與Bax、Bcl-2這對因子密切相關(guān)。

莫比可片作為非甾體鎮(zhèn)痛、消炎用藥，是臨床醫(yī)生治療頸椎病的常用手段。電針亦可發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛效應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體的整體機(jī)能和肌張力、加快循環(huán)等作用［14］。在頸椎病的治療中，臨床常選用手三里、頸夾脊穴。頸夾脊在督脈與足太陽經(jīng)之間循行，督脈統(tǒng)領(lǐng)著人身之陽氣，是人體的陽脈之海。足太陽經(jīng)為人體最長的經(jīng)脈，電針頸夾脊既通調(diào)督脈又調(diào)人之陰陽，故而頸部氣血疏通為醫(yī)治頸椎病之根本?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，頸夾脊穴其下富含血管、神經(jīng)、肌肉等，施刺該處能加快血行，進(jìn)而改善病患肌肉強(qiáng)硬。手三里歸屬手陽明經(jīng)，該經(jīng)陽氣最為盛實(shí)且多氣多血，施刺該穴即可振奮陽氣、促進(jìn)血行;且從經(jīng)絡(luò)的走向來看，其經(jīng)過頸部，正如《靈樞·經(jīng)脈》記載:“大腸手陽明之脈……上肩……上出于柱骨之會上?！?/p>

綜上可知，電針施治可使頸椎病大鼠軟骨細(xì)胞中的Bcl-2、PI3K、P-Akt蛋白表達(dá)含量顯著上調(diào)，使Bax蛋白表達(dá)含量下調(diào)。從分子生物學(xué)角度出發(fā)，結(jié)合蛋白表達(dá)情況的差異化對比，認(rèn)為電針在治療椎間盤退變的過程中，可能與PI3K/Akt信號傳導(dǎo)路徑的激活，并發(fā)揮相關(guān)調(diào)節(jié)因子如Bax、Bcl-2的含量相關(guān)。但我們此次實(shí)驗(yàn)未對其他相關(guān)分子機(jī)理深入探究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展會進(jìn)一步完善。

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Effects on electroacupuncture of intervertebral disc cartilage cells in the cervical spondylosis rat model and PI3K/Akt signal pathway

TONG Xiu-bing，ZHENG Jia-xuan，LIAO Jun△，HUANG Ping-ping，ZHENG Chun-shui
(Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China)

Objective:To discuss the effect on electro-acupuncture(EA)in the intervertebral disc cartilage cells apoptosis and phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K) and serine threonine kinas(AKT)in the rats with cervical spondylosis．Methods:40 SD rats were divided into four groups randomly，including control，model，EA and mobbic groups，male and female half，only 8 for each group．The EA rats were treated with EA on the cervical Jiaji and Shousanli points，25 minutes every day，14 days were one treatment course．The mobbic rats were treated with moby．The control and the model rats were fixed without any treatments．All rats shared the same treatment time．After the courses，the cervical intervertebral disc were detected to examine biochemical indicators．Results:EA treatment on rats of cervical spondylosis could improve the expression of PI3K and P-AKT and Bcl-2，at the same time，reduce the content of Bax．Conclusion:EA treatment can delay intervertebral disc cartilage cell apoptosis in the rats with cervical spondylosis，and the mechanism may be associated with PI3K/AKT signal pathway．

Electroacupuncture;Cervicas spondylosis;Chondrocytes apoptosis;PI3K;AKT

R245．9+7

B

1006-3250(2016)09-1232-04

2016-03-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273836，81001554)

童秀冰(1989-)，女，福建龍巖人，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸推拿治療脊柱疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者:廖 軍(1977-)，男，重慶合川人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治脊柱疾病的臨床與研究，E-mail: 77liaojun@163．com。