徐君++李欣++江君++李靜會++姜紅衛(wèi)

摘要：為分析荷花花色形成機理，以不同類型的14個荷花品種花瓣為材料，進行花色表型測定、花色素成分分析及花色苷穩(wěn)定性鑒定。結(jié)果表明：荷花花色素的主要成分為類黃酮物質(zhì)，包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇等，不含類胡蘿卜素；紅蓮型和粉蓮型荷花花色素含有花色苷類物質(zhì)；復色蓮型荷花含有微量的花色苷類物質(zhì)，可能分布在花瓣尖部?；ㄉ辗€(wěn)定性試驗顯示，溫度不超過50 ℃，花色苷含量不隨溫度升高而降低，而低pH值有利于荷花花色苷的穩(wěn)定。本研究為闡明荷花花色形成的機理、利用基因工程培育新花色品種等提供了理論基礎。

關鍵詞：荷花；花色素；類黃酮；花色苷；穩(wěn)定性

中圖分類號： TS201.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0331-04

收稿日期：2015-03-19

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（13）3018]；江蘇省林業(yè)三新工程（編號：lysx[2013]35）。

作者簡介：徐君（1982—），男，江蘇蘇州人，碩士研究生，主要研究地方特色資源收集與評價工作。E-mail：flyforever007@163.com。

通信作者：姜紅衛(wèi)。E-mail：sacjhw@163.com。植物花色是由內(nèi)外多種因子協(xié)同作用的結(jié)果，但在本質(zhì)上是由某些特定色素在花瓣細胞中特定表達決定的。色素的種類、含量、結(jié)構(gòu)、組合及分布最終決定了花色的變化[1]。自然界中，植物花色素包含了類胡蘿卜素、類黃酮和生物堿3大類[2]，現(xiàn)階段對不同花色的花色素機理研究主要集中于類胡蘿卜素和類黃酮[3～5]。類胡蘿卜素包括胡蘿卜素和葉黃素，賦予植物花瓣黃色或橙色[6]。類黃酮可分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮、黃烷醇及花色苷等6類[7]，其中黃酮、黃酮醇的顏色表達從象牙白色至淺黃色，而花色苷則控制著花瓣的紅色、紫色和藍色[8]。

荷花（Nelumbo nucifera）為睡蓮科蓮屬多年生草本水生花卉，其花色花型多樣，王其超在《中國荷花志》中按照Wnschers花卉色譜描述，將荷花分為紅蓮型、粉蓮型、黃蓮型、白蓮型、復色蓮型等5類[9]。對于植物中類黃酮及花色素苷的生物合成途徑雖已有詳細研究[10]，但荷花花色的形成是一個復雜的過程，在不同氣候、不同發(fā)育時期甚至于同一植株不同花，花瓣顏色都可能存在差異，因此研究荷花花瓣色素的生化機理對于研究花色具有重要意義。目前對荷花花色形成機理研究并不多，僅對類黃酮化合物的含量及分析有一些報道：徐雙雙等從藥理學角度，采用加速溶劑萃取-高效液相色譜法聯(lián)用技術分析了7個荷花品種花瓣樣品中5種類黃酮化合物的具體含量[10]；鄧嬌等采用高壓液相色譜-二極管陣列光譜檢測/電噴霧離子化質(zhì)譜（HPLC-DAD/ESI-MS）串聯(lián)技術分析了108個荷花材料的花瓣中類黃酮的成分及含量，結(jié)果顯示紅色與花青素含量密切相關，而黃色與黃酮及黃酮醇的含量相關[11]。本研究以搜集的不同類型的14個荷花品種為材料，通過對花色表型測定、色素定性分析的研究，同時探討不同生理條件下荷花花色苷的穩(wěn)定性，有助于全面、有效地探索荷花花色形成、表達的生化機理，為利用基因工程技術開展荷花花色相關基因的分離與功能分析研究，進而調(diào)控改變花色、培育新花色品種、提高荷花觀賞品質(zhì)提供重要技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

試供材料于2014年5—9月陸續(xù)收集自蘇州市農(nóng)業(yè)科學院觀賞荷花資源圃，共14個品種（系），其中黃蓮型3個、白蓮型2個、粉蓮型4個、紅蓮型2個和復色蓮型3個。具體品種、花特征及種源見表1。

1.2試驗方法

1.2.1荷花花色測定方法在荷花盛開狀態(tài)下，每個品種隨機選3個單株。取花瓣中心部，用色差儀（NF333型，C/2°光源）測定CIE L*a*b* 表色系統(tǒng)下的明度L*值、色相a*值和b*值，計算各品種平均值，并使用SPSS繪制三維散點圖觀察不同荷花品種花瓣色分布。

1.2.2材料采集與處理將上述花瓣材料采摘后裝入牛皮紙信封中，在 60 ℃下烘干24 h至恒質(zhì)量。用研缽研成粉末，按品種分裝入自封袋密閉后在常溫下保存，備用[13]。

1.2.3不同花色型荷花品種花色素提取及初步定性方法稱取荷花花瓣粉末0.1 g左右，每個品種3份，分別放入具塞試管，每個品種3個試管中分別加入石油醚、10%鹽酸、30%氨水各5 mL，觀察試管中顏色的變化，并進行記錄[1]。

1.2.4不同花色型荷花品種類黃酮顯色反應方法精確稱取各荷花品種花瓣粉末0.1 g，放入具塞試管中，加入15 mL 1%的鹽酸甲醇溶液，黑暗條件下提取24 h，用定性濾紙過濾后，定容至 25 mL。分別取 2 mL提取液，進行以下4類9項顯色反應[14-15]：（1）還原顯色反應：濃鹽酸-鎂粉反應、濃鹽酸-鋅粉反應 、四氫硼鈉反應；（2）金屬鹽類絡合反應：醋酸鉛反應、三氯化鐵反應、三氯化鋁反應、氨性氯化鍶反應；（3）堿性試劑反應；（4）硼酸反應 。

1.2.5不同花色型荷花品種花色素紫外-可見光譜測定編表1試供荷花品種

編號種名特征種源1錦衣衛(wèi)黃蓮型、少瓣、中小株型江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所選育2黃仙子黃蓮型、重瓣、中小株型引自南京藝蓮苑3美洲黃蓮黃蓮型、少瓣、大株型引自美國4白衣戰(zhàn)士白蓮型、少瓣、中小株型引自武漢東湖風景區(qū)5N8白蓮型、重瓣、中小株型江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所選育新材料6碧水芙蓉粉蓮型、重瓣、大株型引自建寧縣蓮科所、籽蓮7首領粉蓮型、重瓣、中小株型引自南京藝蓮苑8太空蓮36粉蓮型、少瓣、大株型引自建寧縣蓮科所、籽蓮9星空牡丹粉蓮型、重瓣、大株型引自建寧縣蓮科所、籽蓮10蘇繡紅蓮型、重瓣、大株型江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所選育11N11紅蓮型、重瓣、中小株型江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所選育新材料12錦霞復色蓮型、重瓣、中小株型引自南京藝蓮苑13N6復色蓮型、重瓣、中小株型江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所選育新材料14N9復色蓮型、重瓣、中小株型江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所選育新材料

號3（黃蓮型）、編號4（白蓮型）、編號7（粉蓮型）、編號10（紅蓮型）、編號12 （復色蓮型）5個品種，精確稱取“1.2.2”節(jié)中各荷花品種花瓣粉末0.1 g，加1%鹽酸化甲醇溶液20 mL 于具塞試管中，混勻后在常溫下避光提取24 h。提取液定性濾紙過濾后，使用UV-2450型（SHIMAOZU）紫外-可見光分光光度計在 200～800 nm光譜范圍內(nèi)掃描[16]。

1.2.6荷花花色苷穩(wěn)定性檢驗編號7（粉蓮型）、編號10（紅蓮型）、編號12（復色蓮型） 3個品種，取“1.2.5”節(jié)對應品種的1%鹽酸甲醇提取液，分別進行2個處理：（1）每品種取4份，分別置20、30、40、50 ℃下保存180 min；（2）每品種取8份，分別調(diào)溶劑pH值至1、2、3、4、5、6、7、8，保存180 min。采用UV-2450型（SHIMAOZU）在530 nm處測定吸光度，重復3次。所得到的數(shù)據(jù)采用SPSS[16]進行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同荷花品種花色測定結(jié)果

根據(jù)不同荷花品種花瓣CIE L*、a*、b*數(shù)值繪制三維散點圖（圖1），不同類型荷花品種花瓣的顏色在CIE L*、a*、b*三維坐標上的分布不同，其中粉蓮型與紅蓮型分布相近，由于測定點在花瓣中心部，復色蓮花瓣顏色分布為基部、中部偏白色、尖部為近紫紅色，因此CIE L*、a*、b*測試白蓮型、黃蓮型與復色蓮型分布相近。各類型荷花花瓣色CIE L*、a*、b*數(shù)值分布范圍（表2）。

2.2不同花色型荷花品種花色素初步定性分析

石油醚、10%HCl及氨水顯色反應結(jié)果見表3。在石油醚反應中，不同花色荷花品種花瓣均顯示無色，說明所選品種花瓣中不含類胡蘿卜素。氨水反應中，各荷花品種均不表現(xiàn)橙色或者紅色，說明荷花花瓣色素不含噢哢（橙酮）類，而所有品種花瓣均顯示黃色至深綠色，說明所有品種均含有類黃酮物質(zhì)，而不同品種、不同花色間類黃酮物質(zhì)含量不同。黃蓮型、白蓮型荷花品種10%HCl顯色反應均顯示無色，而所有粉蓮型、紅蓮型、復色蓮型顯色反應均顯示淡粉至粉色，說明黃蓮型、白蓮型荷花花瓣不含花色苷，而紅蓮型、粉蓮型、復色蓮型均含有花色苷，但不同花色間花色苷含量不同，其中復色蓮型顯色反應粉色顯示極微弱，分析可能是由于復色蓮花瓣僅尖部顯紫紅色部位含有花色苷，花色苷含量較少。

表3不同荷花品種花瓣花色素類型測試結(jié)果

編號石油醚氨水鹽酸編號石油醚氨水鹽酸1無色黃色無色8無色綠色粉色2無色黃色無色9無色綠色淡粉色3無色黃色無色10無色深綠色粉色4無色黃色無色11無色綠色粉色5無色黃色無色12無色黃綠色淡粉色6無色黃色粉色13無色黃綠色淡粉色7無色綠色淡粉色14無色黃綠色淡粉色

2.3不同花色型荷花品種類黃酮顯色結(jié)果

2.3.1還原顯色反應在濃鹽酸-鎂粉及濃鹽酸-鋅粉反應中，所有荷花品種均顯示不同深度的紫紅色，說明荷花花瓣可能含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮或二氫黃酮醇類物質(zhì)。結(jié)合四氫硼鈉顯色反應，黃仙子、錦衣衛(wèi)、美洲黃蓮、N6無紫色或紫紅色產(chǎn)生，說明這4個品種花瓣不含有二氫黃酮或二氫黃酮醇類物質(zhì)，其類黃酮化合物為黃酮或黃酮醇類物質(zhì)（表4）。

2.3.2金屬鹽類絡合反應在醋酸鉛反應中，所有荷花品種均產(chǎn)生白色沉淀，說明荷花花瓣可能含有鄰二酚羥基或兼有4-酮基和3-羥基或4-酮基和5-羥基結(jié)構(gòu)化合物。結(jié)合三氯化鐵顯色反應中，黃仙子、N6呈現(xiàn)黃綠色，其余品種則呈現(xiàn)不同程度的黃色，說明黃仙子和N6中具有酚羥基，其余品種含有C3位連接羥基的類黃酮化合物。三氯化鋁顯色反應中錦衣衛(wèi)、黃仙子、美洲黃蓮、白衣戰(zhàn)士、N8、碧水芙蓉、星空牡丹、蘇繡、錦霞N6及N9均表現(xiàn)出不同程度的黃色，說明其花色素屬于黃酮醇類。氯化鍶顯色反應中，所有荷花品種花瓣提取液均產(chǎn)生黃色沉淀，說明荷花花色素可能具備鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物（表4）。

2.3.3堿性試劑反應所有荷花花瓣色素堿性試劑反應均顯示不同程度的黃色，證實其花色色素可能為C3位有游離羥基的黃酮醇類或二氫黃酮類化合物。堿性試劑反應無橙色發(fā)生，進一步說明荷花花瓣色素不含有橙酮類物質(zhì)（表4）。

2.3.4硼酸反應所有荷花品種無亮黃色發(fā)生，說明荷花花瓣色素不含有5-羥基黃酮及2-羥基查爾酮（表4）。

2.4不同花色型荷花品種花色素紫外-可見光譜結(jié)果分析

選用200～800 nm區(qū)間對5個荷花品種的花瓣鹽酸甲醇提取液進行波長掃描，結(jié)果見圖2。5個品種在330 nm處均出現(xiàn)顯著吸收波峰，紅蓮品種蘇繡、粉蓮品種首領、白蓮品種白衣戰(zhàn)士在295 nm也出現(xiàn)顯著吸收峰，而黃蓮品種黃仙子、復色蓮品種錦霞在295 nm處的吸收峰則不明顯，但有波動，進一步說明荷花花瓣中含有不同量的黃酮、二氫黃酮、黃酮醇或二氫黃酮醇等類黃酮物質(zhì)。紅蓮品種蘇繡、粉蓮品種首領在520 nm處有顯著吸收峰，復色蓮品種錦霞吸收峰則不明顯，但有微量波動，說明紅蓮型荷花、粉蓮型荷花花瓣含有花色苷物質(zhì)，而復色蓮品種錦霞的花色苷物質(zhì)含量微少，分析原因可能是由于其花瓣僅尖部含有花色苷，總體含量較少。而白蓮品種白衣戰(zhàn)士、黃蓮品種黃仙子則無吸收峰，說明不含有花色苷物質(zhì)。

2.5荷花花色苷穩(wěn)定性分析

2.4.1溫度對荷花花色苷穩(wěn)定性的影響由圖3可知，所有品種花瓣色素在溫度上升時，都有吸光度上升的趨勢，實際情況中，高溫處理后花色苷提取液顏色有顯著加深。說明在本試驗條件下（50 ℃以內(nèi)），荷花花色苷沒有降解趨勢。從方差分析結(jié)果（表5）看出，3個花色間花色素苷含量、不同溫度處理后花色素苷含量、品種×溫度互作水平均達到極顯著差異水平（P<0.01）。

2.4.2pH值對荷花花色苷穩(wěn)定性的影響pH值≥7時，花色苷提取液紅色消失，并有絮狀沉淀產(chǎn)生。計算pH值≤6時，各品種在不同pH值條件下保存后530 nm處吸光度差異，從方差分析結(jié)果（表6）可知，酸性條件下不同值對花色苷穩(wěn)定性無顯著差異，由圖4看出所有品種花瓣色素在pH值降低即酸度上升時，都有吸光度上升的趨勢。

3結(jié)論與討論

3.1荷花花瓣色素成分分析

類黃酮分子在紫外可見光譜中會出現(xiàn)2個相應的特征吸收區(qū)域，λ=300～400 nm和λ=220～290 nm處[16]。本研究中不同顏色品種花瓣色素的1 %鹽酸甲醇溶液在紫外光范圍內(nèi)的最大吸收波長分別在290 nm和330 nm附近，因此不同花色型荷花花瓣色素中均含有類黃酮化合物，氨水定性顯色結(jié)果與此相同?；ㄉ兆畲笪詹ㄩL一般在λ=500～540 nm 處[16]。紅蓮型品種蘇繡和粉蓮型品種首先在光譜掃描530 nm附近的可見光范圍內(nèi)有最大吸收波長，表示其花瓣之所以呈紅色可能是由于其花瓣色素中含有花色素苷類物質(zhì)，10%HCl特征顯色反應的結(jié)果亦與此相同。

顯色反應還顯示，荷花花瓣中不含有類胡蘿卜素及橙酮類化合物。綜合以上結(jié)果，可以推測，黃蓮型、白蓮型荷花花瓣色主要由黃色或無色的黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物決定，特征顯色反應顯示不同色型荷花品種之間類黃酮化合物組成并不完全相同，因此化合物種類、含量與分布決定了黃色或偏白色的花色表現(xiàn)。紅蓮型、粉蓮型、復色蓮型荷花花瓣色主要由黃酮類和花色苷類化合物共同決定。目前發(fā)現(xiàn)的花色苷中只有矢車菊素（花青素）和芍藥色素（甲基花青素）呈紫紅色[17]。因此推測紅蓮型、粉蓮型荷花花瓣及復色蓮型荷花花瓣尖部的紅色色素為花青素、芍藥色素、花青素苷、芍藥色素苷的1種或幾種的組合。

3.2荷花花色苷的穩(wěn)定性

作為紅蓮型、粉蓮型、復色蓮型荷花花瓣色素的重要組成，花色苷是不穩(wěn)定的一類化合物，其表達受到光照、溫度、pH值、氧化還原物及各種金屬離子等因素的影響[18～19]。荷花盛開季節(jié)為7—10月，正值高溫，且荷花為露天開放，因此研究高溫下溫度變化對荷花花瓣中花色素苷穩(wěn)定性影響有重要的現(xiàn)實意義。本研究發(fā)現(xiàn)，在一定溫度范圍內(nèi)，花色素苷含量并沒有隨著溫度的提高而減少。有研究顯示，花色苷在溶劑中處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，吸熱反應導致花色苷形成無色的假堿或查爾酮形態(tài)[20]，本研究中隨著溫度上升，花色苷提取液顏色變深、吸光度提高，說明溫度不超過50 ℃，花色苷提取液平衡未達到向假堿或查爾酮形態(tài)轉(zhuǎn)化的條件。荷花在夏季盛開時，在高溫下一般花色更為艷麗，且不會褪色，可能與荷花花色素苷此特性有關。本研究還對不同pH值條件下花色苷穩(wěn)定性進行了試驗，酸性條件下花色苷比較穩(wěn)定，但各品種花色苷在pH值降低即酸度上升時，都有吸光度上升的趨勢，分析可能是酸性條件下，當pH值為 3.0～6.0時，花色苷有利于以無色的甲醇假堿和查爾酮假堿的形式存在[21]，因此當荷花細胞介質(zhì)中酸度增加時，花色更為艷麗。

3.3展望

本研究通過特征顯色、紫外-可見光譜掃描等分析方法，初步明確不同類型荷花品種花瓣色素中的部分組分，有助于闡明荷花花色表現(xiàn)的化學基礎，為豐富花色提供科學的理論依據(jù)。今后的研究中，可通過紅外光譜以及核磁共振等方法詳細明確花瓣色素的結(jié)構(gòu)信息，進而精確了解不同顏色品種花瓣色素中組分的差異，結(jié)合不同花色、不同器官及花發(fā)育過程中花色素合成相關基因的表達情況，明確荷花花瓣的著色機理。此外，根據(jù)不同因子條件下荷花花色苷穩(wěn)定性差異，可進一步對荷花花瓣中花色苷積累及分布開展分子研究分析，以期達到調(diào)控荷花花色表達的目的，并利用于開發(fā)更多不同型花色的觀賞荷花。

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