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        諾麗果汁對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

        2016-04-11 16:28:31譚琳鄭曉燕陳嬌鄭學(xué)勤
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年2期

        譚琳++鄭曉燕++陳嬌+++鄭學(xué)勤+++馬蔚紅+艾斌凌++王朝政

        摘要:為了探討諾麗果汁對過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,本試驗采用H2O2造成PC12神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷模型,通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),MTT測定細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶(LDH)活力檢測法,Ho/PI染色檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死,研究的諾麗果汁對過氧化氫所致PC12 細(xì)胞氧化損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),體積分?jǐn)?shù)在1%~5%諾麗果汁均能不同程度地保護(hù)細(xì)胞形態(tài),增加細(xì)胞的生存率,抑制過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞壞死,減少損傷后LDH的生成。以上結(jié)果表明,1%~5%體積分?jǐn)?shù)諾麗果汁對過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

        關(guān)鍵詞:諾麗果汁;H2O2;PC12細(xì)胞;細(xì)胞壞死;乳酸脫氫酶

        中圖分類號: TS275.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2016)02-0317-03

        收稿日期:2015-03-24

        基金項目:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院??趯嶒炚究蒲袉禹椖浚ň幪枺篐KZKY140204);農(nóng)業(yè)部財政項目“熱帶野生果樹種子資源收集、利用和評價”。

        作者簡介:譚琳(1974—),女,博士,副研究員,研究方向為食品分子營養(yǎng)。E-mail:tanlin7402@126.com。

        通信作者:馬蔚紅,研究員,主要從事熱帶作物種質(zhì)資源收集與評價研究,E-mail:zjwhma@163.com;鄭學(xué)勤,研究員,主要從事熱帶作物遺傳育種研究。E-mail:zhengxxxqin@126.com。氧化應(yīng)激是由活性氧自由基和活性氮自由基產(chǎn)生和清除失衡引起的應(yīng)激損傷狀態(tài)[1],在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中起著重要作用[2-3]。近年來,越來越多的研究顯示植物多酚具有強抗氧化性,且在防治氧化損傷神經(jīng)退行性疾病有著重要的作用[4-5]。諾麗(Morinda citrifolia),又稱諾尼、海巴戟,屬茜草科巴戟天屬植物,主要分布在南太平洋諸島嶼以及中國的海南島、西沙群島和臺灣島等地[6]。早在2 000多年前,南太平洋島嶼的波利尼西亞人就發(fā)現(xiàn)諾麗果實具有天然的健康和醫(yī)學(xué)功效,經(jīng)常將諾麗果壓成汁液,作為日常飲品和用于治療癌癥、糖尿病、高血壓等多種疾病[7]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也表明諾麗具有抗氧化、抗癌、降糖等多種生物學(xué)活性[8-10],但是關(guān)于其神經(jīng)保護(hù)方面的功能鮮見報道。前期研究表明諾麗果汁中多酚含量高達(dá)1.934 mg/mL,且對DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥自由基、過氧化氫等均具有很好的清除活性[11]。本研究利用H2O2誘導(dǎo)類神經(jīng)細(xì)胞系PC12細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷模型,檢測諾麗果汁對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用,旨在為新型諾麗果汁保健產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

        1材料與方法

        1.1材料

        1.1.1細(xì)胞PC12高分化細(xì)胞(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株)購于中國學(xué)科院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫。

        1.1.2諾麗果汁諾麗果由鄭學(xué)勤研究員采自海南陸僑集團(tuán)三亞種植基地,將采來的新鮮諾麗果實去皮和去籽,果肉用醫(yī)用紗布包裹,擠壓,得到諾麗果汁,果汁再用一次性0.22 μm 濾膜(milipore)進(jìn)行過濾除菌,備用。

        1.1.3藥品和試劑RMPI1640培養(yǎng)液購自北京索萊寶公司;無支原體胎牛血清為杭州四季清生物工程材料有限公司產(chǎn)品;Trypsin為 Amersco 公司產(chǎn)品;DMSO、LDH 脫氫酶試劑盒購自Promega公司;MTT、Hoechst33342/PI細(xì)胞凋亡測定試劑盒上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

        1.1.4主要儀器超凈工作臺(蘇凈安泰VS-840K-U,蘇州),二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo/Forma3111,美國),倒置熒光顯微鏡(Zeiss/Axiovert 40CFL,德國),全自動酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan FC,美國);細(xì)胞培養(yǎng)瓶,細(xì)胞培養(yǎng)板(康寧)。

        1.2方法

        1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清 RMPI 1640 培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),每2 d傳代1次。待細(xì)胞增長至80%融合時,用0.25%胰酶消化細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1 × 105 個/mL 后傳代或接種于細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行各項指標(biāo)測定。

        1.2.2細(xì)胞形態(tài)檢測取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液。試驗分為對照組、損傷組、預(yù)防組,每組設(shè)3個復(fù)孔。對照組細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng),預(yù)防組用終體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2.5%、5%的諾麗果汁培養(yǎng)24 h后,吸棄培養(yǎng)液,PBS沖洗1~2次,加入H2O2終濃度為0.3 mmol/L的培養(yǎng)液,培養(yǎng)4 h,損傷組用不含諾麗果汁的培養(yǎng)液培養(yǎng),其余處理方法與預(yù)防組細(xì)胞相同,熒光倒置顯微鏡檢查細(xì)胞形態(tài)。

        1.2.3MTT檢測諾麗果汁對氧化應(yīng)激損傷PC12 細(xì)胞活力的影響按照“1. 2 .2”節(jié)進(jìn)行試驗分組、給藥處理及培養(yǎng),然后用MTT法測定細(xì)胞活力,向各孔加入5 g/L的MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸棄所有培養(yǎng)液,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO) 振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上以560 nm 波長測定各孔吸光度D。按相對活力=(D處理-D空白)/(D正常平均-D空白) × 100%公式計算細(xì)胞相對活力。

        1.2.4細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死檢測根據(jù)Hoechst33342/PI試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死檢測。先配制好染色緩沖液,然后對各處理組進(jìn)行離心收集懸浮細(xì)胞,用PBS洗滌細(xì)胞2次。取適量離心收集好的細(xì)胞用0.5~1 mL 染色緩沖液將細(xì)胞重懸,使其濃度大約為1 ×106 個/mL。加入5 μL Hoechst 33342染色液。 輕輕混勻后室溫避光孵育10~15 min。用PBS洗滌細(xì)胞1次,用0.5~1 mL染色緩沖液將細(xì)胞重懸,加入5 μ LPI染色液,輕輕混勻后室溫避光孵育10~15 min,再用PBS洗滌細(xì)胞1次,加PBS稀釋至適當(dāng)濃度后熒光顯微鏡檢測結(jié)果。Hoechst33342-DNA的最大激發(fā)波長為350 nm,最大發(fā)射波長為460 nm,PI的最大激發(fā)和最大發(fā)射波長分別為488、615 nm。

        1.2.5LDH檢測諾麗果汁對PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞時,細(xì)胞內(nèi)的LDH會釋放到培養(yǎng)基中,而活細(xì)胞則不會,所以培養(yǎng)上清中LDH的活性可以反映細(xì)胞的死亡或損傷程度。各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后,吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清,按照試劑盒說明書操作檢測LDH含量。

        1.2.6數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析采用SAS 9.0統(tǒng)計分析軟件分析試驗數(shù)據(jù),處理組之間差異顯著性分析采用鄧肯氏(Duncans)多重比較法,以P<0.05為差異顯著。

        2結(jié)果

        2.1諾麗果汁對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

        本研究發(fā)現(xiàn),對照組細(xì)胞呈長梭形或多角形鑲嵌狀排列,細(xì)胞邊界清晰,大小均勻,細(xì)胞豐滿,無重疊生長現(xiàn)象(圖1-A)。而H2O2損傷組細(xì)胞出現(xiàn)收縮、變圓、體積變小,細(xì)胞間隙增寬,大部分細(xì)胞破碎、脫落,但細(xì)胞輪廓尚較清晰(圖1-B)。用不同劑量諾麗果汁預(yù)處理后均有不同程度的保護(hù)作用,細(xì)胞形態(tài)好于損傷組(圖1),其中10%諾麗果汁預(yù)處理組細(xì)胞形態(tài)與對照組接近(圖1-E)。

        2.2諾麗果汁對H2O2氧化損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

        不同質(zhì)量濃度諾麗果汁均可減小H2O2對細(xì)胞的增殖抑制作用,細(xì)胞存活率從120%增加到166%,與H2O2損傷組比,差異極顯著(P<0.01)(圖2)。此結(jié)果表明,在一定濃度范圍內(nèi),諾麗果汁不僅有保護(hù)細(xì)胞免受損傷的作用,而且還有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

        2.3諾麗果汁對H2O2氧化損傷PC12細(xì)胞壞死的影響

        Hoechst33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料,與DNA結(jié)合,凋亡細(xì)胞有膜通透性改變,主要攝取Hoechst染料,凋亡細(xì)胞中的凝聚染色質(zhì)會比正常細(xì)胞中的染色質(zhì)染色更深、更加明亮,表現(xiàn)為強藍(lán)色熒光。壞死細(xì)胞由于有很強的PI嗜染性并可覆蓋Hoechest染色,故呈強紅色熒光。本研究發(fā)現(xiàn),對照組有少數(shù) PI染色陽性細(xì)胞(橘黃色),300 μmol/L H2O2處理組PI染色陽性細(xì)胞顯著增加,而經(jīng)諾麗果汁預(yù)處理后PI陽性細(xì)胞完全沒有,但有少量凋亡細(xì)胞(亮藍(lán)色)(圖3)。以上結(jié)果表明,諾麗果汁可顯著地減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。

        2.4諾麗果汁對H2O2氧化損傷PC12細(xì)胞LDH漏出率的影響

        研究發(fā)現(xiàn)對照組中的LDH含量較低,而模型組中的LDH含量極顯著高于對照組。經(jīng)諾麗果汁保護(hù)后,LDH含量下降,并隨諾麗果汁濃度的增加而顯著降低((圖4)。結(jié)果表明,諾麗果汁有效降低H2O2對PC12細(xì)胞的氧化損傷,且在1%~5%的濃度范圍內(nèi)其保護(hù)效果與諾麗果汁濃度呈正相關(guān)。

        3結(jié)論與討論

        本研究用H2O2造成PC12神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷模型,通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),MTT測定細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶(LDH)活力檢測法,Ho/PI染色檢測細(xì)胞凋亡探討諾麗果汁對過氧化氫所致PC12細(xì)胞氧化損傷的影響,發(fā)現(xiàn)1%~5%體積分?jǐn)?shù)諾麗果汁均能不同程度地保護(hù)細(xì)胞形態(tài),增加細(xì)胞的生存率,抑制過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞壞死,減少損傷后LDH的生成,表明1%~5%體積分?jǐn)?shù)諾麗果汁對過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有保護(hù)作用,這將為諾麗果用于開發(fā)神經(jīng)保護(hù)方面的保健品奠定了理論依據(jù)。

        自1983年Mosmann創(chuàng)立了MTT比色法以來,由于其經(jīng)濟(jì)、靈敏、無放射性污染等特點,使之成為細(xì)胞生物學(xué)及相關(guān)研究領(lǐng)域一種常用的細(xì)胞活性檢測方法[12]。本研究采用MTT 比色法分析了1%~5%范圍內(nèi)諾麗果汁對過氧化氫誘導(dǎo)PC12損傷存活率的影響,發(fā)現(xiàn)其不僅有保護(hù)細(xì)胞免受損傷的作用,而且還有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,但有研究顯示,10%諾麗果汁能降低Hela細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞)22.3%的生存率,具有抗癌作用[13],這表明不同濃度范圍的諾麗果汁對細(xì)胞的增殖作用不同。

        雖然本研究首次報道了1%~5%體積分?jǐn)?shù)諾麗果汁具有神經(jīng)保護(hù)作用,但是在更大濃度的范圍內(nèi),諾麗果汁對過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷是否還存在保護(hù)作用尚不得而

        知。此外,1%~5%體積分?jǐn)?shù)諾麗果汁產(chǎn)生的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。因此,今后將在更廣的濃度范圍內(nèi)研究諾麗果汁對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用,并探究其作用機(jī)制。

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