沈珊齊++錢炳俊+++索庚++呂穎芳++趙艷云

摘要：以維生素B6正常、缺乏、恢復(fù)、增強(qiáng)型食物飼喂小鼠，以血漿中維生素B6主要形式磷酸吡哆醛水平為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以小鼠體質(zhì)量和血糖水平為考察因素，通過飲食營養(yǎng)缺乏構(gòu)建獲得維生素B6營養(yǎng)缺乏小鼠模型。結(jié)果表明，維生素B6營養(yǎng)缺乏小鼠血漿中磷酸吡哆醛未能檢測(cè)，恢復(fù)組小鼠血漿中磷酸吡哆醛水平（215.67 pg/mL）得到較大的恢復(fù)，與對(duì)照組（157.00 pg/mL）之間沒有顯著性差異（P>0.05）；且維生素B6營養(yǎng)增強(qiáng)組小鼠血漿中磷酸吡哆醛水平（341.67 pg/mL）顯著高于其他各組（P<0.05）；維生素B6營養(yǎng)缺乏4周后小鼠平均體質(zhì)量（15.62 g）顯著低于維生素B6正常小鼠（18.31 g），補(bǔ)充維生素B6后小鼠體質(zhì)量迅速恢復(fù)；同時(shí)，缺乏期維生素B6營養(yǎng)缺乏小鼠的空腹血糖水平始終低于正常小鼠，補(bǔ)充維生素B6后其水平恢復(fù)緩慢。

關(guān)鍵詞：維生素B6；缺乏模型；小鼠；生長(zhǎng)；血糖

中圖分類號(hào)：S852.21文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0266-03

收稿日期：2014-10-13

基金項(xiàng)目：上海市自然科學(xué)基金（編號(hào)：11ZR1416200）。

作者簡(jiǎn)介：沈珊齊（1989—），女，湖北荊州人，碩士研究生，主要從事食品營養(yǎng)、保藏與加工研究。Tel：（021）34206613；E-mail：asd@sjtu.edu.cn。

通信作者：錢炳俊，博士，助理研究員，主要從事食品營養(yǎng)研究。Tel：（021）34206613；E-mail：bjqianfd@sjtu.edu.cn。維生素B6是一種水溶維生素，包括吡哆醇（pyridoxine，PN）、吡哆醛（pyridoxal，PL）和吡哆胺（pyridoxamine，PM ）3種形式，活化形式主要是5-磷酸吡哆醛（Pyridoxal 5′-phosphate，PLP ）。它是維持人體生理功能必需的微量營養(yǎng)素，以輔酶形式參與糖、蛋白質(zhì)和脂肪酸的正常代謝，并與白細(xì)胞、血紅蛋白的合成相關(guān)。近年來研究還顯示，維生素B6有一定的抗氧化能力，能夠清除氧自由基[1]。在生活中，維生素B6的攝入常被忽視，維生素B6缺乏在中國人群中比較普遍，2012年深圳市居民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查顯示，人們對(duì)核黃素、硫胺素、維生素B6、葉酸和鈣等微量元素?cái)z入量偏低，其中維生素B6缺乏最為嚴(yán)重，僅為推薦攝入量的16%[2-3]。維生素B6缺乏雖然不會(huì)直接造成嚴(yán)重癥狀，但會(huì)導(dǎo)致虛弱、失眠、神經(jīng)紊亂、唇干裂、舌炎、口腔炎、動(dòng)脈硬化、貧血以及細(xì)胞介導(dǎo)免疫損壞等一系列容易被忽視的慢性健康問題。通常，維生素B6亦是糖代謝、氨基酸和DNA合成不可或缺的輔酶[4]，對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的影響。因此，闡述維生素B6對(duì)人體免疫等生理功能的影響的分子機(jī)制，獲得其營養(yǎng)缺乏型的小鼠模型尤為重要。本研究采用自建配方，手工烘焙加工維生素B6正常、缺乏、恢復(fù)、增強(qiáng)型小鼠飼料，通過4周的缺乏飼喂和4周的恢復(fù)飼喂試驗(yàn)，以血漿中維生素B6活化形式磷酸吡哆醛水平為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以小鼠體重和血糖水平為考察因素，通過飲食營養(yǎng)缺乏構(gòu)建獲得維生素B6營養(yǎng)缺乏小鼠模型，進(jìn)一步豐富維生素B6在生理功能調(diào)節(jié)中作用的理論。

1材料與方法

1.1材料

正常雄性3周齡Blab/c小鼠28只購自上海史萊克動(dòng)物中心。

1.2試劑

飼料中的蔗糖、鹽、植物油等均為食品級(jí)，購自歐尚超市，纖維素購自阿拉丁（試劑）上海有限公司，維生素A、D、E、B1、B2、B6、B16購自上海信誼藥業(yè)有限公司，煙酸和泛酸來自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司，硒和微生素選用美國斯旺森公司保健品，礦質(zhì)元素為相應(yīng)化學(xué)純?cè)噭?。?qiáng)生穩(wěn)豪型血糖試紙（ONETOUCH Ultra Test Strips）購自強(qiáng)生公司，標(biāo)準(zhǔn)品磷酸吡哆醛購自美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)將28只雄性3周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組：缺乏組（21只）和對(duì)照組（7只）。分別采用維生素B6缺乏和正常的自制飼料飼喂4周。然后，將缺乏組隨機(jī)再分為3組：缺乏組、恢復(fù)組和增強(qiáng)組，每組7只，分別采用維生素B6缺乏、正常、增強(qiáng)的自制飼料繼續(xù)飼喂4周，對(duì)照組喂完全飼料，構(gòu)建維生素B6缺乏小鼠模型。

1.3.2維生素B6缺乏飼料的配制參照Miller等試驗(yàn)配方[5-7]和國家標(biāo)準(zhǔn)GB 14924.3—2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠大鼠配合飼料》，在小鼠飼料基本營養(yǎng)構(gòu)成的基礎(chǔ)上，根據(jù)飼料成品的特性，對(duì)飼料中的成分比例進(jìn)行調(diào)整，添加了淀粉，最終形成的配方見表1。

除維生素B6外，其他礦物質(zhì)和維生素組成則參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 14924.3—2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠大鼠配合飼料》，具體見表2和表3。水溶性維生素片研磨成粉末后，溶解于水中；化學(xué)級(jí)礦物質(zhì)試劑原料稱量后溶解于水中。在蛋白、糖、油等組要成分按比例混合后，加入適當(dāng)比例維生素水和礦物質(zhì)水，加入適量脂溶性維生素，同時(shí)加入各組對(duì)應(yīng)的維生素B6的量，補(bǔ)充一定水分，捏成面團(tuán)，分割成直徑1 cm的粗棒狀或者長(zhǎng)圓柱形的顆粒，微波加熱，淀粉糊化后冷卻成型，每日早上投喂。由于水溶性維生素加熱易分解，在飲用水也按照相同配方添加水溶性維生素，定時(shí)定量補(bǔ)充。

小鼠飼養(yǎng)在上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，飼養(yǎng)環(huán)境條件為：光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h，溫度（24±1） ℃，濕度（60±5）%。

1.3.3小鼠生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定小鼠飼養(yǎng)期間，每周四下午對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱質(zhì)量，比較不同組小鼠質(zhì)量變化。

1.3.4小鼠血糖的測(cè)定小鼠飼養(yǎng)期間，每周五上午投喂飼料前，尾部取血，采用強(qiáng)生血糖儀（強(qiáng)生穩(wěn)豪倍易型血糖儀）配合強(qiáng)生試紙測(cè)定空腹血糖。

1.3.5小鼠血漿磷酸吡哆醛水平分析飼喂8周后，參考Miduttun等對(duì)B族維生素的測(cè)定方法[8]，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS/MS）分析小鼠血漿中維生素B6活化形式磷酸吡哆醛含量。儀器采用上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心的超高效液相色譜（ACQUITY UPLC system，MA，USA）串聯(lián)三段四級(jí)質(zhì)譜儀（AB SCIEX，Toronto，Ontario，Canada）。

采樣：每組小鼠取3個(gè)平行，毛細(xì)管眼眶取血，冰上保存，1 h內(nèi)2 000 g、4 ℃離心10 min，取上清。樣品的前處理：60 μL 血樣加入等體積三氯乙酸（TCA，60 g/L），冰上混合 1 h，5 800 g、4 ℃離心15 min。轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中，氮吹吹干后100 μL甲醇定容。

色譜條件如下，色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18。測(cè)定離子對(duì)：246.00/97.00。流動(dòng)相：組分A，650 mmol/L 乙酸；組分B，100 mmol/L七氟丁酸溶解于流動(dòng)相A；組分C，90%乙腈。流速，1.3 mL/min。標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，配制100 ng/mL，半數(shù)稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到R2=0.997 5，0.304～100 ng/mL的檢測(cè)限。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理小鼠生長(zhǎng)水平差異

由圖1可見，飼養(yǎng)初期，各組小鼠體質(zhì)量基本一致。飼養(yǎng)3周，缺乏組各組小鼠體質(zhì)量都顯著低于對(duì)照組小鼠（P<005），第4周繼續(xù)保持該趨勢(shì)。當(dāng)恢復(fù)組和增強(qiáng)組小鼠恢復(fù)維生素B6補(bǔ)充后，小鼠體質(zhì)量迅速增長(zhǎng)，接近對(duì)照組水平。此時(shí)，缺乏組小組體質(zhì)量仍然顯著低于其他各組。維生素B6增強(qiáng)飼養(yǎng)2周后，增強(qiáng)組體質(zhì)量高于恢復(fù)組，但差異不明顯。最后2周，恢復(fù)組和增強(qiáng)組小鼠體質(zhì)量基本沒有差別，略低于對(duì)照。說明補(bǔ)充日常所需維生素B6即可以滿足生長(zhǎng)需求，迅速恢復(fù)生長(zhǎng)水平。

2.2維生素B6缺乏對(duì)小鼠血糖的影響

由圖2可見，試驗(yàn)初期，維生素B6缺乏組小鼠空腹血糖水平低于正常的對(duì)照組小鼠。第2周時(shí)，這種現(xiàn)象最為明顯，對(duì)照組小鼠的空腹血糖水平顯著高于其他各組小鼠。整個(gè)試驗(yàn)期，維生素B6缺乏小鼠的平均血糖水平都低于對(duì)照組。當(dāng)缺乏小鼠開始補(bǔ)充維生素B6時(shí)1周（試驗(yàn)第5周），可以看到，其他各組小鼠平均空腹血糖水平仍低于對(duì)照組。但之后的6～8周，增強(qiáng)組小鼠空腹血糖水平始終略高于對(duì)照組，恢復(fù)組小鼠與對(duì)照組基本一致，只有缺乏組小鼠平均空腹血糖水平始終低于其他各組?？梢?，維生素B6對(duì)于機(jī)體維持空腹血糖水平有一定影響，缺乏后再補(bǔ)充可逐漸回復(fù)正常水平。

2.3維生素B6缺乏對(duì)血漿中PLP的影響

PLP是體內(nèi)維生素B6水平的重要指標(biāo)。圖3結(jié)果顯示，在維生素B6缺乏飲食小鼠中，PLP沒有檢測(cè)到。其他3組，PLP含量從大到小依次為增強(qiáng)組（341.67 pg/mL）>恢復(fù)組（215.67 pg/mL）>對(duì)照組（157.00 pg/mL），表明在4周的恢復(fù)期后，小鼠體內(nèi)的維生素B6水平得到了很好的恢復(fù)，甚至是伴隨大劑量增強(qiáng)得到提升。但是，10倍增強(qiáng)的飲食并未在PLP水平上體現(xiàn)出相應(yīng)的放大倍數(shù)。同時(shí)，恢復(fù)組的小鼠血漿中PLP水平表現(xiàn)要優(yōu)于對(duì)照組。結(jié)果表明維生素B6缺乏后，補(bǔ)充日常飲食建議維生素B6劑量即可。

3結(jié)論與討論

由于維生素B6是碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)代謝的重要輔酶，維生素B6對(duì)機(jī)體健康生長(zhǎng)有重要影響。早在1945年，對(duì)維生素B6進(jìn)行飼喂研究發(fā)現(xiàn)，維生素B6缺乏小鼠體質(zhì)量會(huì)低于正常小鼠[5]。近期Doke等的研究也顯示維生素B6缺乏會(huì)影響組織生長(zhǎng)[6]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)維生素B6缺乏小鼠體質(zhì)量顯著低于正常小鼠，這與Lewicka等研究認(rèn)為補(bǔ)充維生素B6可以顯著增加大鼠的體質(zhì)量[9]類似。Huge等研究也發(fā)現(xiàn)缺乏維生素B6會(huì)導(dǎo)致大鼠的生長(zhǎng)率比正常飲食低一半[10]，而本研究則進(jìn)一步闡明，缺乏維生素B6導(dǎo)致的生長(zhǎng)緩慢，是可以通過及時(shí)補(bǔ)充日常所需的維生素B6得到迅速改善的。

碳水化合物代謝在2種類型的糖尿病中都有重要影響。血糖主要由胰島素調(diào)控。維生素B6的缺乏會(huì)導(dǎo)致胰腺和血循環(huán)中的胰島素量減少[11]?？崭寡堑乃街饕梢苑从骋葝u素對(duì)血糖的調(diào)節(jié)作用?？崭寡橇吭降?，表明胰島素對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力減弱，胰島素功能下降。維生素B6可能對(duì)血糖調(diào)節(jié)有影響。Solomon等研究表明補(bǔ)充吡哆醇可以降低鏈霉素引起的糖尿病動(dòng)物的血糖水平[12]；在高血糖癥的情況下，磷酸吡哆醛和總的維生素B6及其衍生物水平也會(huì)顯著下降[13]；在機(jī)理上，Toyota等的研究則顯示，維生素B6缺乏小鼠胰島素B細(xì)胞的功能會(huì)退化[14]?？梢钥吹皆谌狈ζ?，缺乏維生素B6的小鼠空腹血糖含量普遍低于對(duì)照組。維生素B6缺乏小鼠胰島素調(diào)節(jié)能力下降。

維生素B6缺乏小鼠血液循環(huán)中磷酸吡哆醛缺失，體質(zhì)量生長(zhǎng)變緩，血糖調(diào)節(jié)能力下降，試驗(yàn)采取的飼料和飼養(yǎng)方法可以有效得到維生素B6缺乏小鼠模型。在維生素B6長(zhǎng)期缺乏的情況下，繼續(xù)缺乏、恢復(fù)維生素B6供應(yīng)、10倍增強(qiáng)維生素B6可以補(bǔ)充每日飲食所需的維生素B6，就能逐漸恢復(fù)正常生長(zhǎng)和提高血糖調(diào)節(jié)能力。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bilski P，Li M Y，Ehrenshaft M，et al. Vitamin B6 （pyridoxine） and its derivatives are efficient singlet oxygen quenchers and potential fungal antioxidants[J]. Photochemistry and Photobiology，2000，71（2）：129-134.

[2]潘柳波，王舟，黃薇，等. 深圳市居民戶膳食模式調(diào)查[J]. 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，12（11）：953-955.

[3]翟鳳英，何宇娜，王志宏，等. 中國城鄉(xiāng)居民膳食營養(yǎng)素?cái)z入狀況及變化趨勢(shì)[J]. 營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2005，27（3）：181-184.

[4]Hellmann H，Mooney S. Vitamin B6：a molecule for human health？[J]. Molecules，2010，15（1）：442-459.

[5]Baumann C A. Relavtive effects of casein and trytophane on the health and xanthurenic acid excretion of pyridoxine-deficient mice[J]. Journal of Biological Chemistry，1945，157（2）：551-562.

[6]Doke S，Inagaki N，Hayakawa T，et al. Effect of vitamin B6 deficiency on an antibody production in mice[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1997，61（8）：1331-1336.

[7]Inubushi T，Okada M，Matsui A，et al. Effect of dietary vitamin B6 contents on antibody production[J]. BioFactors，2000，11（1/2）：93-96.

[8]Midttun ，Hustad S，Ueland P M. Quantitative profiling of biomarkers related to B-vitamin status，tryptophan metabolism and inflammation in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry，2009，23（9）：1371-1379.

[9]Lewicki S，Zdanowski R. The effect of vitamin B6 supplementation of protein deficiency diet on hematological parameters in the blood of rats subjected/non subjected to physical exertion-a pilot study[J]. Central European Journal of Immunology，2012，37（3）：187-192.

[10]Hugh D R，Nina M，Paul R T，et al. The effects of a primary nutritional deficiency （vitamin B study）[J]. Food and Nutrition Sciences，2012，3（9）：1238-1244.

[11]Gershoff S. Insulin sensitivity in vitamin B6-deficient rats[J]. Annals of Nutrition and Metabolism，1974，16（6）：337-351.

[12]Solomon L R，Cohen K. Erythrocyte O2 transport and metabolism and effects of vitamin B6 therapy in type Ⅱ diabetes mellitus[J].Diabetes，1989，38（7）：881-886.

[13]She Q B，Nagao I，Hayakawa T，et al. A simple HPLC method for the determination of S-adenosylmethionine and S-adenosylhomocysteine in rat tissues：the effect of vitamin B6 deficiency on these concentrations in rat liver[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1994，205（3）：1748-1754.

[14]Toyota T，Kai Y，Kakizaki M，et al. The endocrine pancreas in pyridoxine deficient rats[J]. The Tohoku Journal of Experimental Medicine，1981，134（3）：331-336.

[15]Jain S K. Vitamin B6 （pyridoxamine）supplementation and complications of diabetes[J]. Metabolism，2007，56（2）：168-171.

[16]Chen A S，Taguchi T，Aoyama S，et al. Antioxidant activity of a Schiff base of pyridoxal and aminoguanidine[J]. Free Radical Biology & Medicine，2003，35（11）：1392-1403.王慶容，王福群. 埃里格孢的生物學(xué)特性及致病性初步研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：269-271.