董瑜++郭偉+++任浩++孔凡玉+++馮超

摘要：以密胺樹脂為囊壁，采用原位聚合法將4種有效防治煙草黑脛病的殺菌劑制備成微膠囊，并測其相關(guān)性能表征，結(jié)果表明，各原藥微膠囊包覆完好，致密，粒徑大小適宜，分布均勻，高效液相色譜和紅外分析顯示，各原藥微囊包覆率高且成分結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。溫室盆栽試驗表明，15%甲霜靈微膠囊懸浮劑、60%甲霜靈微膠囊粉劑、60%烯酰嗎啉微囊粉劑的防效高于常規(guī)藥劑72%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑，持效期長達35 d以上，在生產(chǎn)中有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：殺菌劑；微膠囊；性能表征；盆栽；煙草黑脛病

中圖分類號： S435.72文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0166-04

收稿日期：2015-01-07

基金項目：福建省南平市科技項目（編號：201203）。

作者簡介：董瑜（1989—），男，山東濟寧人，碩士，主要從事煙草病害防治研究。E-mail：dongyu915101089@163.com。

通信作者：孔凡玉，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物病理學(xué)研究。Tel：（0532）88701526；E-mail：kongfanyu123@163.com。微膠囊技術(shù)是指將芯材（固體、液體或氣體）包裹在囊壁材料中，形成直徑幾微米至幾百微米微小容器（即微膠囊）的技術(shù)，與常規(guī)農(nóng)藥劑型相比，微膠囊制劑具有持效期長、農(nóng)藥有效利用率高、可減少或避免農(nóng)藥因外界環(huán)境造成的分解流失、降低農(nóng)藥對環(huán)境污染等特點[1-2]。煙草黑脛病是世界煙草生產(chǎn)中危害最嚴重的病害之一，也是中國煙草的主要病害[3]，其病原為煙草疫霉，破壞性極強，大田侵染后常造成煙株成片凋萎死亡[4]。目前生產(chǎn)上防治煙草黑脛病仍以藥劑防治為主。農(nóng)業(yè)上常用的藥劑有甲霜靈、烯酰嗎啉、乙磷鋁等，這類內(nèi)吸性殺菌劑可通過植物疏導(dǎo)進入發(fā)病部位，抑制孢子囊、孢子萌發(fā)，從源頭上控制菌絲體的形成生長。由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所聯(lián)合開發(fā)的丙烯酰胺類殺菌劑丁吡嗎啉是我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新農(nóng)藥品種，經(jīng)溫室及大田試驗，丁吡嗎啉能有效防治煙草黑脛病[5]。拜耳作物科學(xué)公司開發(fā)的氟吡菌胺是具有獨特作用機理的新型苯甲酰胺類殺菌劑，主要用于防治卵菌病害如霜霉病、疫病等，主要作用于細胞膜上的類血影蛋白，使類血影蛋白發(fā)生移位表現(xiàn)殺菌活性，與目前常用藥劑如甲霜靈、烯酰嗎啉等作用機制不同，且無交互抗性[6-7]。但此類劑型的化學(xué)藥劑存在高毒、持效期短、殘留量大、易污染土壤及水源等通病，且目前關(guān)于防治煙草黑脛病的微膠囊殺菌劑研究尚未見報道。本試驗對上述藥劑進行微膠囊化，并測定其防治效果、持效期，有效解決殺菌劑使用過程中因其吸附性低、流動性強造成的殘留污染、藥效短等問題，并減緩植物抗藥性的產(chǎn)生，旨在為殺菌劑類農(nóng)藥新劑型的開發(fā)及其在煙草病害防治上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

煙草品種：小黃金1025（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所）。供試菌株：煙草黑脛病菌（0號小種），保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所。供試藥劑：96%甲霜靈原藥（揚州科林化學(xué)品有限公司），98.3%烯酰嗎啉原藥（揚州科林化學(xué)品有限公司），95%氟吡菌胺原藥（廣西南寧廣酞農(nóng)業(yè)化工有限公司），丁吡嗎啉原藥（質(zhì)量分數(shù)≥99%，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)），72%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑（江蘇利民化工有限責任公司），50%烯酰嗎啉可濕性粉劑（江蘇龍燈化學(xué)有限公司）。試劑：多種非離子表面活性劑和陰離子表面活性劑復(fù)配物（農(nóng)乳0203）、亞甲基雙萘磺酸鈉NNO，烷基萘磺酸鹽甲醛tersperse 2425、370%～40.0% 甲醛、三聚氰胺、二甲苯、氯化銨、氫氧化鈉、碳酸鈉、鹽酸、黃原膠、乙二醇等均為分析純試劑；甲醇、乙腈為色譜純，均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。儀器：Agilent 1220 infinity LC高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]；LC-10AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；PHS-3D功能型pH計（上海三信儀表廠）；DP-02型激光粒度分析儀（珠海歐美克儀器有限公司）；NIKON Eclipse E100雙目顯微鏡（上海普赫光電科技有限公司）；85-2A型數(shù)顯恒溫測速磁力攪拌器、JJ-1精密增力電動攪拌器（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）；ZNHW型智能控溫儀（上海騰方儀器設(shè)備有限公司）；Pulverisette 6 單罐行星式高能球磨機（上海人和科學(xué)儀器有限公司）；Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡（株式會社日立制作所）；美國Nicolet-380型傅立葉變換紅外光譜儀（KBr壓片）（美國熱電集團）。

1.2方法

1.2.1微膠囊的制備

1.2.1.1密胺樹脂預(yù)聚體的制備過程按Yuan等的方法[8]制備密胺樹脂預(yù)聚體。在錐形瓶中加入三聚氰胺和甲醛（摩爾比1 ∶2），用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值到8.5～9.0，升溫至70 ℃，密閉攪拌，反應(yīng)10 min后獲得密胺樹脂預(yù)聚物水溶液。

1.2.1.2微膠囊水懸浮劑的制備在裝有攪拌器的三口圓底燒瓶中加入甲霜靈原藥（15.625 0 g）和二甲苯（27.0 g），磁力攪拌器攪拌均勻后加入2.5 g助劑0203，充分振蕩形成穩(wěn)定的O/W乳液，加入42.0 g密胺樹脂預(yù)聚體，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至400 r/min，2 h內(nèi)加入稀鹽酸緩慢調(diào)節(jié)pH值至4.2，后加入 2 g 氯化銨固化囊壁0.5 h，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.5～7.0，加入2 g分散劑NNO，再加入0.2 g黃原膠、4 g乙二醇，用水將體系總質(zhì)量補足至100 g，混合均勻即得到15%甲霜靈微膠囊緩釋劑水懸浮劑。

1.2.1.3微膠囊粉劑的制備將甲霜靈、烯酰嗎啉、丁吡嗎啉、氟吡菌胺原藥分別與水以質(zhì)量比1 ∶2混合，加入1%分散劑2425，于球磨儀中進行研磨，至原藥顆粒小于5 μm，在裝有攪拌器的三口圓底燒瓶中加入原藥 ∶密胺樹脂預(yù)聚體（1 ∶1），調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至400 r/min，2 h內(nèi)加入稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.2，后加入2 g氯化銨固化囊壁0.5 h，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.5～7.0，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心晾干即得微膠囊粉劑。

1.2.2形態(tài)特征取制備的微膠囊加水稀釋分散涂抹于載玻片上，自然晾干后，噴金處理，掃描電子顯微鏡下觀察。

1.2.3粒徑大小及分布用激光粒度分布儀測定微膠囊的粒徑大小及分布。

1.2.4包覆率測定取3份微膠囊懸浮液各2.0 mL（微膠囊粉劑稱取2.000 0 g），加入100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，振蕩1 min，過0.22 μm濾膜，在相應(yīng)色譜條件下測定農(nóng)藥含量，即為囊外農(nóng)藥量，包覆率計算公式如下：

包覆率=（有效成分總投入量-囊外有效成分）/有效成分總投入量×100%。 （1）

各原藥色譜條件如下：甲霜靈色譜條件：Agilent 1220 infinity LC高效液相色譜儀，SunfireTM C18 色譜柱 （150 mm×4.6 mm×5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量 10 μL，檢測波長220 nm，流動相乙腈 ∶甲醇 ∶水=25 ∶35 ∶40（體積比），保留時間5.42 min。氟吡菌胺色譜條件：LC-10AT型高效液相色譜儀，ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，檢測波長265 nm，流動相甲醇 ∶水=75 ∶25（體積比），保留時間約為4.6 min。烯酰嗎啉色譜條件：LC-10AT型高效液相色譜儀，ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進樣定量環(huán)20 μL，檢測波長 243 nm，流動相甲醇 ∶水=65 ∶35（體積比），經(jīng)過濾（0.45 μm尼龍膜）、脫氣處理。丁吡嗎啉色譜條件：LC-10AT型高效液相色譜儀，OD-SC18色譜柱（4.6 mm×150 mm×5 μm），流速：1.2 mL/min，柱溫室溫，進樣量：10 μL，檢測波長240 nm，流動相甲醇 ∶乙腈 ∶水=30 ∶30 ∶30（體積比）。

1.2.5紅外分析將上述制備的微膠囊過濾，用蒸餾水沖洗、干燥獲得甲霜靈微膠囊干粉。用紅外分析儀分別測定各原藥、微囊干粉、密胺樹脂囊壁的紅外吸收光譜。

1.2.6溫室盆栽試驗菌谷制備：500 g谷子加水1 L煮開至半數(shù)谷粒呈開花狀，裝入500 mL三角瓶，120 ℃滅菌 30 min。無菌條件下取1 cm×1 cm的煙草黑脛病菌菌塊轉(zhuǎn)接到含有菌谷的三角瓶內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)14 d備用。將煙苗移栽到直徑10 cm、高10 cm的花盆中，用滅菌土壤、草炭與珍珠巖培養(yǎng)（體積比為=2 ∶2 ∶1）[9]，每盆1株。移栽緩苗后進行藥劑處理。2～3 d后于根部接菌谷10 g/株。設(shè)A、B、C、D、E、F、G、H 8個處理：A（對照）：不施藥劑，接菌谷；B：施72% 甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑600倍液；C：接菌谷，施50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1 200倍液；D：15%甲霜靈微膠囊水懸浮劑1 200倍液；E：60%甲霜靈微膠囊粉劑0.20 g；F：60%烯酰嗎啉微膠囊粉劑0.34 g；G：60%丁吡嗎啉微膠囊粉劑0.67 g；H：60%氟吡菌胺微膠囊粉劑0.06 g。A、B、C、D按倍數(shù)稀釋后灌根50 mL/盆，微膠囊粉劑與一定量細土混勻，等量埋于煙株根際。每處理15盆，3次重復(fù)。將煙苗置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)[10]（白天30 ℃，黑夜28 ℃，光照時間：12 h/d，相對濕度95%）。施藥后7、14、21、28、35 d計算病情指數(shù)、防治效果。

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×級數(shù)）/（最高發(fā)病級數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）×100；（2）

防效=[（對照組病指-處理組病指）]/對照組病指×100%。（3）

1.3數(shù)據(jù)分析

用DPS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)特征

根據(jù)上述條件制備15%甲霜靈微膠囊懸浮劑（圖1-a）及各粉劑（圖1-b），電鏡下觀察，微囊懸浮劑形態(tài)良好，表面光滑致密無凹陷，大小均一，分散性能良好；微囊粉劑表面包覆完全、致密。

2.2粒度分布

采用激光粒度分布儀對其粒度分布進行研究，可知該微膠囊懸浮劑粒徑主要分布在10～20 μm之間，平均粒徑為12.93 μm（圖2-a）；粉劑粒徑主要分布在7～17 μm之間，平均粒徑為9.76 μm（圖2-b）。

2.3包覆率測定

經(jīng)高效液相色譜分析各微膠囊劑包覆率見表1。

2.4紅外分析

圖3-A至圖3-E分別為15%甲霜靈微膠囊懸浮液、60%甲霜靈微膠囊粉、60%烯酰嗎啉微膠囊粉、60%丁吡嗎啉微膠囊粉劑、60%氟吡菌胺微膠囊粉劑的紅外光譜圖，各圖中a、b、c分別是原藥、密胺樹脂囊壁、微膠囊干粉的紅外吸收光譜圖。可以看出，各微膠囊的紅外譜圖（圖3中譜線c）是原藥物質(zhì)（圖3中譜線a）與密胺樹脂囊壁空殼譜圖（圖3中譜線b）的疊加，即微膠囊的紅外譜圖中包含原藥和囊壁的特征吸收峰，表明各原藥被密胺樹脂包覆且成分結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。

2.5溫室盆栽試驗

盆栽試驗結(jié)果見表2，接種黑脛病菌14 d后，各藥劑都表現(xiàn)出較高的防效，微膠囊中防效最高的是15%甲霜靈微膠囊懸浮劑的92.1%，低于對照藥劑（93.0%）。21 d后最高防效為82.3%，高于對照藥劑（75.7%），直至35 d時最高防效（75.1%）仍高于對照藥劑。甲霜靈微膠囊粉劑、烯酰嗎啉微囊粉劑也表現(xiàn)出同樣的防效趨勢，14 d 50%烯酰嗎啉可濕性粉劑防效為87.4%，比60%烯酰嗎啉微囊粉劑（75.6%）高。35 d后50%烯酰嗎啉可濕性粉劑防效只有58.0%，烯酰嗎啉微囊粉劑防效略高（61.7%），60%甲霜靈微膠囊粉劑防效為69.1%。丁吡嗎啉、氟吡菌胺的微囊粉劑雖然防效效果不好，但從21 d到35 d防效降低幅度較小，表現(xiàn)出了微囊持久緩慢釋放的效應(yīng)。由此可知，15%甲霜靈微膠囊懸浮劑、60%甲霜靈微膠囊粉劑、60%烯酰嗎啉微囊粉劑28 d后防效高于72%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑2種常規(guī)藥劑，持效期長達35 d以上。

3結(jié)論與討論

本研究選擇了能有效防治煙草黑脛病的殺菌劑——甲霜靈、烯酰嗎啉、丁吡嗎啉、氟吡菌胺制備微膠囊，測定其相關(guān)性能表征，并以72%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑作為對照研究其溫室盆栽防效，結(jié)果表明，15%甲霜靈微膠囊懸浮劑、60%甲霜靈微膠囊粉劑、60%烯酰嗎啉微囊粉劑的防效高于常規(guī)藥劑72%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑，持效期長達35 d以上，體現(xiàn)微膠囊劑對常規(guī)劑型在緩釋性及藥效持久性方面具有優(yōu)勢，為殺菌劑類農(nóng)藥新劑型的開發(fā)和其在煙草病害防治上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前農(nóng)藥微膠囊的制備方法從囊壁形成原理上大致可分為物理法、化學(xué)法及物理化學(xué)法。其中化學(xué)法包括界面聚合法和原位聚合法[11-13]。由于原位聚合法包封率高、穩(wěn)定性好，抗水滲透力強，成型穩(wěn)定，綜合成本較低，因而被廣泛使用[14]。 本試驗以三聚氰胺和甲醛經(jīng)原位聚合反應(yīng)生成的密胺樹脂作為囊壁材料。殺菌劑經(jīng)微囊化后其藥效、持效期與微膠囊的釋放機理密切相關(guān)，而微膠囊的釋放性能受測定時的分散介質(zhì)、芯壁比、溫度、光照、微生物等多種因素影響[15]。囊壁經(jīng)改性后也會影響囊壁的理化性質(zhì)，進而改變包囊物的釋放特性。如PEG接枝的微膠囊作壁材可以緩解初始突釋效應(yīng)[16]。用硅烷偶聯(lián)劑KH550改性脲醛樹脂后，經(jīng)SEM觀察發(fā)現(xiàn)，在形成的脲醛樹脂微膠囊表面有一薄層[17]。季銨化的微膠囊衍生物在中性介質(zhì)中的溶解度增加[18]。由于微膠囊囊壁上存在許多納米級的微孔，在減少農(nóng)藥用量、延長持效期的同時，減少了農(nóng)藥施用次數(shù)，使農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、抗藥性等問題得到緩解，這些問題還有待于進一步深入研究。

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