崔鄭龍++柴秀娟++孔德真+王愛(ài)英

摘要：從甘草、阿魏、苦豆子中篩選出4株對(duì)棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）抑制效果較好的內(nèi)生菌，通過(guò)其生理生化檢測(cè)、16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定；選擇抑菌效果最好的拮抗菌A，分別測(cè)定其胞內(nèi)、胞外分泌物的抑菌效果，并檢測(cè)該菌株對(duì)棉花種子萌發(fā)和活性氧酶系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，拮抗菌A為解淀粉枯草芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），其胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)的平均抑制率均高于胞外分泌物。拮抗菌A處理棉花可提高其成活率，但不引起植株系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性。拮抗菌A的主要抑菌物質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)，抑制產(chǎn)孢是其主要拮抗途徑。

關(guān)鍵詞：棉花枯萎病菌；拮抗菌；胞外分泌物；胞內(nèi)分泌物；抑菌效果

中圖分類號(hào)： S435.621.2+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0158-06

收稿日期：2015-01-19

基金項(xiàng)目：校企合作項(xiàng)目橫向課題（編號(hào)：0257-5001601）。

作者簡(jiǎn)介：崔鄭龍（1989—），男，碩士研究生，主要從事微生物資源研究。E-mail：1449006648@qq.com。

通信作者：王愛(ài)英，碩士，副研究員，主要從事植物基因工程與安全性評(píng)價(jià)、微生物資源篩選研究。E-mail：way-sh@126.com。棉花枯萎病是棉花的主要病害之一，其病原菌為尖孢鐮刀菌萎蔫專化型（Fusarium oxysporium f.sp.vasinfectum）。這種真菌在自然條件下很容易存活，主要通過(guò)土壤、種子、肥料進(jìn)行傳播[1]。長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑控制土傳性病害會(huì)提高種植成本，加重環(huán)境污染。輪作、曬土、深耕等方法雖能減少污染，但很難滿足日益增長(zhǎng)的生產(chǎn)需求[2]。通過(guò)生物防治方法來(lái)控制棉花枯萎病，具有可持續(xù)性強(qiáng)、減少環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展前景廣闊。植物內(nèi)生細(xì)菌和維管束中導(dǎo)致植物萎蔫的病原菌有相似的生態(tài)位，是生物防治的潛在資源。目前，研究人員已經(jīng)從甘草[3]、大蒜[4]、香蕉[5]、棉花[6]、茶樹(shù)[7]等上百種植物中分離出具有抑制病原真菌作用的內(nèi)生菌，但對(duì)于拮抗菌抑菌機(jī)理的研究仍然處于初步階段。研究表明，植物內(nèi)生菌主要通過(guò)生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)、分泌抑菌物質(zhì)、誘導(dǎo)寄主抗性來(lái)抑制植物病原菌生長(zhǎng)。有些內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的植物激素、磷酸鹽、黃酮類物質(zhì)、抗生素復(fù)合物、揮發(fā)性有機(jī)物可抑制病原菌定植，這也是細(xì)菌在植物體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)生存空間的一種有效機(jī)制[8-10]。植物產(chǎn)生化合物的不同將影響植物內(nèi)生菌群落的差異，植物的防衛(wèi)反應(yīng)對(duì)其內(nèi)生菌種群變化具有一定影響，是抵御相關(guān)真菌入侵的重要途徑之一[11]。優(yōu)勢(shì)菌株繁殖將通過(guò)激活植物防御反應(yīng)，從而影響其他微生物的種群變化。烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）和苦豆子（Sophora alopecuroides Linn.）都屬于多年生豆科草本植物，阿魏（Ferula asafoetida）屬于多年生傘形科草本植物。龔明福等和畢江濤等已經(jīng)分別從苦豆子、甘草中分離出了抑制枯萎病菌的內(nèi)生菌，但研究較為初步[12-13]。本研究中的甘草、阿魏、苦豆子采集于新疆維吾爾自治區(qū)石河子市。該地區(qū)屬于半干旱地區(qū)，土壤鹽堿化較為嚴(yán)重，從中篩選出抑制枯萎病菌的內(nèi)生菌，選擇抑制效果最好的拮抗菌A，分別檢測(cè)胞外、胞內(nèi)分泌物的抑菌效果及其對(duì)棉花種子萌發(fā)的影響，并測(cè)定處理后棉花葉片中多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的變化情況，旨在為闡明棉花枯萎病菌抗內(nèi)生菌的抑菌機(jī)制和分離抑菌物質(zhì)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料及培養(yǎng)基

采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）分離純化植物內(nèi)生細(xì)菌，采用LB培養(yǎng)基富集拮抗菌，采用查式一號(hào)培養(yǎng)基富集培養(yǎng)病原真菌，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）作為拮抗性試驗(yàn)培養(yǎng)基。供試材料：烏拉爾甘草、阿魏、苦豆子采集于石河子大學(xué)北區(qū)試驗(yàn)田，棉花品種為新陸早7號(hào)，棉花枯萎病病原菌、棉花種子由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2植物內(nèi)生菌的分離

分別選取甘草、阿魏、苦豆子主莖基部向上10～15 cm的莖段、向下10～15 cm的根段以及健康飽滿的葉片，分別用75%乙醇浸泡30 s，1%HgCl2浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗4～5遍，用無(wú)菌濾紙吸干水分。將根和莖切成5 mm長(zhǎng)小段，葉片剪成條狀，分別接種在NA平板中，每板5個(gè)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。將生長(zhǎng)出的細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，保存待用。

1.3棉花枯萎病拮抗菌的篩選

初篩：將棉花枯萎病病原菌在查氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)3 d，沾取菌體懸浮液接種在PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)3 d。挑取分離到的甘草內(nèi)生菌接種在枯萎病菌菌落的四周，每個(gè)平板接種4個(gè)點(diǎn)，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，選取周圍有明顯抑菌圈的細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩。光學(xué)顯微鏡下觀察枯萎病菌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。復(fù)篩：將培養(yǎng)3 d的枯萎病菌培養(yǎng)液用4層紗布過(guò)濾，用顯微計(jì)數(shù)法測(cè)定其孢子濃度。在PDA平板中加入200 μL 枯萎病菌的孢子懸液，涂布均勻。平板中間打直徑5 mm 的孔并封住孔底。將初篩的生防菌在NA液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)48 h，取40 μL生防菌發(fā)酵液置于孔內(nèi)（無(wú)菌水為對(duì)照）。每處理重復(fù) 3次，4 ℃存放16 h，28 ℃培養(yǎng)3～5 d后測(cè)量抑菌圈大小。

1.44種拮抗菌的鑒定

1.4.1生理生化檢測(cè)4種拮抗菌的生長(zhǎng)曲線、最適pH值、糖發(fā)酵、淀粉水解試驗(yàn)、革蘭氏染色試驗(yàn)[14]。

1.4.2拮抗菌的16S rDNA鑒定采用CTAB法[15]提取拮抗菌 DNA，采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物擴(kuò)增引物，F(xiàn)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系：DNA模板3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPmix 2 μL，相應(yīng)的引物10 μmol/L各1 μL，TaqDNA聚合酶5 U/μL 0.5 μL，ddH2O 16 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫24 h。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂塘凝膠電泳分析，委托華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。序列GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)分析比對(duì)，運(yùn)用ClustalX 2.0、MEGA 5.10軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5拮抗菌A胞外、胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌的影響

1.5.1拮抗菌A胞外、胞內(nèi)分泌物的制備選擇拮抗效果最好的拮抗菌A置于LB培養(yǎng)基中，28 ℃ 200 r/min 分別培養(yǎng)6、9、12、15、18 h，測(cè)量菌液在600 nm處的吸光度，確定其濃度。取40 mL菌液于50 mL試管中，6 000 r/min 離心10 min。上清液過(guò)濾除菌（0.22 μm），得到含有胞外分泌物的溶液。沉淀中加入10 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.2），充分混勻，冰浴超聲波破碎細(xì)胞，得到含有胞內(nèi)分泌物的溶液。將含有胞外、胞內(nèi)分泌物的溶液涂布于LB平板上，確定無(wú)活菌體存在。

1.5.2胞外、胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響將含有胞外、胞內(nèi)分泌物的溶液分別稀釋1、10、100倍，各取100 μL稀釋液與融化的PDA培養(yǎng)基混勻于平板中。完全凝固后，用0.5 cm的打孔器取枯萎病菌菌餅放于平板正中央。每個(gè)菌株胞內(nèi)外分泌物重復(fù)3次，以加入無(wú)菌水為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)4 d，測(cè)量枯萎病菌菌落的直徑，計(jì)算抑制率。

1.5.3胞外、胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌產(chǎn)孢的影響將枯萎病菌菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃培養(yǎng)至菌落直徑達(dá)4.5 cm，挖除周圍培養(yǎng)基，分別取上述胞外、胞內(nèi)分泌物稀釋液20 mL倒入平板處理20 min（無(wú)菌水為對(duì)照），傾去溶液，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d至孢子產(chǎn)生，每平板用10 mL無(wú)菌水將孢子洗下，4層紗布過(guò)濾得孢子懸浮液，顯微觀察記錄孢子數(shù)，并計(jì)算產(chǎn)孢抑制率。

1.5.4胞外分泌物與胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響取50 μL上述胞外、胞內(nèi)分泌物稀釋液置于凹玻片凹槽中（無(wú)菌水作為對(duì)照），加入50 μL枯萎病菌孢子懸浮液，混合后用蓋玻片蓋嚴(yán)，28 ℃恒溫培養(yǎng)。分別在0、4、8、12、16、20、24、28 h鏡檢孢子萌發(fā)情況，測(cè)量孢子的長(zhǎng)度。每樣品重復(fù) 4 次，每次重復(fù)檢查5個(gè)視野，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算孢子萌發(fā)的平均長(zhǎng)度。

1.6拮抗菌A對(duì)棉花的影響

1.6.1拮抗菌A對(duì)棉花種子萌發(fā)的影響采用70%乙醇清洗棉花種子30 s，無(wú)菌水沖洗3～4次，每次5 min，分裝于平板中，每個(gè)平板30粒種子。取20 mL拮抗菌A培養(yǎng)液浸泡種子10 min（無(wú)菌水作對(duì)照），傾去培養(yǎng)液，無(wú)菌水清洗3次，每次20 mL。25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)，3 d后調(diào)查種子萌發(fā)率。

1.6.2棉花活性氧酶系統(tǒng)分析按照草炭土、珍珠巖、蛭石為2 ∶1 ∶1的比例配制土壤，將棉花枯萎病菌孢子懸液（30 mL/盆）混合在土壤中（蒸餾水作對(duì)照）。將棉花種子用70%乙醇表面消毒30 s，用蒸餾水沖洗3～4次，每次5 min，用拮抗菌A培養(yǎng)液浸泡種子10 min（無(wú)菌水作對(duì)照），傾去培養(yǎng)液，清洗3次，室溫（23 ℃）浸泡24 h，播種在直徑為20 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽播種10粒，常規(guī)管理。播種后第20天計(jì)算成活率，之后每盆補(bǔ)加拮抗菌A培養(yǎng)液10 mL于土壤中，菌液濃度為 106 CFU/mL，以蒸餾水作為對(duì)照。播種后第40天、第50天、第60天、第70天分別測(cè)定POD、PPO、PAL活性[16]。

2結(jié)果與分析

2.1棉花枯萎病拮抗菌的分離和篩選

分離得到來(lái)自甘草、阿魏、苦豆子不同植株部位的內(nèi)生細(xì)菌共計(jì)25株，其中有11株來(lái)自甘草，5株來(lái)自阿魏，9株來(lái)自苦豆子。篩選得到7株對(duì)枯萎病菌有抑制作用的內(nèi)生菌，選擇了4株抑菌效果較好的菌株進(jìn)行復(fù)篩（表1）。顯微觀察抑菌圈附近的菌絲形態(tài)，發(fā)現(xiàn)有明顯的變形（圖1）。菌株A初篩的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑為26.96 mm，與其他菌株差異顯著。菌株B在復(fù)篩中表現(xiàn)出較大的抑菌圈，但和A菌株抑菌圈直徑無(wú)顯著差異。

2.24株拮抗菌的生長(zhǎng)特性

A、B、C、D的生理生化檢測(cè)結(jié)果表明，4株拮抗菌的最適pH值都偏酸性，A、B、C為革蘭氏陽(yáng)性菌，D為陰性菌（表2）。

2.3拮抗菌的16S rDNA鑒定

菌株A、B、C、D的16S rDNA序列通過(guò)鄰位相接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。A與Bacillus amyloliquefaciens較相似，遺傳距離為1.972。B與Bacillus tequilensis較相似，遺傳距離為0.009。C與Bacillus sp. 較相似，遺傳距離為1.970。D與

2.4拮抗菌A胞外、胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌的影響

2.4.1胞外、胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響拮抗菌A胞外、胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的平均抑制率分別為8.55%、9.41%（圖3-a）。抑制率隨著菌液濃度的增加而增加，富集18 h的胞外分泌物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)27.60%；富集15 h的胞內(nèi)分泌物抑制率達(dá)32.93%（圖3-a、圖3-b）。胞外、胞內(nèi)分泌物的最大抑制率均出現(xiàn)在細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期。

2.4.2胞外、胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌產(chǎn)孢的影響拮抗菌A胞外、胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌產(chǎn)孢的平均抑制率分別為26.32%、40.14%（圖4）。胞外分泌物的抑制率在對(duì)數(shù)期中后期有一定下降，在穩(wěn)定期達(dá)最大值，富集18 h的胞外分泌物抑制率達(dá)72.29%；胞內(nèi)分泌物的抑制率在對(duì)數(shù)期早期顯著增加并達(dá)到最大值，對(duì)數(shù)期中后期逐漸穩(wěn)定，穩(wěn)定期有所回落，富集9、15 h的胞內(nèi)分泌物抑制率達(dá)88.81%。

2.4.3胞外、胞內(nèi)分泌物對(duì)枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響孢子萌發(fā)長(zhǎng)度隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加（圖5-a），富集9 h的胞外分泌物在孢子萌發(fā)24 h時(shí)抑制率最大，達(dá)到23.15%；富集15 h的胞內(nèi)分泌物在孢子萌發(fā)28 h時(shí)抑制率最大，達(dá)到26.09%。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，胞外、胞內(nèi)分泌物處理枯萎病菌后，部分孢子在萌發(fā)時(shí)，出現(xiàn)了菌絲畸形、斷裂的現(xiàn)象，其中胞內(nèi)分泌物處理后變化比較明顯（圖5-b）。

2.5拮抗菌A對(duì)棉花生長(zhǎng)的影響

2.5.1拮抗菌A對(duì)棉花種子萌發(fā)的影響拮抗菌A處理對(duì)棉花種子濕質(zhì)量、干質(zhì)量、發(fā)芽率并無(wú)顯著影響，但對(duì)其成活率具有顯著影響（表3）。單獨(dú)用拮抗菌A處理過(guò)的種子成活率增至48.33%，單獨(dú)用枯萎病菌處理的種子成活率下降至

35.83%，均與對(duì)照差異顯著。拮抗菌A與枯萎病菌共同作用時(shí)，棉苗的成活率與對(duì)照一致。

2.5.2棉花POD、PPO、PAL分析棉花播種40 d，共同用拮抗菌A和枯萎病菌處理組的PAL活性顯著提高，單獨(dú)用A或枯萎病菌處理的棉花PAL活性也與對(duì)照差異顯著。其他處理下PAL、POD 、PPO活與對(duì)照差異不顯著（表4）。

3結(jié)論與討論

目前應(yīng)用較多的生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、土壤放射桿菌（Agrobacterium radiobacter）等。其中芽孢桿菌屬具有抗逆性強(qiáng)、抗菌譜廣等特點(diǎn)，是植物微生態(tài)體系中的優(yōu)勢(shì)微生物種群，是理想的植物病害生防細(xì)菌來(lái)源之一[17]。本研究得到的抑菌效果最好的拮抗菌A為解淀粉枯草芽孢桿菌，分離自甘草的葉片，它增

殖速度快，富集12 h菌濃度可達(dá)108 CFU/mL，枯萎病菌達(dá)到這一濃度需要在相同條件下富集72 h，這使得拮抗菌A能夠在植物中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

枯草芽孢桿菌的生防作用機(jī)制多樣，主要有競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、溶菌、誘導(dǎo)植物抗病性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等[18]。已經(jīng)有學(xué)者從拮抗內(nèi)生菌發(fā)酵液中分離出了抑制枯萎病菌的物質(zhì)，這些抑菌物質(zhì)主要包括化合物[19]、脂肽[2]、糖類[20]、蛋白[21]，這些物質(zhì)的分泌對(duì)于拮抗菌在植物中占據(jù)有利地位起到了關(guān)鍵作用?？莶菅挎邨U菌分泌產(chǎn)生的抑菌蛋白對(duì)植物病原菌抑制作用機(jī)制包括抑制病原菌孢子產(chǎn)生、萌發(fā)，導(dǎo)致菌絲畸形，細(xì)胞壁溶解和原生質(zhì)泄露。本研究從抑制枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)3個(gè)方面檢測(cè)胞外、胞內(nèi)分泌物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其抑制產(chǎn)孢的作用較為明顯。雖然通過(guò)顯微觀察發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)、胞外分泌物也能引起菌絲畸形、孢子萌發(fā)遲緩，但抑制率

遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)產(chǎn)孢的抑制率，因此抑制產(chǎn)孢可能是胞內(nèi)、胞外分泌物的主要抑制途徑。此外，同種細(xì)菌在不同的生長(zhǎng)時(shí)期，其胞內(nèi)各種酶的活性、營(yíng)養(yǎng)需求及代謝產(chǎn)物均有一定差異。細(xì)菌在接近穩(wěn)定期時(shí)，次生代謝產(chǎn)物開(kāi)始積累[22]。本研究的最佳抑制率出現(xiàn)在對(duì)數(shù)期，且胞內(nèi)分泌物在抑制菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)3個(gè)方面均高于胞外分泌物，可能意味著這種抑菌物質(zhì)并非拮抗菌A的最終代謝產(chǎn)物。對(duì)數(shù)期抑菌物質(zhì)的合成有助于細(xì)菌提前占據(jù)優(yōu)勢(shì)，抑制枯萎病菌的發(fā)展。

植物抗病性反應(yīng)可以通過(guò)植物體內(nèi)活性氧酶的活性變化來(lái)反映，這些酶包括PPO、POD、PAL、超氧化物歧化酶（SOD）、β-1，3-葡聚糖酶等[23]。很多拮抗菌通過(guò)激活植物防御反應(yīng)，從而在植物中占領(lǐng)生存空間，這種機(jī)制提高了植物對(duì)于病原菌的抵御能力。枯草芽孢桿菌TR21可誘導(dǎo)香蕉防御反應(yīng)，枯草芽孢桿菌B29、解淀粉芽孢桿菌K103均可誘導(dǎo)黃瓜防御反應(yīng)[24-26]。并非所有拮抗菌都能引起植物的防御反應(yīng)。本研究測(cè)定了POD、PPO、PAL 3種酶在拮抗菌A處理棉花種子后的酶活變化情況，發(fā)現(xiàn)棉花播種40 d，共同用拮抗菌A和枯萎病菌處理組的PAL活性顯著提高，單獨(dú)用拮抗菌A或枯萎病菌處理的棉花PAL活性也與對(duì)照差異顯著，其他處理下PAL、POD 、PPO活性與對(duì)照差異不顯著?？梢酝茰y(cè)拮抗菌A并沒(méi)有引起棉花的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性，可見(jiàn)引起植物系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性并不是拮抗菌A的主要抑制途徑。

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