周鳴鳴++王順+++汪亞玲+++蔡洪玉+++李德全+++談蓉+++趙德兵+++俞晨+++豆長(zhǎng)明+++張潔

摘要：提取了鹽堿脅迫處理的玉米YQ7-96品系3葉1心期的葉莖混合組織總RNA，運(yùn)用SMART技術(shù)構(gòu)建pDNR-LIB載體的cDNA文庫(kù)，并隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行EST序列的BlastX比對(duì)和MIPS歸類(lèi)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在隨機(jī)挑取的2個(gè)4 000個(gè)cDNA克隆測(cè)序中，95.0%的EST符合分析要求（長(zhǎng)度大于150 bp，非rRNA），共獲得3 217條擁有BlastX注釋信息的EST序列，鹽堿脅迫的EST數(shù)據(jù)庫(kù)歸類(lèi)的比例信息比較接近。其中維持正常生理活動(dòng)占比分別為50.63%（鹽脅迫）和52.79%（堿脅迫），參與細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞防御和細(xì)胞循環(huán)和DNA代謝過(guò)程的基因分別為22.05%（鹽脅迫）、19.03%（堿脅迫），參與能量代謝和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因分別為15.77%（鹽脅迫）、15.36%（堿脅迫）。本研究構(gòu)建的鹽堿脅迫下玉米cDNA文庫(kù)及相關(guān)基因表達(dá)分析結(jié)果，為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：玉米；鹽脅迫；堿脅迫；EST；生理功能

中圖分類(lèi)號(hào)： S513.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0060-02

收稿日期：2015-03-25

基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（編號(hào)：12KJB310009）；農(nóng)業(yè)部南方平原玉米科學(xué)觀測(cè)站開(kāi)放課題基金（編號(hào)：NT201409）；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃（編號(hào)：1201023B）；南通大學(xué)校級(jí)課題（編號(hào)：2012002）；南通大學(xué)博士啟動(dòng)基金（編號(hào)：03080519、03080227）。

作者簡(jiǎn)介：周鳴鳴（1977—），男，江蘇南通人，博士，副教授，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究。E-mail：13912293932@163.com。

通信作者：張潔，博士，副教授，主要從事分子遺傳學(xué)研究。E-mail：zmm7711@163.com。

玉米（Zea mays L.）既是重要的糧食和飼料作物，又是重要的工業(yè)原料。目前我國(guó)是玉米生產(chǎn)第二大國(guó)，僅次于美國(guó)，但隨著玉米深加工等新興玉米工業(yè)的興起，市場(chǎng)上玉米供求的矛盾日益加劇，提高玉米的綜合生產(chǎn)力已經(jīng)成為一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。玉米是對(duì)鹽堿中度敏感的作物，只能在0.3% NaCl以下的土壤上生長(zhǎng)，這極大地限制了玉米在鹽堿灘地上的生長(zhǎng)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前世界上有100多個(gè)國(guó)家存在不同類(lèi)型的鹽堿地，面積達(dá)1億hm2，約占全球耕地面積的10%；其中我國(guó)有 0.26 億 hm2的鹽堿地[2]。在鹽堿地種植玉米會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，通過(guò)土壤改良等手段解決鹽堿地問(wèn)題進(jìn)展緩慢，迫切需要提高品種耐鹽堿程度。但玉米耐鹽堿種質(zhì)缺乏，采用常規(guī)育種方式選育高耐鹽堿玉米新品種十分困難。

鹽堿土是在特定自然環(huán)境和人為活動(dòng)因素綜合影響下，鹽類(lèi)直接參與土壤形成過(guò)程，并以鹽（堿）化過(guò)程為主導(dǎo)而形成的，具有鹽化層或堿化層，其中含有大量可溶鹽類(lèi)，從而抑制植物正常生長(zhǎng)的土壤。鹽堿土包括鹽土、堿土兩大類(lèi)型。鹽和堿脅迫同屬水分滲透脅迫，其主要的生理變化機(jī)制是一致的[3]。本研究分析了在正常和鹽、堿共脅迫下生長(zhǎng)的玉米品系YQ7-96在3葉1心期（苗期20 cm左右）的EST數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)其EST進(jìn)行了初步分析，旨在找出玉米主栽高產(chǎn)品種分子育種基因標(biāo)記探針。

1材料和方法

1.1材料

玉米品系YQ7-96。

1.2方法

1.2.1玉米處理和收集玉米種子催芽后待根長(zhǎng)2～3 cm時(shí)，點(diǎn)種于營(yíng)養(yǎng)盤(pán)中，Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，置于網(wǎng)室。處理組在3葉1心期，每盆澆5 L的含100 mmol/L混合鹽（50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Na2SO4） 的Hoagland液作為鹽脅迫處理組和25 mmol/L NaHCO3及 25 mmol/L Na2CO3 的Hoagland液（pH值11，水勢(shì)為-0.7 MPa） 作為堿共脅迫處理。處理7 d后，分別采集玉米的莖葉混合組織，立即用液氮冷凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2mRNA的純化參照文獻(xiàn)[4]提取RNA。采用FastTrack2.0 Kit （Invitrogen） 試劑盒，并按其操作說(shuō)明從總RNA中提取mRNA。

1.2.3EST文庫(kù)構(gòu)建用CreatorTM SMART cDNA Library Construction Kit（ CLONTEECH） 試劑盒并按操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3EST文庫(kù)克隆片段長(zhǎng)度篩選PCR 引物1（5′-AACAGCTATGACCATG-3′）；引物2（5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′），反應(yīng)條件：96 ℃變性10 min，94 ℃ 35 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min[4]。

1.2.4[JP3]EST序列分析與注釋同源性比較參數(shù)的得分（score）與匹配堿基數(shù)和同源性相關(guān)EST的組裝分析按照文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行，用http：//www.ncbinlm.nih.gov/blastX/和MIPS網(wǎng)站提供的各種生物信息學(xué)在線分析工具對(duì)EST進(jìn)行在線比對(duì)。

2結(jié)果與分析

2.1EST數(shù)據(jù)分析

對(duì)鹽和堿脅迫2個(gè)CDNA文庫(kù)各2 000個(gè)克隆進(jìn)行了的5′端測(cè)序。經(jīng)過(guò)校正，4 000條序列中符合要求的（測(cè)序中N的比例<5%，外源長(zhǎng)度>150 bp，且是非線粒體，非rRNA序列）共有3 802條EST序列，占總測(cè)序數(shù)量的 95.0%。符合要求的EST序列從文本格式轉(zhuǎn)換為通用的FASTA格式。再利用vector_screen軟件掃描去除有效序列載體上的序列，同時(shí)屏蔽序列上所有的Poly（A）。“清潔”后的序列進(jìn)行序列組裝分析，3 802條EST中有注釋信息的共有3 217條（84.6%），無(wú)注釋信息的共有585條（15.4%）（表1）。

2.2BlastX注釋

2個(gè)EST數(shù)據(jù)庫(kù)中，已有注釋信息的 3 217 條EST序列共產(chǎn)生2 167條被MIPS系統(tǒng)歸類(lèi)的信息（表2），其中參與新陳代謝、蛋白質(zhì)合成加工和亞細(xì)胞水平定位的基因所占比例最高，分別達(dá)到50.63%（鹽脅迫）和 52.79%（堿脅迫），這3類(lèi)基因表達(dá)的蛋白為維持正常生理活動(dòng)所必需；細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞防御、細(xì)胞循環(huán)和DNA代謝過(guò)程的基因所占比例也較高，分別為 22.05%（鹽脅迫）、19.03%（堿脅迫）。這部分基因的高豐度表達(dá)可能與玉米抗逆反應(yīng)有關(guān)，同時(shí)也表明植物抗逆反應(yīng)涉及到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；參與能量代謝和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因比例分別為 15.77%（鹽脅迫）、15.36%（堿脅迫）。參與細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化和細(xì)胞構(gòu)成組分相關(guān)的基因含量相對(duì)最低，2個(gè)EST數(shù)據(jù)庫(kù)各項(xiàng)均不超過(guò)2.1%；1.36%（鹽脅迫）和1.05%（堿脅迫）的雖有同源的蛋白，但是無(wú)法歸于以上的各類(lèi)。另外，鹽和堿脅迫的EST數(shù)據(jù)庫(kù)除了在蛋白合成和蛋白質(zhì)加工（折疊、修飾和定位）2項(xiàng)上占比差異較大，總體上被MIPS系統(tǒng)歸類(lèi)的比例信息是比較接近的。

3討論

植物應(yīng)對(duì)鹽堿脅迫是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，包括阻止新陳代謝過(guò)程、光合速率降低、生長(zhǎng)緩慢或停滯，提高或激發(fā)脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)、氧化酶活性的提高、ABA含量迅速增高、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他保護(hù)性物質(zhì)的積累、抑制能量消耗途徑等[5]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物能夠在適應(yīng)一種逆境的同時(shí)提高對(duì)其他逆境脅迫的抵抗力，此即植物的交叉適應(yīng)（cross-adaption）[6]。植物對(duì)逆境的交叉適應(yīng)具有普遍性，已有研究表明，植物對(duì)逆境的適應(yīng)可能存在共同的機(jī)制，鹽和堿脅迫同屬水分滲透脅迫，其主要的生理變化機(jī)制是與干旱脅迫存在相似的機(jī)理[7]，但抗脅迫的代謝途徑和相關(guān)基因也不盡相同[8]。玉米表達(dá)基因EST研究中，MGDP曾經(jīng)組織了24個(gè)單位和實(shí)驗(yàn)室，構(gòu)建了不同玉米品種、株系器官組織的24個(gè)不同的EST文庫(kù)，這些EST文庫(kù)大致可分為以下幾類(lèi)：正常生長(zhǎng)組織、鹽脅迫、突變株和病菌侵染組織的EST文庫(kù)，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)了大量新的表達(dá)基因（http：//www.zmdb.iastate.edu/zmdb/EST/libraries.html）。

如同其他植物一樣，玉米可能遭受的逆境多種多樣，且常常是多因子的綜合作用，其中干旱和鹽堿是影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)最大的非生物逆境脅迫因子。玉米在苗期的耐鹽堿性很重要，因?yàn)橹仓昝缙诘纳L(zhǎng)情況影響其最終的產(chǎn)量。本試驗(yàn)是在借鑒前人耐鹽堿性鑒定方法的基礎(chǔ)上對(duì)玉米耐鹽堿性鑒定的方法進(jìn)行研究。在玉米對(duì)鹽堿脅迫最敏感的3葉1心期進(jìn)行鹽堿脅迫處理7 d。因此，本研究構(gòu)建的是對(duì)鹽堿敏感的生長(zhǎng)關(guān)鍵時(shí)期3葉1心期混合組織的表達(dá)基因的EST數(shù)據(jù)庫(kù)，測(cè)序分析部分EST的信息表明該文庫(kù)中包含有大量（所分析EST中的52.00%）未知功能基因的EST。由于該文庫(kù)是鹽和堿脅迫處理下的玉米混合組織的表達(dá)基因EST文庫(kù)，包括了在玉米耐受鹽堿關(guān)鍵的生長(zhǎng)時(shí)期，在鹽和堿脅迫生長(zhǎng)條件下的所有特異表達(dá)基因，將會(huì)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)存的玉米EST數(shù)據(jù)起到補(bǔ)充作用。

在本試驗(yàn)過(guò)程中，玉米鹽堿處理濃度是獲得相關(guān)基因表達(dá)的重要因素，因此耐鹽堿性濃度的確定是構(gòu)建耐鹽堿性CDNA文庫(kù)的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)玉米耐鹽堿性鑒定還沒(méi)有形成統(tǒng)一的、權(quán)威的耐鹽堿鑒定濃度，大部分的研究者是根據(jù)自身的鑒定方法、處理溶液選取不同的鑒定濃度，而且在操作[CM（25]過(guò)程中的誤差或人為因素都有可能造成鑒定濃度的不同。[CM）]

所以，本試驗(yàn)中對(duì)耐鹽堿性鑒定濃度的篩選是很必要的。本研究最終確定的玉米苗期鹽性處理濃度為100 mmol/L，確定的玉米苗期堿處理濃度為35 mmol/L；劉芳等研究表明 250 mmol/L NaCl是玉米苗期耐鹽性篩選的理想濃度[9]，崔美燕的研究表明 25 mmol/L Na2CO3可以作為玉米苗期耐堿性鑒定的理想濃度[10]。本試驗(yàn)中使用的耐鹽堿脅迫濃度與其他人的研究存在一定差異，并使用較重的脅迫參數(shù)，這樣更有利于獲得相關(guān)的EST表達(dá)。此外，研究人員曾采用苗情評(píng)價(jià)的方法對(duì)玉米自交系幼苗進(jìn)行耐鹽堿性鑒定，根據(jù)鹽或堿脅迫處理7 d后苗情觀察來(lái)評(píng)價(jià)玉米材料的耐鹽堿性狀，非常直觀、簡(jiǎn)單[10-11]。本試驗(yàn)中也是收集7 d的玉米混合組織作為抽提RNA的材料。

本研究提取處理玉米品系YQ7-96的3葉1心期的莖葉混合組織的總RNA，運(yùn)用SMART技術(shù)構(gòu)建pDNR-LIB載體的cDNA文庫(kù)，在成功構(gòu)建了鹽和堿脅迫的玉米cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)上，對(duì)產(chǎn)生的EST進(jìn)行了測(cè)序和分析歸類(lèi)，篩選出細(xì)胞功能相關(guān)EST，為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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