陳露 楊立明 羅玉明

摘要：ICE是植物體內(nèi)的一類bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在植物低溫脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究利用來自不同物種包括苔蘚、蕨類、裸子、被子植物的ICE蛋白序列，用Clustal X程序?qū)ζ浒被嵝蛄羞M(jìn)行比對，并用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步了解ICE家族在植物界的分子進(jìn)化情況。結(jié)果表明，ICE蛋白家族基本上按苔蘚、蕨類、裸子、單子葉和雙子葉植物而分別聚類，盡管不同來源的ICE序列有一定差異，但HLH結(jié)構(gòu)域在各植物物種中具有很好的保守性，這說明ICE蛋白在進(jìn)化上具有保守性；被子植物的ICE形成不同的分支，單子葉植物和雙子葉植物原始的ICE蛋白有可能不同。

關(guān)鍵詞：植物；ICE；序列比對；系統(tǒng)進(jìn)化分析

中圖分類號： Q943.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0042-06

收稿日期：2015-02-27

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（編號：2013AA102705）；國家自然科學(xué)基金（編號：30900871）；江蘇省自然科學(xué)基金（編號：（BK2011409）。

作者簡介：陳露（1989—），女，江蘇靖江人，碩士研究生，從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：chenlu1201@163.com。

通信作者：羅玉明（1963—），男，江蘇漣水人，教授，研究生導(dǎo)師，主要從事植物生物技術(shù)研究。Tel：（0517）83525128；E-mail：yumingluo@163.com。

ICE（inducer of CBF expression）是CBF[C-repeat-binding factors，又稱DREBs（dehybration responsive element factors）]冷響應(yīng)通道的上游調(diào)控因子，目前主要在擬南芥中發(fā)現(xiàn)[WTBX][STBX]ICE1和ICE2[WTBZ][STBZ]這2種ICE基因。ICE一般為組成型表達(dá)，常溫下沒有活性，低溫誘導(dǎo)可使[WTBX][STBX]ICE1[WTBZ][STBZ]成活性狀態(tài)，編碼一個類似MYC的螺旋-環(huán)-螺旋型（bHLH）轉(zhuǎn)錄激活因子，誘導(dǎo)CBF基因的表達(dá)，從而提高植物的抗寒性，在轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育過程中沒有異常表現(xiàn)[1]。研究表明，ICE2可以直接影響[WTBX][STBX]CBF1[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)，將[WTBX][STBX]ICE2[WTBZ][STBZ]基因轉(zhuǎn)入擬南芥發(fā)現(xiàn)，擬南芥體內(nèi)[WTBX][STBX]CBF1[WTBZ][STBZ]基因表達(dá)量明顯上升，轉(zhuǎn)基因擬南芥可在-20 ℃環(huán)境下正常生長[2-3]。由此可見，ICE在植物低溫抗性中有著重要的作用。有研究證明，ICE1-CBF轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)在植物響應(yīng)低溫脅迫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。

目前，依賴CBF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被視為植物低溫脅迫應(yīng)答的主要途徑[4-7]。在ICE1-CBF的調(diào)控路徑中，ICE1在低溫誘導(dǎo)下與CBF3啟動子順式作用元件相互結(jié)合，并激活CBF3轉(zhuǎn)錄，調(diào)控CBF及下游抗冷相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，也可以與R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB15相互作用，負(fù)調(diào)控CBF基因的表達(dá)[2，8]。ICE1蛋白的磷酸化可能涉及到低溫脅迫過程中ICE1的活性調(diào)控。另外，HOS1編碼一種E3連接酶，參與ICE1蛋白的泛素化降解，在低溫脅迫過程中，HOS1與ICE1相互作用并降解ICE1，通過ICE1調(diào)節(jié)CBF的轉(zhuǎn)錄。有研究表明，ICE1蛋白在冷脅迫時明顯降解，而在HOS1突變體中，ICE1蛋白受冷脅迫降解的程度明顯降低[9-10]。

鑒于ICE在植物低溫抗性中的重要作用，本研究通過對來源于植物的ICE蛋白進(jìn)行同源比對，分析系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，擬找出ICE基因在植物界的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為研究該基因的功能進(jìn)化提供參考。

1材料與方法

1.1序列信息的獲取與篩選

為獲得ICE家族的各成員，分別以擬南芥ICE基因的蛋白質(zhì)序列AtICE1、AtICE2，使用Blastp程序搜索綠色植物數(shù)據(jù)（http：//blast.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），database選擇為non-redundant protein sequences （nr），organism選擇為plants（taxid：3193），max target sequences設(shè)置為250，其余均為默認(rèn)參數(shù)。對獲得的搜索結(jié)果用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）進(jìn)行分析，把具有與擬南芥ICE基本結(jié)構(gòu)特征的序列保留下來做后續(xù)分析。

1.2多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

以氨基酸全序列比對結(jié)果為基礎(chǔ)，用Mega 5.10軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[11]。采用Neighbor-joining法運(yùn)行相應(yīng)參數(shù)[12]：Poisson model模式，缺口設(shè)置為Pairwise deletion；校驗參數(shù)為bootstrap=1 000。系統(tǒng)發(fā)生樹中，ICE家族各亞族的分組是在相似理論和分類學(xué)基礎(chǔ)上完成，并用Clustal X軟件[13]進(jìn)行檢驗。

1.3模體識別

使用MEME模體搜索工具以識別ICE家族相關(guān)蛋白質(zhì)所共有的模體，并對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行修改，將可找到的模體最大值調(diào)整為25，每個模體的最大寬度調(diào)整為100，其他均為默認(rèn)值；MEME在線軟件識別的模體通過Smart和Pfam模體識別工具[14-15]進(jìn)行進(jìn)一步檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1植物ICE基因的鑒定

利用模式植物擬南芥中已測序的2個ICE蛋白基因序列，執(zhí)行Blastp搜索、關(guān)鍵詞搜索、結(jié)構(gòu)域搜索等，以在植物中獲得更多的ICE基因；將得到的初始目標(biāo)序列經(jīng)過整理、合并、篩選，通過Mega 5.10軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行逐一比對分析，去除不符合條件的序列，最終確定33個植物（表1）基因組中的65個ICE蛋白質(zhì)基因（表2）用于分析，其中包括擬南芥2個模板ICE蛋白基因。按照從低等植物到高等植物的順序依次為：2條來自苔蘚植物，即蘚綱的小立碗蘚；2條來自蕨類植物，即石松綱的江南卷柏；1條來自裸子植物，即松柏綱的北美云杉；21條來自單子葉植物的禾本科和芭蕉科，包括山羊草、小麥、烏拉爾圖小麥、水稻、二穗短柄草、大麥、玉米、芭蕉共8種植物；39條來自雙子葉植物，包括芥菜、歐洲油菜、蓖麻、大白菜、山崳菜、板藍(lán)根、薺菜、擬南芥、蘿卜、白刺、桉樹、藍(lán)桉樹、葡萄、鷹嘴豆、大豆、野茶樹、番茄、黃瓜、野草莓、榛子、甜楊、毛果楊共22種植物。

2.2序列特異性分析

由圖1可見，65個ICE蛋白質(zhì)基因中，有63、63、61、62、63個基因分別包含模體1、模體2、模體3、模體5和模體6；基因GmICE5、GmICE1-like2缺失模體1，基因GmICE5、GmICE6缺失模體2，基因GmICE5、GmICE6、HvICE2-3、PsiICE1缺失模體3，基因GmICE5、MuICE1-3、MuICE1-1缺失模體5，PpICE1、PpICE2缺失模體6。利用NCBI中Blastp對65個植物的ICE氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域搜索，結(jié)合MEME做出蛋白序列25個模體（表3）中的模體2、模體3序列進(jìn)行分析，并用Smart和Pfam進(jìn)行檢驗，結(jié)果表明，不同來源的ICE氨基酸序列有一定的差異，但仍有一個保守結(jié)構(gòu)域HLH存在，HLH是ICE氨基酸序列的功能區(qū)域，包含3個功能位點(diǎn)，分別為DNA結(jié)合區(qū)域（核酸結(jié)合位點(diǎn)）、E-box （5-CANNTG-3）/N-box （5-CACGC/AG-3）的特異性位點(diǎn)、二聚接口（多肽結(jié)合位點(diǎn)）。

2.3植物ICE基因家族的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

由圖2可見，ICE蛋白家族基本按苔蘚、蕨類、裸子、單子葉和雙子葉植物而分別聚類，說明該基因在進(jìn)化上具有保守性；大部分允許ICE蛋白亞族分離的節(jié)點(diǎn)，自展值都比較??；自上往下，將ICE家族分為4個亞組，分別被稱為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、

Ⅳ，其中第Ⅰ大亞組包含所有雙子葉植物，第Ⅱ大亞組全部為單子葉植物，第Ⅲ大亞組可分為2個小亞組A、B，其中，小亞組A全部為單子葉植物，小亞組B為裸子植物，第Ⅳ大亞組可分為2個小亞組C、D，其中，小亞組C為蕨類植物，小亞組D為苔蘚類植物；Ⅲ和Ⅳ位于系統(tǒng)發(fā)生樹的基部，其在進(jìn)化地位上是最原始的類型。

3結(jié)論

對植物ICE蛋白基因家族進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，盡管不同來源的ICE序列表現(xiàn)出一定的差異，但HLH結(jié)構(gòu)域在各植物物種中都有很好的保守性，這說明該基因在進(jìn)化上具有保守性。對雙子葉植物來說，大多數(shù)同源基因聚類到一起，如 BrICE1-1 和BrICE1-2，VvICE1-1和VvICE1-2，GmICE5、GmICE6、GmICE1-like1、GmICE2、GmICE1、GmICEb、GmICE4和GmICEd，GmICE1-like2和GmICE3，CsiICE1和CsiICE2，PsuICE1和 PsuICE1；對單子葉植物、蕨類植物、苔蘚植物來說，也發(fā)生同樣的現(xiàn)象。這說明植物ICE蛋白基因家族的進(jìn)化模式， 應(yīng)歸因于物種特定的擴(kuò)張，也可以說，植物進(jìn)化歷程

中，細(xì)胞擴(kuò)增過程中的基因復(fù)制及細(xì)胞分化是ICE蛋白基因家族的主要進(jìn)化模式。因此，進(jìn)化樹分支末端的基因可能是代表最近復(fù)制過程中突變的基因[16]，這為物種特定擴(kuò)張學(xué)說提供了有力支持。同時，研究發(fā)現(xiàn)，被子植物中的ICE基因形成不同的分支，這表明單子葉植物和雙子葉植物可能有不同的原始ICE蛋白基因。

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