江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院, 鎮(zhèn)江 212013

高惡斌*, 董一鳴

噬藻體遺傳多樣性及其分子生態(tài)學(xué)研究現(xiàn)狀與展望

江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院, 鎮(zhèn)江 212013

高惡斌*, 董一鳴

高惡斌, 董一鳴. 噬藻體遺傳多樣性及其分子生態(tài)學(xué)研究現(xiàn)狀與展望[J]. 生態(tài)科學(xué), 2016, 35(2): 166-173.

GAO Ebin, DONG Yiming. Advances in researches on cyanophage genetic diversity and molecular ecology[J]. Ecological Science, 2016, 35(2): 166-173.

噬藻體是水體微生物群落中的重要活性成分, 廣泛存在于海洋及淡水環(huán)境中, 對(duì)藍(lán)藻種群結(jié)構(gòu)與多樣性以及水生態(tài)環(huán)境具有重要影響。開展水環(huán)境中噬藻體遺傳多樣性研究將有助于噬藻體資源的開發(fā)與利用。從分子生態(tài)學(xué)角度, 論文對(duì)噬藻體遺傳多樣性研究的分子基礎(chǔ)與分子標(biāo)記等進(jìn)行了綜述, 并簡要概述了相關(guān)研究方法的基本概念及其應(yīng)用狀況。從分子生態(tài)學(xué)與噬藻體多樣性研究相結(jié)合的層面, 對(duì)該領(lǐng)域的未來研究進(jìn)行展望。

噬藻體; 輔助代謝基因; 遺傳多樣性; 分子生態(tài)學(xué); 藍(lán)藻

1 前言

噬藻體是侵染藍(lán)藻的病毒, 雖然個(gè)體極其微小, 但數(shù)量巨大, 是水體微生物群落中重要的活性成分[1–2]。它們廣泛分布于全球各種天然水體中, 具有豐富的遺傳多樣性[3]。在水生態(tài)系統(tǒng)中, 噬藻體與宿主藍(lán)藻相互作用, 可調(diào)控藍(lán)藻種群結(jié)構(gòu)與多樣性、參與生物地球化學(xué)循環(huán)以及介導(dǎo)微生物之間水平基因轉(zhuǎn)移[4–6], 尤其是為預(yù)防藍(lán)藻水華提供了新的途徑[7]。如今, 噬藻體被看成是一種不可忽視的戰(zhàn)略資源[1], 倍受國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注, 并成為病毒學(xué)與生態(tài)學(xué)研究相互滲透而成的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

由于傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)技術(shù)的限制, 自然水環(huán)境中大多數(shù)噬藻體都是處于未純培養(yǎng)的狀態(tài), 難以全面地認(rèn)識(shí)噬藻體多樣性及其生態(tài)作用。近年來有關(guān)海洋及淡水環(huán)境中噬藻體的研究大多是從分子生態(tài)學(xué)的角度出發(fā), 對(duì)噬藻體群落結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性進(jìn)行研究。分子生態(tài)學(xué)作為一門新興學(xué)科, 將分子生物學(xué)方法與生態(tài)學(xué)理念有機(jī)結(jié)合, 為噬藻體多樣性研究提供了新的方法, 有助于深化人們對(duì)于噬藻體生物資源及其生態(tài)功能的認(rèn)識(shí)。本文從分子生態(tài)學(xué)的角度, 結(jié)合分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù), 對(duì)噬藻體多樣性研究進(jìn)行綜述與展望, 旨在為開發(fā)利用噬藻體生物資源提供參考。

2 噬藻體遺傳多樣性的分子基礎(chǔ)

噬藻體是地球生物圈內(nèi)一類古老的微生物, 在長期的進(jìn)化過程中, 為逃避宿主免疫系統(tǒng)或提高自身生態(tài)適應(yīng)性, 以不同方式如基因交換重組不斷獲取部分外源DNA片段。這些獲得的外源核酸物質(zhì)不僅使得噬藻體自身遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 而且為豐富噬藻體遺傳多樣性提供了分子基礎(chǔ)。由于物種種內(nèi)個(gè)體之間的遺傳結(jié)構(gòu)差異程度是其遺傳多樣性的重要表現(xiàn), 因此, 測(cè)定噬藻體基因組序列并分析其結(jié)構(gòu)特征與基因組成, 可獲得噬藻體生物學(xué)功能及其遺傳多樣性的相關(guān)數(shù)據(jù)。隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展, 一系列海洋噬藻體基因組序列被測(cè)定[8–14],為深入開展噬藻體生態(tài)學(xué)特性、親緣關(guān)系及分類等相關(guān)研究提供了重要的遺傳信息。Chen等[8]通過測(cè)定海洋短尾噬藻體P60基因組序列并分析其序列特征, 發(fā)現(xiàn)了短尾病毒科噬藻體DNA復(fù)制系統(tǒng)比肌病毒科和長尾病毒科噬藻體要保守的多, 且將DNA復(fù)制系統(tǒng)作為裂性噬藻體的判斷標(biāo)準(zhǔn), 在分子水平上證實(shí)P60是一種裂性噬藻體。Weigele等[9]發(fā)現(xiàn)T4噬藻體Syn9基因組具有不同于T4噬菌體的DNA復(fù)制模式, 而且Syn9可利用同源蛋白組裝成與噬菌體 SP01和皰疹病毒有相同拓?fù)鋵W(xué)特征的衣殼整體結(jié)構(gòu)。對(duì)長尾噬藻體 P-SS2測(cè)序結(jié)果顯示, 基因組中含有int,bet,exo和一個(gè)53bp的結(jié)合位點(diǎn)等遺傳機(jī)制, 由此推測(cè)噬藻體 P-SS2可能長期與宿主進(jìn)行基因片段整合[10]。近年來, 不少研究對(duì)淡水噬藻體基因組進(jìn)行了一些相關(guān)報(bào)道[15–20], 并獲得了有關(guān)淡水噬藻體基因組特征及其多樣性的遺傳信息。日本學(xué)者 Yoshida等[15]首次詳細(xì)報(bào)道感染銅綠微囊藻的肌尾噬藻體Ma-LMM01基因組, 該噬藻體基因組中含有位點(diǎn)特異重組酶(site-specific recombinase)、抗阻遏物激活因子(antirepressors)以及與宿主高度同源的轉(zhuǎn)坐酶等有關(guān)的編碼基因, 表明Ma-LMM01基因不僅可整合到宿主基因組內(nèi), 而且還可能與其宿主發(fā)生基因傳遞。在國內(nèi)噬藻體研究方面, 劉新堯等[16–17]先后測(cè)定了兩株感染相同宿主藍(lán)藻的短尾噬藻體Pf-WMP4和Pf-WMP3基因組序列, 盡管它們基因組特征差異明顯, 但卻有相同的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)蛋白 SDS-PAGE條帶及氨基酸序列和右臂基因結(jié)構(gòu)。黃思軍等[18]測(cè)定了四株長尾噬藻體 S-CBS1, S-CBS2, S-CBS3, S-CBS4基因組序列, 并與海洋長尾噬藻體 P-SS2進(jìn)行比較分析, 揭示了長尾噬藻體具有顯著的遺傳多樣性。2012年, 高惡斌等[24]完成一株無尾噬藻體 PaV-LD的測(cè)序, 在基因水平證實(shí)了該噬藻體缺少尾部相關(guān)基因, 表明了自然環(huán)境中噬藻體形態(tài)豐富多樣。

研究表明, 噬藻體與宿主藍(lán)藻之間的水平基因轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致噬藻體遺傳多樣性的一個(gè)重要原因[28]。通過對(duì)已測(cè)序噬藻體基因組序列分析, 研究人員發(fā)現(xiàn)大多數(shù)噬藻體攜帶一些與宿主藍(lán)藻具有高度相似的代謝相關(guān)基因序列[8–15,19–20 ]。這些代謝相關(guān)的基因被看成是噬藻體特有基因, 僅存在噬藻體基因組中, 而噬菌體或其它病毒基因組從未發(fā)現(xiàn)。這些代謝相關(guān)的基因序列可能是通過噬藻體與宿主之間的遺傳物質(zhì)交換而獲得, 與宿主藍(lán)藻的新陳代謝和生命循環(huán)有著密切的聯(lián)系[18,26]。2005年, Sullivan等[13]測(cè)定了3株海洋噬藻體P-SSP7、P-SSM2和P-SSM4基因組序列, 分別發(fā)現(xiàn)它們7%、11%、12%的基因組序列編碼與藍(lán)藻基因高度同源的序列, 如光合系統(tǒng)II核心蛋白D1、D2(psbA、psbD), 強(qiáng)光誘導(dǎo)蛋白(hli),質(zhì)體藍(lán)素蛋白(petE), 鐵氧化還原蛋白(petF), 藻膽紅素合成酶(pebA), 血紅素氧合酶(ho1), 聚胺合成酶(speD), 藻膽藍(lán)素:鐵氧還蛋白氧化還原酶(pcyA),以及轉(zhuǎn)醛醇酶基因(talC)等, 其中噬藻體P-SSM2和P-SSM4還含有磷酸鹽誘導(dǎo)基因(phoH,pstS)和催化維生素B12合成蛋白基因(cobS)。2010年, Sullivan等[25]對(duì)16株肌尾海洋噬藻體基因組序列進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)25個(gè)噬藻體特有基因, 包括之前報(bào)道過的光合作用相關(guān)基因、磷壓力誘導(dǎo)基因以及氮代謝有關(guān)的核心基因。在淡水噬藻體基因組序列中, 研究人員還找到了可降解藍(lán)藻藻膽蛋白體光捕復(fù)合物的nblA必需基因[15,19–20]。這些代謝相關(guān)基因一方面可能與噬藻體適應(yīng)特殊的生態(tài)環(huán)境與宿主生理狀況有關(guān),另一方面它們改變了噬藻體基因組結(jié)構(gòu)與組成, 是導(dǎo)致噬藻體遺傳多樣性的重要因素之一[28]。

3 噬藻體遺傳多樣性的分子標(biāo)記

噬藻體在形態(tài)上屬于有尾DNA病毒科成員, 包括肌尾噬藻體、短尾噬藻體及長尾噬藻體, 在各種水域廣泛分布, 且豐度極高。它們?nèi)鄙俳y(tǒng)一的保守序列, 在遺傳多樣性研究方面還存在一定的局限性,因而選擇適合的靶基因成為噬藻體分子生態(tài)學(xué)研究的關(guān)鍵。目前對(duì)水體中噬藻體多樣性的認(rèn)識(shí)主要基于DNA聚合酶、結(jié)構(gòu)蛋白以及部分輔助代謝基因(AMGs)等遺傳標(biāo)記的基因多樣性研究。

3.1 結(jié)構(gòu)蛋白基因

通常, 某些編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因在特定噬藻體種群中具有高度保守性[29–30], 被作為靶標(biāo)基因用于研究噬藻體種群結(jié)構(gòu)、遺傳差異與多樣性。Fuller 等[29]在海洋肌尾科噬藻體中發(fā)現(xiàn)了一段編碼結(jié)構(gòu)蛋白基因g20的保守序列, 并根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)出了一系列的引物, 自此開始了在分子生物學(xué)水平上對(duì)噬藻體遺傳多樣性的研究。目前, g20基因已成功被用于各種海洋、湖泊及稻田等水體中的噬藻體遺傳多樣性研究[22,31–35], 并獲得了大量的研究數(shù)據(jù)。其分析結(jié)果顯示, 水體中噬藻體的遺傳多樣性相當(dāng)豐富, 且不同水體之間噬藻體遺傳多樣性差異非常明顯。Zhong等[34]利用g20基因?qū)涌诤凸褷I養(yǎng)海域的噬藻體進(jìn)行遺傳多樣性的研究, 共得到了114個(gè)噬藻體g20基因的系統(tǒng)分類單元(OTUs), 其中噬藻體遺傳多樣性最豐富的1個(gè)水體樣本中得到了29個(gè)OTUs。通過對(duì)這114個(gè)噬藻體g20基因的OTUs之間以及同已獲得純培養(yǎng)的噬藻體的g20序列進(jìn)行親緣關(guān)系的比較分析, 建立了9個(gè)海洋肌尾科噬藻體序列簇。Dorigo等[36]采用克隆及PCR-DGGE 技術(shù)從法國最大的自然湖-泊布爾熱湖得到47條噬藻體g20序列, 得到了35種不同的噬藻體基因型, 并將它們分為7個(gè)分類單元(OTUs), 系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)一些OTUs與海洋的噬藻體序列具有同源性, 而一部分OTUs僅分布于淡水湖泊環(huán)境中。Jiang等[22]等調(diào)查研究了我國稻田水體中噬藻體g20基因多樣性及其分布規(guī)律, 發(fā)現(xiàn)水體存在3個(gè)新的g20基因類群, 并采用UniFrac方法分析噬藻體g20基因群集發(fā)現(xiàn), 噬藻體群落結(jié)構(gòu)在海洋、湖泊及稻田環(huán)境中存在顯著的差異, 而且在不相同的稻田水體環(huán)境中噬藻體群落結(jié)構(gòu)也不同。Butina等[21]利用g20基因序列片段研究貝加爾湖海綿噬藻體群落特征, 揭示了貝加爾湖海綿具有其特有的、且明顯不同于貝加爾湖的噬藻體群落結(jié)構(gòu)與組成。

除結(jié)構(gòu)蛋白基因g20外, 主要衣殼蛋白基因g23在肌尾病毒科噬藻體中同樣具有高度保守性[37,38]。Butina等[39]采用g23基因研究貝加爾湖水樣中噬藻體多樣性, 發(fā)現(xiàn)該湖中g(shù)23基因的多樣性極其豐富,并進(jìn)行了分類, 結(jié)果表明幾乎所有g(shù)23序列與海洋和稻田環(huán)境中的T4噬藻體及未知病毒高度相似。López-Bueno等[40]在南極一個(gè)淡水湖中檢出多種g23基因, 結(jié)果同源性較低, 其編碼氨基酸的序列與大多數(shù)已知同類基因的序列相似性低于80%。此外, Kimura等[41]采用噬藻體尾鞘基因(g91)揭示了微囊藻噬藻體在環(huán)境中具有極其豐富的遺傳多樣性, 并推測(cè)淡水環(huán)境內(nèi)的噬藻體類群明顯不同于海洋環(huán)境中的噬藻體類群。

3.2 DNA聚合酶

DNA聚合酶是DNA復(fù)制所需的一種生化酶, 在短尾噬藻體基因組中具有一定的保守性, 成為短尾噬藻體多樣性及其親緣關(guān)系研究的主要分子標(biāo)記。Labonte和Chan等[42–43]先后從肌尾和短尾病毒科的噬藻體中鑒定了DNA聚合酶基因和線粒體DNA聚合酶基因, 并發(fā)現(xiàn)加拿大喬治亞灣及墨西哥東北部灣的短尾科噬藻體分布非常廣泛, 且具有豐富的遺傳多樣性。Chen等[44]根據(jù)海洋短尾科噬藻體DNA聚合酶基因序列設(shè)計(jì)兼并引物, 對(duì)美國切薩皮克海灣夏、冬兩季表層、中層及底層水中的短尾噬藻體的多樣性進(jìn)行研究, 揭示該海域短尾噬藻體相當(dāng)豐富,且其種群結(jié)構(gòu)及多樣性呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性變化。黃思軍等[45]利用DNA聚合酶基因序列對(duì)世界多處采集病毒樣品進(jìn)行擴(kuò)增, 揭示了全球海洋中短尾噬藻體的廣泛分布。最近, Wang等[46]采用DNA聚合酶基因研究了我國武漢東湖短尾噬藻體的遺傳多樣性及其動(dòng)態(tài)變化, 并根據(jù)DNA聚合酶基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析, 發(fā)現(xiàn)該湖泊內(nèi)大部分短尾噬藻體與海洋短尾噬藻體具有較近的親緣關(guān)系。

3.3 輔助代謝基因(AMGs)

近年來, 噬藻體輔助代謝基因AMGs被作為成為一種輔助方法, 用于研究噬藻體遺傳多樣性及其在進(jìn)化過程中與藍(lán)藻之間的相互關(guān)系。它們是噬藻體編碼的一類特殊功能基因, 且不屬于某一特定形態(tài)噬藻體, 將其作為噬藻體檢測(cè)的分子標(biāo)記, 不僅有助于全面認(rèn)識(shí)環(huán)境中噬藻體種群結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性, 而且有助于了解噬藻體的感染復(fù)制機(jī)制及其與水華藍(lán)藻生理狀況的密切聯(lián)系。目前, 被作為標(biāo)靶基因的輔助代謝基因, 主要包括光合作用基因(psbA/psbD)、焦磷核苷酸水解酶基因(mazG)及磷酸鹽誘導(dǎo)基因(phoH)等。光合作用基因psbA、psbD分別編碼光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的的D1和D2蛋白, 是宿主光調(diào)控的關(guān)鍵基因[47], 其序列具有一定的保守性。Sullivan等[13]利用光合基因psbA對(duì)海洋及淡水噬藻體的遺傳多樣性進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)海洋噬藻體具有不同于淡水噬藻體的進(jìn)化過程, 而且同一地理區(qū)域的噬藻體psbA基因結(jié)構(gòu)也存有差異。Che′nard等[48]根據(jù)psbA基因序列對(duì)海洋及淡水噬藻體的遺傳多樣性進(jìn)行研究, 并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹, 結(jié)果也表明海洋噬藻體具有不同于淡水噬藻體的進(jìn)化歷程。此外,他們還發(fā)現(xiàn)噬藻體psbA基因與藍(lán)藻psbA基因同屬一進(jìn)化枝, 由此推測(cè)噬藻體攜帶的光合基因可能來源其宿主。Bryan等[49]利用焦磷核苷酸水解酶基因(mazG)揭示了噬藻體呈全球性分布, 并根據(jù)mazG基因構(gòu)建了噬藻體與其宿主藍(lán)藻的進(jìn)化發(fā)育樹, 推測(cè)噬藻體的mazG基因可能不是從其宿主中獲得。Goldsmith等[50]采用磷酸鹽誘導(dǎo)基因phoH作為分子標(biāo)記用于海洋病毒多樣性分析, 發(fā)現(xiàn)phoH基因具有豐富的序列多樣性, 而且大多數(shù)序列與已知序列不同。此外, 他們還發(fā)現(xiàn)海洋病毒似乎依據(jù)它們宿主的不同營養(yǎng)方式進(jìn)行相似聚類, 其中噬藻體具有獨(dú)立的系統(tǒng)進(jìn)化枝, 明顯有別于海洋噬菌體及藻病毒。

4 噬藻體遺傳多樣性的分子方法

噬藻體在自然環(huán)境中的種群組成及時(shí)空分布是噬藻體分子生態(tài)學(xué)研究的重要內(nèi)容。由于傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)與鑒定方法在環(huán)境樣品中應(yīng)用效率低, 容易丟失一些重要的遺傳類型, 對(duì)現(xiàn)場(chǎng)樣品的原位(in situ)研究存在很大的局限性。分子方法相對(duì)準(zhǔn)確且快速,并克服了傳統(tǒng)方法應(yīng)用上的不足, 為研究噬藻體多樣性、時(shí)空分布及其與環(huán)境因子動(dòng)態(tài)變化的關(guān)系提供了新的檢測(cè)手段。目前已被用于研究噬藻體多樣性的分子生態(tài)學(xué)方法主要包括: 克隆文庫(Cloning library)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis)、DNA指紋圖譜(DNA Fingerprinting)、宏基因組文庫(Metagenomics library)等。

4.1 克隆文庫

克隆文庫分析方法是首先從環(huán)境樣品中提取出浮游病毒基因組總DNA, 利用針對(duì)病毒的標(biāo)記基因序列設(shè)計(jì)通用引物對(duì)樣品總 DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 將PCR產(chǎn)物與合適的克隆載體連接, 并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞, 得到大量含有不同標(biāo)記基因序列的轉(zhuǎn)化子,然后對(duì)這些轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因序列采用測(cè)序技術(shù)或PCR/RFLP進(jìn)行定性分析。通過針對(duì)g20基因序列并構(gòu)建克隆文庫, 研究發(fā)現(xiàn)河口與開放海域間藍(lán)藻病毒種類組成及結(jié)構(gòu)完全不同, 同一位點(diǎn)處不同深度差異也很大[34]。Wilhelm等[31]依據(jù)g20基因序列構(gòu)建加拿大 Laurentian湖中聚球藻噬藻體的克隆文庫, 分析發(fā)現(xiàn)噬藻體廣泛分布于該湖的東、中和西部, 而且淡水噬藻體與海洋噬藻體的遺傳多樣性有很大的相關(guān)性, 但是又各成一支, 推測(cè)其原因是與它們感染的藍(lán)藻宿主有關(guān)。根據(jù)克隆文庫分析結(jié)果, Labonté等[42]發(fā)現(xiàn)加拿大喬治亞灣及墨西哥東北部灣的短尾科病毒分布非常廣泛, Che′nard等[48]發(fā)現(xiàn)海洋噬藻體具有不同于淡水噬藻體的進(jìn)化過程, 且推測(cè)噬藻體攜帶的光合基因來源其宿主。

4.2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)是一項(xiàng)借助于有規(guī)律地改變電場(chǎng)方向而使大分子 DNA得以分離的電泳技術(shù), 被廣泛應(yīng)用于所有的生物基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究。由于該技術(shù)具有重復(fù)性好、分辨力強(qiáng)、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn), 結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定, 不受表型形狀干擾,被認(rèn)為是進(jìn)行分子生物學(xué)分型的可信方法之一, 為確定同種生物之間的親緣關(guān)系提供了可靠的技術(shù)支持。目前, PFGE技術(shù)已廣泛用于研究不同水體中病毒基因組的大小、豐度及不同基因組大小病毒與環(huán)境因素間的相互關(guān)系。Sandaa與Larsen利用PFGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)挪威海岸水域中的病毒群落多樣性十分豐富[51], 并呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性動(dòng)態(tài)變化。劉艷鳴等[52]采用PFGE揭示中國武漢東湖存在5種不同大小的病毒基因組, 大小范圍在15～300kb之間, 并證實(shí)了噬菌體和噬藻體是構(gòu)成東湖中浮游病毒群落的優(yōu)勢(shì)類群。為了探索自然環(huán)境中噬藻體光合作用基因及其多樣性, Sandaa等[53]采用噬藻體光合作用基因引物進(jìn)行PCR檢測(cè), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFGE分離的病毒中多數(shù)都含有psbA和psbD, 兩類病毒只含有psbA, 一類病毒只含有psbD。

4.3 DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜是用PCR擴(kuò)增浮游病毒樣品總DNA的標(biāo)記基因序列, 然后用合適的電泳技術(shù)將其分離而成的具有特定條帶特征的圖譜。DNA指紋模式的不同就反映種群結(jié)構(gòu)的不同。按分離依據(jù)不同, DNA指紋圖譜可分為限制性酶切片段長度多態(tài)性圖譜(RFLP)、末端限制性片段長度多態(tài)性圖譜(T-RLFP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA圖譜(RAPD)和變性梯度凝膠電泳圖譜(DGGE)。Marston等[54]利用RFLP技術(shù)研究美國羅德洲近海海域噬藻體遺傳多樣性時(shí), 鑒定了36種不同肌尾噬藻體的g20基因型, 而推測(cè)短尾噬藻體與長尾噬藻體是該海域內(nèi)噬藻體種群的主要成員。Winget等[55]采用RAPD-PCR評(píng)估Chesapeake海灣中噬藻體群落的豐富度動(dòng)態(tài)變化, 揭示了噬藻體多樣性的時(shí)間變化要比空間變化更加明顯。Wilson 等[56]針對(duì)DNA多聚酶基因片段, 采用PCR-DGGE技術(shù)揭示了?？颂m群島到英聯(lián)合王國的大西洋橫斷面噬藻體的遺傳多樣性及結(jié)構(gòu)組成與水體分層密切相關(guān)。

4.4 宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)研究的基本思路是直接提取環(huán)境中特定微生物群落的基因組總DNA, 克隆到合適的載體, 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞, 形成一個(gè)高度復(fù)雜的重組DNA文庫, 從文庫中獲得相關(guān)基因, 避免了傳統(tǒng)微生物學(xué)基于分離培養(yǎng)研究的限制。宏基因組學(xué)不僅可以提供自然環(huán)境中浮游病毒的群落結(jié)構(gòu)及多樣性數(shù)據(jù), 而且可以提供一些潛在的病毒種群結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。Sharon等[57–58]通過比較分析環(huán)境病毒宏基因組文庫序列, 獲得一系列與光合系統(tǒng)I(PSI)相關(guān)的基因序列,并揭示了光合系統(tǒng)基因在噬藻體中普遍存在。Ma等[23]利用宏基因組技術(shù)研究了近海水域噬藻體的多樣性及其基因組動(dòng)態(tài)變化, 并依據(jù)T4噬菌體核心基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 揭示海洋中未知噬藻體的多樣性非常豐富。Hevroni等[24]利用宏基因組結(jié)合PCR的方法對(duì)太平洋噬藻體光合基因的多樣性進(jìn)行研究, 揭示了光合系統(tǒng)PSII與PSI基因的水平能夠促進(jìn)噬藻體的生態(tài)適應(yīng)性, 且推測(cè)噬藻體PSI基因的多樣性遠(yuǎn)比起初我們估計(jì)得還要豐度。Roux等[60]運(yùn)用宏基因組學(xué)方法對(duì)兩個(gè)淡水湖中的病毒群落進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示淡水水體中非常豐富的噬藻體多樣性, 且它們基因組成顯著差異。

5 噬藻體遺傳多樣性的未來研究

噬藻體多樣性及其生態(tài)作用一直倍受研究人員的高度關(guān)注, 尤其是對(duì)有害藍(lán)藻水華控制成為水環(huán)境科學(xué)、病毒學(xué)及藻類研究的重要關(guān)注方向。近年來, 借助分子生態(tài)學(xué)的研究手段從分子水平上開展不同水生態(tài)環(huán)境中噬藻體多樣性的研究, 并取得了一定階段性成果。然而, 噬藻體遺傳多樣性的研究是以大量的噬藻體遺傳信息為基礎(chǔ), 現(xiàn)有微生物分離培養(yǎng)技術(shù)不能滿足未知噬藻體的分離鑒定, 從而在一定程度上限制了噬藻體多樣性。

根據(jù)已經(jīng)取得的研究成果, 結(jié)合分子生態(tài)學(xué)研究手段, 在未來噬藻體生態(tài)學(xué)研究中, 我們可考慮從以下幾個(gè)方面研究: 1)進(jìn)一步優(yōu)化與改進(jìn)微生物分離培養(yǎng)技術(shù), 從不同生境中分離出更多的純系噬藻體, 用于豐富噬藻體及其基因組資源, 并從分子水平、蛋白水平對(duì)所得的噬藻體進(jìn)行生物學(xué)與生態(tài)學(xué)研究; 2)著重于對(duì)富營養(yǎng)化水體中噬藻體的分布、豐度及其與藍(lán)藻數(shù)量變化之間的相互關(guān)系研究, 將噬藻體作為防治有害藍(lán)藻水華的有效生物調(diào)控因子加以利用; 3)綜合運(yùn)用現(xiàn)代微生物分子識(shí)別技術(shù), 如蛋白質(zhì)組學(xué)、宏基因組學(xué)及基因芯片等, 深入發(fā)掘海洋及淡水環(huán)境中未知噬藻體基因序列, 對(duì)噬藻體多樣性進(jìn)行全面研究; 4)將多種研究手段結(jié)合起來進(jìn)行噬藻體多樣性研究, 因?yàn)槿魏我环N研究方法都有各自的缺點(diǎn)和不足, 多種方法的聯(lián)合使用可以取長補(bǔ)短, 減少單一分析技術(shù)的局限性, 綜合各類技術(shù)的優(yōu)勢(shì), 使獲得的浮游病毒生態(tài)學(xué)信息更為客觀、真實(shí)和有效。

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Advances in researches on cyanophage genetic diversity and molecular ecology

GAO Ebin*, DONG Yiming
School of The Environment and Safety Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang212013,China

Cyanophages are important active components of aquatic microbial communities, and are widespread in both marine and freshwater environments. As a key biological agent, cyanophages exercise a great influence on cyanobacterial population structure, diversity, and aquatic ecological environments. The study on cyanophage diversity in aquatic environments will greatly contribute to the exploitation and utilization of cyanophage resources. The aims of this article are to summarize molecular basis and markers of cyanophage genetic diversity research from the viewpoint of molecular ecology, and to describe the basic concept and application of the related research methods. Furthermore, the combination of molecular ecology and cyanophage diversity research enables us to make some future predictions in this field.

cyanophage; auxiliary metabolic genes; genetic diversity; molecular ecology; cyanobacteria

10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.02.025

Q938.8

A

1008-8873(2016)02-166-08

2015-09-02;

2015-10-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 31200019); 江蘇大學(xué)高級(jí)專業(yè)人才啟動(dòng)基金項(xiàng)目(No. 11JDG151); 中國科學(xué)院南海海洋研究所開放基金項(xiàng)目(No. LMB131001)

高惡斌(1979—), 男, 江西彭澤人, 博士, 講師, 主要從事病毒分子生物學(xué)研究, E-mail: gaofei7908@126.com