于 穎, 宋金明, 俞立東, 孫 萱

(中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

牡蠣中氨基酸的傅里葉變換近紅外光譜法快速定量測定

于 穎, 宋金明, 俞立東, 孫 萱

(中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

本文通過乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、一階求導(dǎo)(1stDerivative, Db1)和Norris平滑等傅里葉變換近紅外光譜定量分析數(shù)學(xué)模型, 用交叉驗證法確定了最優(yōu)化建模參數(shù), 構(gòu)建了牡蠣中氨基酸的快速定量測定方法。結(jié)果表明, 牡蠣近紅外光譜與氨基酸含量化學(xué)計量學(xué)擬合, 線性相關(guān)系數(shù)為0.9860, 交叉驗證后線性相關(guān)系數(shù)為0.9794, 對牡蠣樣品進(jìn)行檢測, 結(jié)果與傳統(tǒng)的氨基酸分析儀的測試結(jié)果相比, 相對誤差小于2.5%, 方法的精密度(RSD)小于1.0%, 本文建立的傅里葉變換近紅外光譜法定量分析牡蠣中氨基酸具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便等特點, 測定重復(fù)性優(yōu)于氨基酸分析儀法。

氨基酸; 定量測定; 牡蠣; 傅里葉變換近紅外光譜法

隨著計算機(jī)技術(shù)和化學(xué)計量學(xué)的發(fā)展以及近紅外光譜定量技術(shù)的進(jìn)步, 傅里葉變換近紅外光譜(FT-IR)分析技術(shù)越來越多地在許多領(lǐng)域被廣泛使用,已經(jīng)成為一種極具競爭力的光譜定量分析方法。化合物分子中C—H、N—H、O—H和C—O等基團(tuán)基頻振動的合頻和倍頻振動的吸收峰位于近紅外光譜區(qū), 因此近紅外技術(shù)比較適于分析與這些基團(tuán)有直接或間接關(guān)系的成分[1]。氨基酸分子具有上述基團(tuán),理論上采用近紅外光譜法測定牡蠣中氨基酸含量是可行的, 氨基酸分子結(jié)構(gòu)通式為:

牡蠣又名蠔、海蠣子、蠣黃、蠣蛤、牡蛤、古賁、蚵, 屬軟體動物門雙殼綱珍珠貝目的曲蠣科和牡蠣科[2]。牡蠣是世界上最重要的養(yǎng)殖貝類和我國四大養(yǎng)殖貝類之一。牡蠣味道鮮美, 營養(yǎng)豐富, 可提高人體免疫力, 具有很高的藥用價值, 牡蠣肉中必需氨基酸完全程度和質(zhì)量比例優(yōu)于人乳和牛乳[3-4]。氨基酸是牡蠣中的重要營養(yǎng)成分, 是評價牡蠣質(zhì)量的重要指標(biāo), 因此也是牡蠣選苗育種的重要考慮因素[5], 氨基酸在碳的生物地球化學(xué)循環(huán)中具有重要價值, 定量獲取氨基酸含量是揭示其生態(tài)學(xué)功能的前提[6-7]。其常規(guī)測定方法是用鹽酸將樣品水解, 經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后, 與茚三酮的溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng), 再通過分光光度計比色測定氨基酸含量[8], 該方法樣品前處理繁瑣(水解、濃縮等)、成本高, 且非常費時(>36h), 不適用于大批量快速分析的要求。常規(guī)氨基酸測定方法測定的是不同種類氨基酸含量, 最終加和為氨基酸總量, 因一般評價牡蠣中營養(yǎng)價值考察的是總量, 不同種類氨基酸含量意義不明顯,因此本文僅研究牡蠣中氨基酸總量的快速檢測方法。近紅外光譜法定量測定大豆等樣品中氨基酸已有相關(guān)報道[9], 但至目前其用于牡蠣中氨基酸快速定量的研究和探索尚屬空白。

本研究采用美國Thermo Fisher Scientific公司的Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀和相應(yīng)的軟件RESULT-Integration 和TQ Analyst定量分析軟件, 對牡蠣進(jìn)行近紅外光譜掃描和分析, 建立了快速測定牡蠣中氨基酸含量的分析模型。結(jié)果表明, 方法不僅快速(<5min)可行, 重復(fù)性和再現(xiàn)性良好, 而且由于不需要繁瑣的樣品分析前處理, 基本沒有試劑及耗材的消費。

1 實驗部分

1.1 儀器與樣品

美國Thermo Fisher Scientific公司的Antaris Ⅱ型號的傅里葉變換近紅外光譜儀, 儀器采用CaF2分束器, 配備InGaAs檢測器、漫反射積分球(內(nèi)置背景)、透射模塊、光纖模塊等配件及相應(yīng)的RESULTIntegration 和TQ Analyst 定量分析軟件。

本次實驗選擇來自丹東、大連、昌黎、海洋島、韓國、加拿大等不同地區(qū)的87組牡蠣樣品作為建模與驗證樣品, 隨機(jī)抽取其中10個用于建模后比對和驗證實驗, 另外77組作為建立數(shù)學(xué)模型的樣品集。將樣品水洗凈后放置于組織搗碎機(jī)在10 000~15 000 r/min條件下研磨制成組織勻漿, 將勻漿轉(zhuǎn)移到5mL樣品管中后放入–20℃冷凍 10 h, 冷凍后的樣品用冷凍干燥機(jī)干燥 20 h后用于測定。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣氨基酸定量結(jié)果基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的獲取

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)方法準(zhǔn)確稱取牡蠣干粉20 mg左右(精確到0.001g)于安培瓶中, 加入10 mL6 mol/L鹽酸, 充氮氣后密封。置于110℃烘箱中水解24 h后減壓蒸干, 用0.02mol/L鹽酸定容至10 mL。量取制備好的樣品200 μL, 置于1 mL離心管中, 加入100 μL三乙胺溶液、異硫氰酸苯酯100 μL, 混勻, 室溫放置1 h, 然后加入400 mL正己烷振搖后放置10 min, 取下層溶液, 用0.45 μm膜過濾后, 用氨基酸分析儀檢測, 通過外標(biāo)法獲得氨基酸含量。

1.2.2 光譜采集方法

將3~5 g牡蠣試樣直接放置在積分球采集點上,利用RESULT-Integration軟件設(shè)計信息采集工作流,設(shè)置采集參數(shù)為在4 000~10 000 cm–1范圍內(nèi)掃描32次, 分辨率8.0 cm–1, 優(yōu)化增益無衰減, 以漫反射的方式采集光譜。每個樣品分別測試3次, 取其平均光譜。

1.2.3 數(shù)學(xué)模型的建立與優(yōu)化

采集所有樣品的漫反射紅外透射光譜圖后, 在“Standards”界面添加建立模型使用的樣品光譜, 導(dǎo)入建模樣品的國標(biāo)法測定值, 采用最小二乘法(PLS)作為建立數(shù)學(xué)模型的化學(xué)計量學(xué)方法, 利用TQ Analyst 定量分析軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)預(yù)建模。根據(jù)預(yù)建模的關(guān)聯(lián)結(jié)果, 利用馬氏距離的方法診斷光譜中異常值, 采用乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、一階求導(dǎo)(1st Derivative, Db1)、Norris平滑(其中segment lengths 選擇5, gap between segment選擇5)等方法對光譜進(jìn)行預(yù)處理, 得到關(guān)聯(lián)系數(shù)較高的數(shù)據(jù)模型(圖1)。

1.2.4 數(shù)據(jù)模型的驗證

對模型進(jìn)行交叉驗證, 即每次從建模樣品集中取出一個樣品, 用剩下的(N–1)個樣品建立模型, 預(yù)測被取出的樣品, 如此循環(huán)直至所有樣品均被預(yù)測一次。考察預(yù)測值與國標(biāo)法測定值的相關(guān)系數(shù)(R)和均方差(RMSECV)。

利用建立完成化學(xué)計量學(xué)數(shù)學(xué)模型, 并隨機(jī)抽取的倆個樣品分別進(jìn)行10次重復(fù)性實驗。利用該模型檢測隨機(jī)抽取的十個樣品, 結(jié)果與氨基酸國標(biāo)法比對。

表征近紅外光譜定量模型建模效果的指標(biāo)有校正相關(guān)系數(shù)RC、交叉驗證相關(guān)系數(shù)RCV, 校正集誤差均方根RMSRC、交叉驗證誤差均方根RMSSECV, 各參數(shù)的計算方程式如下:

式中, Ci為真實值或標(biāo)準(zhǔn)方法測定得到的參考值,是模擬擬合值,是交叉驗證時的模型擬合值, C?是參考值的平均值, n是校正集樣品數(shù)。

圖1 數(shù)據(jù)模型Fig. 1 Model data

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣的近紅外光譜圖和光譜范圍的選擇

用近紅外光譜儀掃描出87個牡蠣試樣的近紅外光譜圖(圖2)。利用馬氏距離法鑒別光譜異常值(圖3), 其中顯示分布圖中的一個樣品為異常, 將該樣品光譜值在數(shù)學(xué)模型中剔除, 用主成分分析佐證其他樣品光譜圖無異常(圖4)。如圖2所示, 牡蠣紅外吸收峰主要集中在4 000~7 500 cm–1范圍, 其中在5 257 cm–1、4 900 cm–1和4 537 cm–1處分別為氨基酸基團(tuán)O-H、N-H、C-H等倍頻吸收峰, 求導(dǎo)后信號峰更明顯見圖5和圖6, 包含氨基酸含量的重要信息。根據(jù)光譜原始圖(圖2)和導(dǎo)數(shù)圖(圖3和圖4)中吸收峰的位置, 將考查光譜范圍分為4 000~10 000 cm–1、 4 000~9 000 cm–1、4 000~7 500 cm–1、4 000~6 250 cm–1,逐步剔除不提供信息的變量, 根據(jù)不同波段的譜圖與氨基酸含量的相關(guān)性進(jìn)行光譜范圍的篩選。實驗結(jié)果(表1)表明代表牡蠣中氨基酸含量變化紅外吸收峰主要集中在4 000~7 500cm–1, 雖然氨基酸基團(tuán)- CONH近紅外吸收峰在6 250~7 500cm–1之間, 但由二階導(dǎo)譜圖分離可以看出該波段屬于不同化學(xué)物質(zhì)的合峰, 且響應(yīng)較弱, 因此將光譜范圍鎖定在4 000~6 250 cm–1, 通過微調(diào), 最終確定最佳光譜范圍在4 043~6 212 cm–1。

圖2 牡蠣原始近紅外光譜圖Fig. 2 NIR spectrum of oyster

圖3 馬氏距離方法鑒別異常值Fig. 3 Identification of outliers using Markov distance method

表1 模型的光譜范圍篩選實驗結(jié)果Tab. 1 Experimental results of spectral range screening

2.2 光譜預(yù)處理

近紅外光譜不僅可以反映樣品的化學(xué)組成及含量等信息, 還會受到其密度、粒度等物理因素的干擾,甚至還包含有一部分的無關(guān)信息, 如背景噪聲、雜散光等。為了盡可能多地從光譜中提取與待測化學(xué)組分相關(guān)的信息, 以便建立穩(wěn)定可靠的定性、定量預(yù)測模型, 就必須對光譜進(jìn)行適當(dāng)?shù)仡A(yù)處理, 消除其他無關(guān)信息的干擾[10-11]。一般近紅外光譜建立化學(xué)計量學(xué)數(shù)據(jù)模型, 都通過一定預(yù)處理方法提高光譜與數(shù)值間的擬合度, 因此本實驗考察了乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、一階導(dǎo)數(shù)(1stDerivative, Db1)、二階導(dǎo)數(shù)(2ndDerivative, Db2)等常用光譜預(yù)處理方法對數(shù)學(xué)模型的線性相關(guān)系數(shù)的影響(表2)。

圖4 主成分分析3D立體圖Fig. 4 Principal component analysis 3D stereo diagram

圖5 一階導(dǎo)數(shù)(1stDerivative, Db1)近紅外光譜圖Fig. 5 First order derivative (Derivative, Db1) NIR spectroscopy

圖6 二階導(dǎo)數(shù)(2ndDerivative, Db2)近紅外光譜圖Fig. 6 Second order derivative (Derivative, Db1) NIR spectroscopy

實驗結(jié)果表明, 導(dǎo)數(shù)可以用于消除光譜的基線漂移及背景干擾, 分辨重疊峰, 提高分辨率和靈敏度, 但求導(dǎo)過程中同時也會放大噪聲信號。一階導(dǎo)數(shù)(Db1)已經(jīng)將信號明顯放大, 雖然二階導(dǎo)數(shù)(Db2)放大信號作用比一階導(dǎo)數(shù)要好, 但是同時放大了波數(shù)小于4 500 cm–1等處的噪聲, 信噪比和相關(guān)系數(shù)相對反而降低。因此選擇一階導(dǎo)數(shù)Db1。通過表2可以看出, 雖然通過光譜預(yù)處理法提高了線性關(guān)系, 但是提高結(jié)果并不顯著, 主要原因是本實驗?zāi)迪犖辗?5%以上是氨基酸分子特征峰, 譜圖噪聲少, 在選定的光譜范圍內(nèi)幾乎無無關(guān)信息, 因此在沒有光譜預(yù)處理的情況下也可以得到很好的線性關(guān)系, 同時也說明該數(shù)據(jù)模型很好的代表了牡蠣中氨基酸含量變化, 說明了近紅外檢測氨基酸含量方法是可行的。本實驗最終采用了乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、導(dǎo)數(shù)( Derivative)、Norris平滑(其中segment lengths 選擇5, gap between segment選擇5)等方法對光譜進(jìn)行預(yù)處理。

表2 不同預(yù)處理方法的數(shù)學(xué)模型結(jié)果Tab. 2 Mathematical model correlation coefficient of different pretreatment methods

表3 近紅外-氨基酸含量數(shù)學(xué)模型的效果Tab. 3 Effect of mathematical model of near infrared amino acid content

2.3 交叉驗證的結(jié)果

利用化學(xué)計量學(xué)方法最小二乘法(PLS)將牡蠣的近紅外光譜與氨基酸含量進(jìn)行擬合, 通過交叉驗證優(yōu)化參數(shù), 建模樣品的模型預(yù)測值與國標(biāo)法測氨基酸真值相關(guān)系數(shù)為0.9860, 誤差均方根(RMSEC)為0.379, 交叉驗證相關(guān)系數(shù)為0.9794, 交叉驗證誤差均方根(RMSECV)為0.460。預(yù)測值與真值絕對誤差小于±1%。結(jié)果表明, 數(shù)學(xué)模型良好, 預(yù)測準(zhǔn)確度高。

表4 近紅外法與氨基酸分析儀法比對實驗結(jié)果Tab. 4 Comparison of results of NIR with amino acid analyzer

表5 近紅外光譜法重復(fù)性實驗Tab. 5 Results of repeated experiments in NIR

2.4 方法比對實驗和重復(fù)性實驗

隨機(jī)抽取10個待測樣品, 分別采用新建近紅外光譜法和氨基酸分析儀檢測, 檢測結(jié)果(表4)的最大相對偏差小于±1%, 相對誤差小于2.5%。采用新建的近紅外光譜法對兩個樣品分別進(jìn)行10次測定, 結(jié)果(表5)表明, 該方法測定牡蠣中氨基酸重復(fù)性很好,重復(fù)性測定結(jié)果的RSD小于1%。因氨基酸分析儀法前處理復(fù)雜, 而近紅外法測定氨基酸含量不需要進(jìn)行任何前處理, 從而降低了誤差來源, 因此近紅外法重復(fù)性優(yōu)于氨基酸分析儀法。

表6 氨基酸分析儀重復(fù)性實驗Tab. 6 Results of repeated experiments in amino acid analyzer

3 結(jié)論

本研究表明, 在4 000~7 500 cm–1光譜范圍內(nèi),牡蠣近紅外譜圖含有氨基酸分子主要基團(tuán)O-H、N-H、C-H等的近紅外倍頻吸收峰, 且無其他無關(guān)信息峰, 光譜噪聲小, 信息峰強(qiáng)度高, 因此構(gòu)建近紅外法氨基酸含量測定模型是可以實現(xiàn)的。本文利用化學(xué)計量學(xué)最小二乘法(PLS)將牡蠣近紅外光譜與氨基酸含量進(jìn)行擬合, 采用乘法散射校正(multiplicative scattering correction MSC)、一階求導(dǎo)(1st Derivative, Db1)、Norris平滑等光譜預(yù)處理方法優(yōu)化數(shù)學(xué)模型,建立了傅里葉變換近紅外光譜定量分析牡蠣中氨基酸的數(shù)學(xué)模型, 通過對模型進(jìn)行交叉實驗驗證, 近紅外法的測定值與氨基酸真值之間的線性相關(guān)系數(shù)為0.986 0, 與氨基酸分析儀檢測氨基酸含量對比絕對誤差小于±1%, 相對誤差小于2.5%, 實驗結(jié)果表明建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測的準(zhǔn)確度高。對于相同的樣品, 氨基酸含量的近紅外光譜法無需樣品前處理,降低了誤差的來源, 實驗重復(fù)性高于氨基酸分析儀。本文發(fā)展的傅里葉近紅外光譜法為快速評價牡蠣中的氨基酸營養(yǎng)成分提供了可行的方法。

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Received:Feb. 11, 2016

Quantitative analysis of amino acids in oyster by FT-NIR spectroscopy

YU Ying, SONG Jin-ming, YU Li-dong, SUN Xuan
(Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

amino acids; Quantitative determination; oyster; Fourier transform-near infrared spectroscopy (FT-NIR)

In this study, spectra pretreatment methods of multiplicative scattering correction (MSC), Norris smoothing, and 1st Derivative (Db1) were applied to develop a FT-NIR mathematics model for quantitative analysis of amino acids in oyster. Optimum parameters of the model were studied using a cross validation method. By fitting the total amino content to the spectra, the linear correlation coefficient was found to be 0.9860 and the linear correlation coefficient of cross validation was 0.9794. The develop method was used to determine amino acids in oyster and results show no obvious difference between using the developed NIR and the traditional amino acid analyzer, with a relative error of less than 1.0% and repeatability of 1.0% RSD(n = 10). This suggests that the new NIR method is feasible for high precision determining of amino acids in oyster.

Q517

A

1000-3096(2016)12-0001-07

10.11759/hykx20160331005

(本文編輯: 梁德海)

2016-02-11;

2016-05-22

中國科學(xué)院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項目(yg2012055)

[Foundation: Technology Innovation Project of the Instrument and Equipment of the CAS, No. yg2015055]

于穎(1973-), 女, 遼寧鞍山人, 碩士, 高級工程師, 主要近紅外和中紅外分析研究, 電話: 0532-82898876, E-mail: yingyu@qido.ac.cn;宋金明, 通信作者, 研究員, 博士生導(dǎo)師. E-mail: jmsong@qdio.ac.cn