施　超, 陳國強(qiáng), 馬育芳（. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海0040；. 上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司, 上海003）

曲古抑菌素A在體細(xì)胞核移植中的應(yīng)用

施超1,2, 陳國強(qiáng)2, 馬育芳1
（1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海200240；2. 上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司, 上海201203）

體細(xì)胞核移植（SCNT）技術(shù)已成功獲得多種哺乳動物的克隆后代，但一直以來克隆的成功率都很低，并且存活個體大多表型異常。研究表明，重構(gòu)胚的重編程不完全是導(dǎo)致克隆動物存活率低下和發(fā)育異常的主要原因之一。DNA甲基化、組蛋白乙酰化都是影響重編程的重要因素，曲古抑菌素A（TSA）是鏈霉素的代謝產(chǎn)物，同時也是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，能降低DNA甲基化水平，促進(jìn)重編程率，進(jìn)而提高克隆效率。本文對TSA的生物學(xué)功能及其在動物SCNT中的應(yīng)用進(jìn)行了探究。

曲古抑菌素A（TSA）； 體細(xì)胞核移植（SCNT）； 組蛋白乙?；?/p>

曲古抑菌素A（Trichostatin A, TSA），屬羥肟酸類，鏈霉菌代謝產(chǎn)物，最早作為抗真菌藥物使用，后發(fā)現(xiàn)其為一種組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）抑制劑中，其作用效果是非競爭性可逆的。目前已知TSA可以通過抑制去乙?；傅幕钚詮亩岣呓M蛋白乙?；某潭?，促進(jìn)表觀遺傳重組［1］。另外，科研人員發(fā)現(xiàn)TSA與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，它可使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變松弛，使外源基因的轉(zhuǎn)錄子易于與DNA相結(jié)合，促進(jìn)外源基因的表達(dá)，這些功能對于提高體細(xì)胞核移植（SCNT）的成功率有重大作用，從而可提高克隆動物的成功率。自2006年TSA率先運(yùn)用于提高小鼠SCNT的成功率以來，科研人員就TSA是否能提高豬、牛、羊的SCNT的成功率進(jìn)行了廣泛的研究。本文就TSA在SCNT中的應(yīng)用情況進(jìn)行討論，為研究人員在SCNT中的進(jìn)一步的研究和應(yīng)用提供參考。

1　目前SCNT的進(jìn)展

SCNT是指將高度分化的體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使體細(xì)胞核發(fā)生重編程并恢復(fù)全能性，產(chǎn)生一個新個體的過程。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動物個體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的動物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。核移植是動物克隆的一種重要手段，是克隆動物成功的關(guān)鍵。雖然已經(jīng)有很多品種的實(shí)驗(yàn)動物成功獲得克隆后代，但克隆的成功率仍很低［2］。造成克隆成功率低下的一個重要原因是表觀遺傳重編程的不徹底，組蛋白作為表觀遺傳修飾的重要組成部分，可以直接影響克隆胚胎的發(fā)育和外源基因的表達(dá)。提高組蛋白乙?；纱龠M(jìn)表觀遺傳重組，繼而提高克隆動物的存活率。

2　組蛋白乙?；饔眉癟SA的作用

組蛋白乙酰化反應(yīng)多發(fā)生在核心組蛋白N端堿性氨基酸集中區(qū)的特定賴氨酸殘基。組蛋白乙?；癄顟B(tài)由兩類酶即組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和HDAC及其相對活性決定。在HAT的作用下，乙酰輔酶A上的乙?；晦D(zhuǎn)移到組蛋白N端賴氨酸的ε-氨基上，中和其正電荷，減弱了核小體中堿性賴氨酸與DNA的靜電吸引力，削弱了DNA與組蛋白的相互作用，使染色體處于開放狀態(tài)，有利于轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)入，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄［3］。因此，組蛋白的乙?；揎椩诨虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。染色質(zhì)特定部位的組蛋白乙?；癄顟B(tài)呈多樣性，核小體上有多個位點(diǎn)可供乙?；囟ɑ虿课坏慕M蛋白乙?；腿ヒ阴；砸环N非隨機(jī)的位點(diǎn)特異方式進(jìn)行［4］。

TSA可以特異抑制組蛋白去乙?；傅幕钚裕档虳NA甲基化水平，激活印記基因的表達(dá)［5］。組蛋白乙酰化狀態(tài)與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及衰老均有關(guān)系，TSA可以抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化成正常細(xì)胞，同時還能影響胚胎的發(fā)育［6］。在SCNT過程中，TSA作用于供體細(xì)胞或重構(gòu)胚或同時作用于供體細(xì)胞和重構(gòu)胚，提高了SCNT的成功率，進(jìn)一步保證了動物個體克隆的成功。

3　TSA在實(shí)驗(yàn)動物上的應(yīng)用

3.1在小鼠核移植研究中的應(yīng)用

在小鼠SCNT過程中, 如果增加TSA作用時間至11 h, 能同時提高孤雌胚的囊胚率和SCNT的囊胚率。而單獨(dú)改變TSA的濃度，在5～50 nmol/L，胚胎的卵裂率和囊胚率差異并沒有顯著改變［7］。有研究［8］表明，使用5 nmol/L的TSA處理10 h，小鼠細(xì)胞核移植時可使小鼠囊胚的發(fā)育率從20%提高至75%； 在使用小鼠的尾尖細(xì)胞、脾細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞做供體細(xì)胞的SCNT實(shí)驗(yàn)中，使用5～50 nmol/L的TSA，作用于供體細(xì)胞10 h，結(jié)果顯示除了對胚胎干細(xì)胞有毒害作用外，對其他幾種細(xì)胞核移植的囊胚發(fā)育都有明顯的促進(jìn)作用。由此推斷TSA在小鼠SCNT過程中有促進(jìn)作用。

3.2在豬核移植研究中的應(yīng)用

研究［9］表明，使用50 nmol/L 的TSA處理供體細(xì)胞或者重構(gòu)胚24 h能同時提高豬胚胎的卵裂率和囊胚率，通過間接熒光免疫檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TSA作用于重構(gòu)胚提高了組蛋白賴氨酸的重編程能力，并引起了轉(zhuǎn)移核子的膨脹，通過提高重構(gòu)胚的重編程能力，明顯提高了豬的核移植成功率。另有研究［10］表明，TSA在作用于豬的重構(gòu)胚體外培養(yǎng)時，對重構(gòu)胚的囊胚率也有大幅提高。同時對于重構(gòu)胚的1-細(xì)胞期、2-細(xì)胞期和4-細(xì)胞期都有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，而在囊胚期凋亡指數(shù)卻大幅度下降。由此可以推斷，TSA誘導(dǎo)早期重構(gòu)胚的凋亡是為了促進(jìn)囊胚期胚胎發(fā)育率的提高。

在轉(zhuǎn)基因小型豬的研究［11,12］表明，50 nmol/L 的TSA能大幅度提高體外培養(yǎng)胚胎的卵裂率和囊胚率。但是進(jìn)一步觀察囊胚的細(xì)胞數(shù)量時顯示，50 nmol/L組的明顯要少于空白組和100 nmol/L組，且差異顯著，說明對TSA的作用機(jī)制需要做進(jìn)一步的研究。

3.3在牛核移植研究中的應(yīng)用

在印度水牛核移植中添加0.3 μmol/L 的TSA并處理供體細(xì)胞48 h后，表明TSA促進(jìn)了重構(gòu)胚的重編程，同時影響了表觀修飾遺傳基因位點(diǎn)acH4K8的乙?；癄顟B(tài)，最終表現(xiàn)為水牛胚胎的體外囊胚發(fā)育率顯著提高［13］； 在體外培養(yǎng)克隆牛胚胎的試驗(yàn)中，50 nmol/L 的TSA作用供體細(xì)胞24 h，其mRNA的翻譯準(zhǔn)確性大大提高，從而提高了克隆牛胚胎的發(fā)育完整性。許多實(shí)驗(yàn)研究［14,15］表明，TSA不但是強(qiáng)大的表觀遺傳調(diào)制器而且還是調(diào)整細(xì)胞周期強(qiáng)大的同步器。

3.4在羊核移植研究中的應(yīng)用

我國科學(xué)家楊楠等［16］研究表明，300 nmol/L 的TSA作用綿羊胚胎細(xì)胞10 h，能提高綿羊孤雌胚的囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)。李向臣等［17］利用流式分選技術(shù)分析處理和間接免疫熒光法檢測，發(fā)現(xiàn)灘羊供體細(xì)胞經(jīng)10 nmol/L的TSA處理24 h后，其克隆胚胎卵裂率和囊胚率明顯得到提升，分別達(dá)到85.2% 和35.6%。

3.5其他動物研究中的應(yīng)用

在克隆兔胚胎的研究［18］中，TSA（50 nmol/L）和神經(jīng)膠質(zhì)瘤分子（SCP） （250 nmol/L）共同作用克隆兔的胚胎6 h，胚胎發(fā)育至桑椹胚和囊胚的概率分別提高到58.6%和49.4%，由此推斷TSA和SCP對克隆兔胚胎體外發(fā)育有協(xié)同作用，能更好地提高克隆兔的胚胎發(fā)育。

在異種SCNT體系中，秦祖興等［19］研究顯示，食蟹猴-豬異種SCNT過程中，添加10 nmol/L的TSA并處理重構(gòu)胚48 h能顯著提高異種重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率。

4　展望

綜上所述，TSA對于克隆胚胎表觀遺傳改變有修正作用，但同時也伴隨著致畸作用［20］。TSA濃度過低、作用時間過短時，對于克隆胚胎效果不顯著；而當(dāng)TSA濃度過高、作用時間過長時，則將引起克隆胚胎在發(fā)育后期出現(xiàn)致畸作用。在SCNT過程中，TSA作用不同種類胚胎的使用濃度及作用時間是不同的： 小鼠胚胎使用量基本控制在5～50 nmol/L, 時間控制在10～20 h，對胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用；豬胚胎使用量控制在5～50 nmol/L，時間控制在12～24 h，對胚胎有促進(jìn)作用； 牛胚胎使用量控制在30～50 nmol/L ，時間控制在24～48 h，對胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用；羊胚胎使用量需控制在10～300 nmol/L, 時間控制在10～24 h，對胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用。雖然大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，TSA對克隆動物的重構(gòu)胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用，但誘發(fā)這些現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制還沒有完全明了，因此TSA作用機(jī)制是目前研究重點(diǎn)，只有明確了解了TSA的作用機(jī)制，才能為TSA在克隆動物胚胎發(fā)育中的應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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The Application of Trichostatin Afor Somatic Cell Nuclear Transfer

SHI Chao1,2, CHEN Guo-qiang2, MA Yu-fang1
（1. School of Agriculture and Biology， Shanghai JiaoTong University， Shanghai 200240， China；2. Shanghai SIPPR BK Laboratory Animals Ltd， Shanghai 201203， China）

Somatic cell nuclear transfer （SCNT） technique has been successfully applied to obtain many mammal clonal offspring. But the success rate was always very low and most surviving individuals showed phenotypic abnormalities. Research shows that the incomplete reprogramming of reconstructed embryo is one of the main reasons that causes the low survival rate and offspring dysplasia. DNA methylation and histone acetylation are both the essential factors that influence the reprogramming. Trichostatin A （TSA ）is a streptomycin metabolite, as well the histone acetylation enzyme inhibitor that reduces the level of DNA methylation and promotes the reprogramming rate to improve the cloning efficiency. The article studies the biological function of TSA and its application in animal SCNT.

Trichostatin A （TSA ）； Somatic cell nuclear transfer （SCNT）； Histone acetylation

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0157-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.017

2015-06-02

施超（1985-）, 女, 研究方向： 實(shí)驗(yàn)動物胚胎學(xué)。E-mail： chao85chao@163.com