孫　明，劉巧榮，秦亞嫚，鄧小雨，楊欣艷，劉伯華，陳西釗,2

(1. 北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京　100085；2.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京　100125)

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研究報(bào)告

犬副流感病毒的分離鑒定及部分基因序列分析

孫明1，劉巧榮1，秦亞嫚1，鄧小雨1，楊欣艷1，劉伯華1，陳西釗1,2

(1. 北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京100085；2.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100125)

【摘要】目的分離并鑒定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus，CPIV)，并對(duì)該病毒N、HN和F基因進(jìn)行序列分析，研究其遺傳變異情況；為CPIV診斷、治療以及預(yù)防奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。方法用Vero細(xì)胞接種感染CPIV陽性犬肺組織，盲傳3代，觀察病變情況，收集72 h培養(yǎng)液進(jìn)行PCR鑒定、血凝特性以及形態(tài)學(xué)觀察。同時(shí)，用3對(duì)特異性引物，擴(kuò)增N、HN和F全基因，進(jìn)行序列測(cè)定和分析，并制作系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果從犬肺中成功分離出一株犬副流感病毒，并命名為QF20100726。該病毒能凝集豚鼠、豬、雞和人O型血，電鏡觀察病毒呈圓形、長(zhǎng)絲狀等形態(tài)多樣、大小不等的顆粒狀；序列分析表明，與人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒基因相比，N基因核苷酸同源性為 95.7%～99.8%，氨基酸同源性為97.4%～99.6%，其中有兩處氨基酸發(fā)生新的變異，分別是第257位由V變成了A，第301位由A變成了T；HN基因核苷酸同源性為95.5～99.8%，氨基酸同源性為96.3～99.6%，F(xiàn)基因核苷酸同源性為94.7%～99.6%，氨基酸同源性為 95.6%～99.3%。有兩處發(fā)生特異變異，分別是56位由T變成了S，89位由T變成了M。結(jié)論成功分離犬副流感病毒QF20100726分離株，其血凝特性及超微形態(tài)特征均符合CPIV特性，N、HN和F全基因生物進(jìn)化樹顯示，該分離株與犬副流感病毒分離株08-1990(登錄號(hào)：KC237063)親緣關(guān)系最近；N基因氨基酸在第257位(由V變成了A)和第301位(由A變成了T)，F(xiàn)基因氨基酸在第56位(由T變成了S)和89位(由T變成了M)發(fā)生了特異性變異。這些數(shù)據(jù)將為CPIV的防控奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】CPIV；病毒分離；序列分析

犬副流感病毒感染(canine parainfluenza virus infection)是由犬副流感病毒(canine parainfluenza virus，CPIV)引起的犬的一種接觸性傳染病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、流涕和咳嗽。CPIV是犬傳染性呼吸系統(tǒng)疾病(即“犬窩咳”)的主要病源之一[1]。常引起犬的支氣管炎和支氣管肺炎，損害呼吸道上皮細(xì)胞，給其他病原體的感染創(chuàng)造了條件[2,3]。1967年Binn等用犬腎細(xì)胞首次從患有呼吸道病的犬體內(nèi)分離到犬副流感病毒，此后在世界各地均有CPIV的報(bào)道，嚴(yán)重影響著世界各國養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展。

CPIV是單股、不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，約為15246 bp[4]。CPIV基因組主要編碼6種蛋白：大蛋白(L)、血凝素神經(jīng)氨酸酶(HN)、核衣殼蛋白(NP)、融合蛋白(F)、磷蛋白(P)和基質(zhì)蛋白(M)，其中NP蛋白是核衣殼蛋白的主要成分，與病毒RNA直接結(jié)合，高度保守，在病毒感染時(shí)可引起強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，HN蛋白和F蛋白突出于囊膜形成纖突，分別介導(dǎo)病毒吸附和穿入細(xì)胞。

該病毒在分類上屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)茹布拉病毒屬(Rubulavirus)。與同屬的猴病毒V型(SV5)、人SV5分離株及人副流感病毒- II 型(hPIV-II)抗原性密切相關(guān)[5]。目前，市場(chǎng)雖有此類疫苗，該病仍然時(shí)有發(fā)生，可能與該病毒的不斷變異有關(guān)，故分離當(dāng)前的流行變異株，了解序列變異情況對(duì)于預(yù)防該病的流行、診斷和治療等具有重要意義。

1材料和方法

1.1病料

臨床診斷犬副流感病毒病死京巴犬，年齡約1歲。臨床表現(xiàn)為患犬精神萎頓、不喜食；咳嗽、流涕、喘息等呼吸道癥狀，伴有發(fā)燒。治療無效死亡，取肺臟進(jìn)行處理。

1.2細(xì)胞系

Vero細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3載體、菌株、試劑

pGEM-T-easy購自Promega公司。DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。氨芐青霉素、購自Sigma公司。病毒RNA提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自O(shè)mega公司。DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清為Gibco產(chǎn)品。

1.4病毒分離

參照白文彬等介紹的方法[6]，進(jìn)行病毒分離，并將病毒命名為QF20100726。

1.5病毒鑒定

1.5.1血凝試驗(yàn)：參考姚火春介紹的方法[7]，分別采集豚鼠、雞、豬抗凝血，用PBS (pH 7.4)洗滌紅細(xì)胞四次，1 500 rpm離心10 min，用PBS(pH 7.2)配成1%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝試驗(yàn)(HA)。

1.5.2RT-PCR鑒定：用引物對(duì)：5′-AGTCAGAGTAGTTCAATAAGGACCTATC-3‘和5’-TGGTGAATTGAGATGGACTTCAGG-3′對(duì)所分離的病毒進(jìn)行RT-PCR鑒定，擴(kuò)增程序：42℃ 45 min，95℃ 3 min，95℃ 30 sec，55℃ 45 sec，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.5.3病毒的電鏡觀察：參考殷震、金昌德等介紹的方法[3,8]，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液負(fù)染色，進(jìn)行電鏡觀察。

1.6N、HN和F基因的克隆測(cè)序

1.6.1引物設(shè)計(jì)與合成：依據(jù)GenB上的CPIV基因組序列，分別針對(duì)N基因、HN基因和F基因設(shè)計(jì)了引物。如下：

N1：5′-AGTCAGAGTAGTTCAATAAGGACCTATC-3′

N2：5′-TGGTGAATTGAGATGGACTTCAGG-3′

HN1：5′-TTGCTGTCCTAACACCTGCTATAG-3′

HN2：5′-TGGTGAATTGAGATGGACTTCAGG-3′

F1：5′-CCAATAACTGGAATCACCAGCTTG-3′

F2：5′-CGAGACGGTTCTTTCAATACTAGTTTC-3′

三對(duì)引物分別可擴(kuò)增大小為1 678 bp、1 964 bp、和1 830 bp的片段。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.6.2擴(kuò)增及克?。?/p>

1.6.2.1病毒RNA的提取： 參照Omega公司的病毒RNA提取試劑盒操作說明提取PRV總DNA。

1.6.2.2RT-PCR擴(kuò)增： 42℃ 45 min，95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.6.2.3PCR產(chǎn)物電泳、克隆和序列測(cè)定：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Omega 公司膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，克隆到pGEM-T-easy，經(jīng)PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2結(jié)果

2.1病毒分離培養(yǎng)

病料接種到Vero細(xì)胞第5代24 h后出現(xiàn)典型細(xì)胞病變，至第5 天收毒時(shí)，大部分細(xì)胞融合，裂解死亡，培養(yǎng)液中碎片增多，相同條件下的正常細(xì)胞無此變化(圖1和圖2)。

2.2血凝試驗(yàn)

病毒在25℃條件能凝集豚鼠、豬、雞和人O型紅細(xì)胞。

2.3RT-PCR鑒定結(jié)果

對(duì)Vero細(xì)胞培養(yǎng)病毒進(jìn)行犬副流感病毒的RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示， Vero細(xì)胞培養(yǎng)的病毒為CPIV陽性。

2.4電鏡觀察

電鏡照片顯示，CPIV為圓形，有囊膜，直徑80 nm左右，囊膜上有直徑8 nm～10 nm的纖突。病毒因囊膜的破損而形態(tài)不規(guī)則，呈多形性、長(zhǎng)絲狀等長(zhǎng)絲狀核衣殼見圖3。

2.5N、HN和F基因克隆、測(cè)序

用設(shè)計(jì)的N、F和HN基因引物擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳顯示，分別可見約1 680 bp、1 970 bp、和1 830 bp左右的3個(gè)基因片段(圖4)，大小與N、F和HN蛋白基因相符，預(yù)測(cè)結(jié)果證實(shí)所克隆的基因正確。

圖1　正常對(duì)照vero細(xì)胞Fig.1　Normal control vero cells

圖2　CPIV接種vero后24 h細(xì)胞變化Fig.2　Vero cells at 24 hours after CPIV inoculation

圖3　電鏡下不同形態(tài)的病毒粒子(標(biāo)尺=200 nm)Fig.3　Different morphology of the virus particles observed under electron microscope(Bar=200 nm)

1. N基因, 2. F基因, 3. HN基因 M. Marker圖4　N、F和HN基因擴(kuò)增1. N gene, 2. F gene, 3. HN gene, M. markerFig.4　Amplification of N, F and HN genes

2.6N序列同源性分析

與人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒N基因相比，核苷酸同源性為 95.7%～99.8%，氨基酸同源性為97.4%～99.6%。其中有兩處氨基酸發(fā)生新的變異，分別是第257位由V變成了A，第301位由A變成了T。其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號(hào)：JQ743324)同源性最低為97.4%，與犬源副流感病毒分離株08-1990(登錄號(hào)：KC237063)和D277(登錄號(hào)：KC237065)同源性最高均為99.6%。用DNAMan生物軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖5。

圖5　N基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5　The phylogenetic tree based on N gene

2.7F基因序列同源性分析

與人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒F基因相比。核苷酸同源性為94.7%～99.6%，氨基酸同源性為 95.6%～99.3%。有兩處發(fā)生特異變異，分別是56位由T變成了S，89位由T變成了M。其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號(hào)：JQ743324)同源性最低為95.6%，與犬源副流感病毒分離株08-1990(登錄號(hào)：KC237063)同源性最高為99.3%。F基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，該分離株與分離株D277和08-1990在一個(gè)分支上(圖6)。

圖6　F基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6　The phylogenetic tree based on F gene

2.6HN基因序列同源性分析

與人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒H基因相比，核苷酸同源性為95.5～99.8%，氨基酸同源性為96.3～99.6%，其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號(hào)：JQ743324)同源性最低為95.5%，與犬源副流感病毒分離株D277(登錄號(hào)：KC237065)同源性最高為99.6%。HN基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，該分離株與D277和08-1990分離株在一個(gè)分支上(圖7)。

圖7　HN基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7　The phylogenetic tree based on HN gene

3討論

血清學(xué)調(diào)查表明，CPIV 在世界各國普遍存在[9-11]，是危害犬業(yè)重要傳染病之一。該病毒廣泛感染玩賞犬、實(shí)驗(yàn)犬、警犬和軍犬。主要表現(xiàn)為發(fā)熱、流涕和咳嗽，在軍犬和警犬中長(zhǎng)導(dǎo)致嗅覺障礙。另外CPIV也可引起急性腦脊髓炎和腦內(nèi)積水，臨床表現(xiàn)為后驅(qū)麻痹和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重危害犬類的健康生長(zhǎng)。近年來，隨著養(yǎng)犬業(yè)的不斷擴(kuò)大，犬副流感病毒感染越來越受到人們的重視。北京某動(dòng)物醫(yī)院診治一例臨床診斷為疑似CPIV感染京巴犬，表現(xiàn)為精神萎頓、不喜食；咳嗽、流涕、喘息等呼吸道癥狀，伴有發(fā)燒，治療無效死亡。自然條件下犬單獨(dú)感染CPIV的情況不為多見，究其死亡原因，可能與細(xì)菌、支原體和病毒等混合感染有關(guān)[12]。為了分析CPIV變異情況，本研究從此患犬肺臟組織中分離得到一株CPIV，命名為QF20100706，并對(duì)其部分基因序列進(jìn)行分析，研究基因變異情況。

該病毒在4℃條件下能凝集豚鼠、豬、雞和人“O”型紅細(xì)胞，這與CPIV血凝特性一致[13]:4℃或 25℃條件下能凝集雞、豬、兔、犬、豚鼠、羊、人“O”型血紅細(xì)胞；電鏡觀察期超微結(jié)構(gòu)呈園形、長(zhǎng)絲狀等不規(guī)則形態(tài)，與金昌德報(bào)道的一致[10]。

本研究從患犬組織中分離CPIV，并對(duì)N、HN和F基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，分析其變異情況。核苷酸和氨基酸同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示，與10株有代表性的副流感病毒N基因相比，核苷酸同源性為 95.7%～99.8%，氨基酸同源性為97.4%～99.6%。其中有兩處氨基酸發(fā)生新的變異，分別是第257位由V變成了A，第301位由A變成了T。其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號(hào)：JQ743324)同源性最低為97.4%，與犬源副流感病毒分離株08-1990(登錄號(hào)：KC237063)同源性最高為99.6%。HN基因分析顯示，與10株有代表性的副流感病毒H基因相比，核苷酸同源性為95.5～99.8%，氨基酸同源性為96.3～99.6%，其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號(hào)：JQ743324)同源性最低為95.5%，與犬源副流感病毒分離株D277(登錄號(hào)：KC237065)同源性最高為99.6%。與10株有代表性的副流感病毒F基因相比，該毒株F基因核苷酸同源性為94.7%～99.6%，氨基酸同源性為 95.6%～99.3%。有兩處發(fā)生特異變異，分別是56位由T變成了S，89位由T變成了M。其中與人源副流感病毒分離株LN(登錄號(hào)：JQ743324)同源性最低為95.6%，與犬源副流感病毒分離株08-1990(登錄號(hào)：KC237063)同源性最高為99.6%。F基因的遺傳變異對(duì)于CPIV的預(yù)防有著重要影響，特別是重要抗原位點(diǎn)的變化可能導(dǎo)致疫苗的免疫保護(hù)不全面，那么本分離株F基因的變異是否能導(dǎo)致疫苗的免疫保護(hù)不全或者增加CPIV毒力變化值得進(jìn)一步研究。N、HN和F基因序列分析還表明，犬副流感病毒流行毒株之間、氨基酸序列之間變化不大，但與其他相關(guān)毒株間差異相對(duì)較大，這與李長(zhǎng)磊等研究結(jié)果一致[14]。

成功分離一株犬副流感病毒，該病毒在25℃條件能吸附豚鼠、雞、豬和人O型血紅細(xì)胞。電鏡觀察顯示病毒為圓形、長(zhǎng)絲狀等形態(tài)多樣，大小不等的病毒粒子。N、HN和F基因序列分析顯示，該分離株與犬副流感病毒分離株08-1990(登錄號(hào)：KC237063)親緣關(guān)系最近；N基因氨基酸在第257位(由V變成了A)和第301位(由A變成了T)，F(xiàn)基因氨基酸在第56位(由T變成了S)和89位(由T變成了M)發(fā)生了特異性變異。

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Isolation and identification of canine parainfluenza virus and partial gene sequence analysis of the isolate

SUN Ming1, LIU Qiao-rong1, QIN Ya-man1, DENG Xiao-yu1, YANG Xin-yan1, LIU Bo-hua, CHEN Xi-Zhao1,2

(1. Beijing ANHEAL Laboratories Co. Ltd, Beijing 100094, China; 2. China Animal Disease Control Center, Beijing 100125)

【Abstract】ObjectiveTo isolate and identify canine parainfluenza virus (CPIV) from the a dog suspected of CPIV infection, then to analyze the gene sequence variation of N，HN and F genes and provide a molecular biology basis for the diagnosis, treatment, prevention and control of CPIV infection. Methods Samples of the lung tissue was taken from a dead dog suspected of CPIV infection, and were inoculated into Vero cells. CPE were observed after three blind passages, then the cell culture fluid after 72-hour-cultuere was assayed for further PCR identification, blood coagulation characteristics and morphological observation. Moreover, 3 pairs of oligonucleotide primers were designed, and N, HN and F complete genes of CPIV were amplified by RT-PCR from positive CPIV culture fluid. The genetic variation of the three genes were further analyzed by biological software, and phylogenetic trees were produced. ResultsOne strain of CPIV was isolated and named QF20100726. The results showed that the CPIV strain could agglutinate Guinea pig, pig,chicken and human o type blood cells,and had the basic ultrastructural chatacteristics of parainfluenza virus. Compared with 10 representative CPIV genes, N, HN and F gene phylogenetic analysis of the QF20100726 CPIV gene showed 95.7% to 99.8%, 94.7% to 99.6% and 94.7% to 99.6% nucleotide identity, respectively, and 97.4% to 99.6%, 96.3 to 99.6%, 95.6% to 99.3% amino acid identity, respectively. Of these aa substitutions, 2 substitutions (V208A, A301T) occurred in the N open reading frame (ORF), and 2 substitutions (T56S, T89M) occurred in the F open reading frame (ORF). ConclusionsOne strain QF20100726 of CPIv is successfully isolated, and the phylogenetic trees of N, HN and F genes from the QF20100726 CPIV strain show close phylogenetic relationship with other CPIV isolates. The data provide a valuable molecular biology basis for the studies on prevention and control of CPIV infection.

【Key words】CPIV, Viral isolation, Sequence analysis

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.016

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 02-0077-06

[作者簡(jiǎn)介]孫明(1963-)，男，博士，研究方向：分子病毒學(xué)診斷技術(shù)。Email： sunming@anheal.com。[通訊作者]陳西釗(1965-)，男，博士，研究員，研究方向：動(dòng)物傳染病與預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。Email： chenxizhao@anheal.com。