孫俊梅，龍晶晶，韓雁冰，蔡雪梅，陸　地，邊立功，郭家智，李　梅

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1. 神經(jīng)內(nèi)科；2.檢驗科， 昆明　650031；

3. 昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，昆明　650500)

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研究報告

靶向調(diào)控大鼠海馬CNN3基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

孫俊梅1，龍晶晶1，韓雁冰1，蔡雪梅2，陸地3，邊立功3，郭家智3，李梅1

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1. 神經(jīng)內(nèi)科；2.檢驗科， 昆明650031；

3. 昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，昆明650500)

【摘要】目的建立可調(diào)控大鼠局部腦區(qū)CNN3基因表達(dá)的技術(shù)，為進(jìn)一步研究CNN3基因參與腦內(nèi)病理生理過程奠定基礎(chǔ)。方法設(shè)計并合成針對CNN3基因的全長編碼序列cDNA和3條shRNA干擾靶點(diǎn)序列，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建CNN3-OE和3個CNN3-shRNA慢病毒載體，在立體定位儀引導(dǎo)下注入大鼠海馬，采用蛋白免疫印跡技術(shù)篩選CNN3基因的最佳沉默序列，并找出重組表達(dá)和沉默慢病毒載體調(diào)控海馬CNN3基因的變化規(guī)律。結(jié)果CNN3-OE和 3個CNN3-shRNA慢病毒干擾載體均構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染后8周內(nèi)對海馬CNN3基因水平均有一定調(diào)控作用，其中CNN3-shRNA2載體組在轉(zhuǎn)染后的8周內(nèi)海馬CNN3基因編碼蛋白calponin-3水平均顯著性下調(diào)，最高抑制率為73.26%；CNN3-OE慢病毒載體組中海馬calponin-3蛋白水平具有統(tǒng)計學(xué)意義的升高僅在轉(zhuǎn)染后第14天，上調(diào)率為93.88%。結(jié)論通過定位注射CNN3-OE和 CNN3-shRNA慢病毒載體可在體調(diào)控局部腦區(qū)CNN3基因表達(dá)，為后續(xù)的機(jī)制研究和開拓疾病防治新途徑奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】CNN3；基因; 沉默；重組；慢病毒載體

1995年Maguchi等[1]首次分離出CNN3基因，其編碼的calponin-3蛋白可與肌動蛋白、鈣調(diào)蛋白、肌鈣蛋白和原肌球蛋白結(jié)合，不僅分布在肝、肺、腎、肌肉、皮膚、卵巢[2-5]，還是calponin家族中唯一分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個亞型，在大腦、小腦和腦血管均有表達(dá)[6-8]，尤其是近年來研究顯示CNN3基因及calponin-3蛋白異?？赡芨淖兇竽X海馬內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)，甚至導(dǎo)致突觸重塑[9，10]。本課題組前期研究也觀察到CNN3基因和calponin-3蛋白在癲癇患者及大鼠大腦海馬組織和腦脊液內(nèi)表達(dá)水平顯著升高，提示可能參與癲癇發(fā)生，但具體機(jī)制尚未闡明[11]。其中的一個重要原因就是目前尚未建立可靶向沉默或過表達(dá)活體動物局部腦區(qū)的CNN3基因可靠技術(shù)。倘若能定向定量在體調(diào)控實(shí)驗動物腦內(nèi)CNN3基因表達(dá)水平，將對闡明CNN3基因功能、深入研究其在突觸重塑及癲癇等腦內(nèi)病理生理過程中的確切作用及開辟新的治療途徑等具有重要意義。因此我們將構(gòu)建針對大鼠CNN3基因的shRNA及過表達(dá)(OE)慢病毒載體，再通過活體定位局部注射靶向沉默或上調(diào)大鼠海馬CNN3基因表達(dá)水平，并進(jìn)行驗證。

1材料和方法

1.1主要試劑

感受態(tài)細(xì)胞DH5α、pGMLV-sc5 RNAi慢病毒載體、293T細(xì)胞(上海吉滿基因技術(shù)有限公司)；PCR用試劑primer(上海生工生物工程有限公司)；Taq polymerase(美國NEB公司)；Qiagen質(zhì)粒大抽試劑盒(德國Qiagen公司)；LB培養(yǎng)基(Alpha Aeser)；BSA、DMSO、MgSO4、Cacl2(美國Sigma公司)；胎牛血清、DMEM、胰酶(美國Gibco公司)； 瓊脂糖(美國Bio-Rad公司)；T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer、DNA ladder、BamH I、EcoR I、Xba I、Xho I(Fermentas)；RIPA(強(qiáng))裂解液、PMSF(100 mM)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1CNN3過表達(dá)(CNN3-OE)慢病毒載體的制備：

1.2.1.1引物設(shè)計與合成：在NCBI中找到CNN3基因序列并確定所用載體pGMLV-PA6。引物序列上游為：5′-CCG GAATTC GCCACC ATGGAC TACAAGGACGATGACGACAAGACCCACTTCAACAA GGGCC-3′，下游為：5′-CG GGATCC CTAGTAAT CGATGCCCTGGTCG-3′，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.1.2構(gòu)建步驟：①利用T4連接酶在22℃連接pGMLV-PA6載體與目的片段60 min。②將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入制備好的感受態(tài)細(xì)胞對長出的單克隆菌落先進(jìn)行 PCR鑒定，PCR鑒定陽性菌落進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2RNA干擾CNN3慢病毒載體的制備：

1.2.2.1CNN3基因shRNA表達(dá)模板序列設(shè)計與合成：在GenBank網(wǎng)站中查詢到目的基因CNN3的mRNA，參考RNA干擾序列設(shè)計原則，根據(jù)我們的設(shè)計經(jīng)驗和設(shè)計軟件進(jìn)行評估測定，設(shè)計3個RNA干擾靶點(diǎn)序列，并合成3對shRNA寡聚單鏈DNA，序列如下：CNN3-ShRNA1-1：5′-gatccGCAGACTGA CAAACCCTTTGATTCAAGAGATCAAAGGGTTTGTCA GTCTGCTTTTTTg-3′，CNN3-ShRN A1-2：5′-aattcAAA AAAGCAGACTGACAAACCCTTTGATCTCTTGAATCA AAGGGTTTGTCAGTCTGCg-3′；CNN3-ShRN A2-1：5′-gatccGGAGAACATCGGCAACTTTATAGAGAACTTAT AAAGTTGCCGATGTTCTCC TTTTTTg-3′，CNN3-ShRNA2-2：5′-aattcAAAAAAGGAGAACATCGGCAAC TTTATAAGTTCTCTATAAAGTTG CCGATGTTCTCCg-3′;CNN3-ShRNA3-1：5′-gatcc GGCCAAAGTGTAA TCGGTTTAAGAGAACTTTAAACCGATTACACTTTGG CCTTTTTTg-3′,CNN3-ShRNA3-2：5′-aattcAAAAAA GGCCAAAGTGTAATCGGTTTAAAGTTCTCTTAAACC GATTACACTTTGGCCg-3′。

1.2.2.2shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定：① 用無菌的TE buffer 稀釋引物使終濃度為100 μmol/L。分別吸取10 μL的上下游引物混合并吹打均勻放入PCR管內(nèi)，94℃水浴緩慢退火冷卻至室溫。②質(zhì)粒用BamH I、EcoR I雙酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，回收大片段。③在25℃中，利用T4連接酶將退火產(chǎn)物和線性化質(zhì)粒載體pGMLV-SC5連接過夜。④連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)菌液PCR鑒定陽性菌落進(jìn)行測序和比對分析。

1.2.3慢病毒質(zhì)粒的包裝和滴度測定：轉(zhuǎn)染前1 d，將已經(jīng)長好的293T細(xì)胞以合適的比例傳代到10 cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前1～2 h將需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)基，按shRNA轉(zhuǎn)染體系：DMEM 1 mL、shRNA 10 μg、Lenti-HGMix 10 μL、HG transgene reagent 60 μL;過表達(dá)轉(zhuǎn)染體系：DMEM 1 mL、過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒 10 μg、Lenti-HGMix 10 μL、HG transgene reagent 60 μL混合均勻，室溫放置15～20 min，將混合液分別滴入293T細(xì)胞中，混勻后置于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染10～12 h后加100* enhancing buffer促進(jìn)轉(zhuǎn)染，接著8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液。病毒濃縮純化使用離心超濾裝置(美國Millipore公司)，濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，分裝后保存于-80℃。取其中1支使用逐孔稀釋滴度測定法進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測定，并計算病毒滴度。

1.2.4CNN3基因沉默/過表達(dá)鼠模型的建立：

1.2.4.1實(shí)驗動物：實(shí)驗鼠購自成都達(dá)碩實(shí)驗動物有限公司(動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-24)，均為SPF級、健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，6周齡，體重180～220 g，隨機(jī)分為空pGMLV-SC5載體(shRNA陰性對照)組，干擾序列1的慢病毒載體簡稱為shRNA1組，干擾序列2的慢病毒載體簡稱為shRNA2組，干擾序列3的慢病毒載體簡稱為shRNA3組，空pGMLV-PA6載體(過表達(dá)陰性對照)組，CNN3-OE組簡稱OE組。

1.2.4.2慢病毒載體轉(zhuǎn)染：通過立體定位注射方法將3個CNN3-shRNA、CNN3-OE慢病毒載體及各自對照的空載體轉(zhuǎn)染至各組實(shí)驗鼠海馬。按0.4 mL/100 g劑量的7.2%的水合氯醛注入大鼠腹腔，待麻醉生效后將大鼠頭部固定在立體定位儀上，備皮、暴露骨縫，用3%的雙氧水止血洗潔。參考大鼠立體定位圖譜，把前囟定為零點(diǎn)，設(shè)定前囪后3.6 mm、中線旁開2 mm處為海馬穿刺靶點(diǎn)。將電鉆自穿刺靶點(diǎn)處鉆開顱骨，用微量進(jìn)樣器抽取2 μL慢病毒濃縮液并將其在立體定位儀上固定好，自鉆孔部位緩慢進(jìn)針至顱骨表面下3.5 mm，勻速緩慢(0.2 μL/min)注入慢病毒載體，注射完畢后針頭留置10 min，再緩慢拔出。同樣的方法進(jìn)行對側(cè)海馬的注射結(jié)束后縫合切口，手術(shù)后大鼠自由進(jìn)食和休息。

1.2.5檢測慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率：采用免疫印跡(Western blot)實(shí)驗對各組慢病毒載體轉(zhuǎn)染后實(shí)驗鼠海馬的CNN3基因調(diào)控蛋白calponin-3進(jìn)行定量。首先在注射慢病毒載體后的第1、3、7、10、14天，隨機(jī)從shRNA1、shRNA2、shRNA3、OE及2個對照組中抽取實(shí)驗鼠處死后分離出海馬，用RIPA裂解液(含PMSF，體積之比為RIPA:PMSF=100:1)按每100 mg組織加1 mL RIPA裂解液的比例，在冰上勻漿約30 min，然后4℃下12 000 r/min離心15 min取上清液，用BCA法測定蛋白濃度，使用Image J軟件分析處理，取β-actin 作為內(nèi)參，用calponin-3與β-actin的光密度比值表示calponin-3蛋白的相對表達(dá)量。然后通過統(tǒng)計學(xué)方法將3個CNN3-shRNA組和shRNA陰性對照組的實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，找出沉默大鼠海馬CNN3基因的最佳shRNA干擾序列。

為明確CNN3基因沉默/過表達(dá)效果持續(xù)時長，延長轉(zhuǎn)染最佳shRNA干擾和過表達(dá)慢病毒載體鼠的觀察時間，在第1、2、4、6、8周時處死取材， Western blot定量檢測各時間點(diǎn)中實(shí)驗鼠海馬calponin-3蛋白表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

因所有試驗都重復(fù)3次，為避免每次Western blot實(shí)驗曝光時造成的條帶深淺不一干擾，我們將3次實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行歸一化處理后再采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組多重比較使用One-way ANOVA 單因素方差分析，方差齊時使用LSD 統(tǒng)計方法進(jìn)行組間兩兩比較差異有無統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05時判為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基因測序分析

經(jīng)過比對，3個shRNA重組克隆中插入的片段序列與設(shè)計的oligo序列完全一致,無堿基缺失或錯誤(圖1A-C)，表明CNN3-shRNA1、CNN3-shRNA2和CNN3-shRNA3慢病毒載體均構(gòu)建成功。CNN3-OE慢病毒載體中插入片段序列與目的片段序列完全一致，無堿基缺失或錯誤(圖1D)，表明過表達(dá)慢病毒載體也成功構(gòu)建。

注：A圖為CNN3-shRNA1慢病毒載體，B圖為CNN3-shRNA2慢病毒載體，C圖為CNN3-shRNA3慢病毒載體，D圖為CNN3-OE慢病毒載體。圖1　慢病毒載體的測序結(jié)果Note. A indicates CNN3-shRNA1 vector; B indicates CNN3-shRNA2 vector; C indicates CNN3-shRNA3 vector; A indicates CNN3-OE vector. Fig.1　Sequencing results of the lentiviral vectors targeted CNN3 gene.

2.2慢病毒滴度的測定

經(jīng)熒光計數(shù)法測得重組慢病毒CNN3-shRNA1、CNN3-shRNA2、CNN3-shRNA3的滴度均為2×109TU/mL，慢病毒CNN3-OE的滴度是2×108TU/mL，CNN3-shRNA和CNN3-OE的陰性對照空載體病毒的滴度均為2×108TU/mL。

2.3Western blot實(shí)驗結(jié)果

首先對比了CNN3-shRNA1、CNN3-shRNA2、CNN3-shRNA3、CNN3-OE慢病毒載體與相應(yīng)的對照空載體分別被轉(zhuǎn)染到SD大鼠海馬后1、3、7、10和14 d的calponin-3與內(nèi)參的光密度比值。結(jié)果顯示：與對照組相比， 轉(zhuǎn)染后14 d內(nèi)3個shRNA組海馬的calponin-3蛋白水平均下調(diào)，尤其是在轉(zhuǎn)染后第10、14和3天， shRNA1、shRNA2、shRNA3對calponin-3表達(dá)的抑制程度最高，分別達(dá)到36.78%、73.26%、39.96%，均具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外， shRNA2組海馬的calponin-3蛋白水平在慢病毒載體轉(zhuǎn)染后呈進(jìn)行性降低，而shRNA1和shRNA3組的calponin-3蛋白抑制反應(yīng)不穩(wěn)定(圖2A-C)；過表達(dá)的OE組的calponin-3蛋白在慢病毒轉(zhuǎn)染后表達(dá)水平呈進(jìn)行性升高，在第14天時達(dá)到最高，較對照組升高93.88%，兩組間具有顯著性差異(P<0.05)(圖2D)。

注：A圖為CNN3-shRNA1慢病毒載體組與空pGMLV-SC5載體轉(zhuǎn)染組比較；B圖為CNN3-shRNA2慢病毒載體組與pGMLV-SC5載體轉(zhuǎn)染組比較；C圖為CNN3-shRNA3慢病毒載體組與pGMLV-SC5載體轉(zhuǎn)染組比較；D圖為CNN3-OE慢病毒載體組與空pGMLV-PA6載體轉(zhuǎn)染組比較。左圖均為代表性的Western blot結(jié)果圖，右圖均為統(tǒng)計分析結(jié)果。Ctl：陰性對照組； *：p<0.05。圖2　各種慢病毒載體轉(zhuǎn)染14天內(nèi)后實(shí)驗鼠海馬calponin-3蛋白的表達(dá)變化。Note. (A) shows CNN3-shRNA1 vs. the control pGMLV-SC5 vector; (B) shows CNN3-shRNA2 vs. the control pGMLV-SC5 vector; (C) shows CNN3-shRNA3 vs. the control pGMLV-SC5 vector; (D) shows CNN3-OE vs. the control pGMLV-PA6 vector. The left figures show the representative results of Western blot. The right figures are the results of statistical analysis. Ctl: negative control; *：P<0.05.Fig.2　Changes of the expression of calponin-3 protein in the hippocampus of rats within 14 days after transfection with various lentiviral vectors targeted CNN3 gene.

基于14 d內(nèi)針對CNN3基因ShRNA2組和OE組的calponin-3蛋白降解/上調(diào)幅度最大，均明顯超過50%，而且此效應(yīng)似與時長呈負(fù)/正相關(guān)(圖2B, 2D)，因此將這兩組的觀察時間延長至轉(zhuǎn)染后8周。結(jié)果顯示，CNN3-ShRNA2慢病毒載體對CNN3基因的抑制效果可持續(xù)到8周，且各時間點(diǎn)的calponin-3蛋白變化差異均具有顯著性。CNN3-OE慢病毒載體的過表達(dá)效果也可持續(xù)8周，但統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示僅在第14天時過表達(dá)效應(yīng)與對照組相比具有顯著性差異(圖3)。

注：A圖為CNN3-shRNA2慢病毒載體組與空pGMLV-SC5載體轉(zhuǎn)染組比較；B圖為CNN3-OE慢病毒載體組與空pGMLV-PA6載體轉(zhuǎn)染組比較。左圖均為代表性的Western blot結(jié)果圖，右圖均為統(tǒng)計分析結(jié)果。 Ctl：陰性對照組； *：p<0.05。圖3　CNN3-shRNA2和CNN3-OE慢病毒載體轉(zhuǎn)染1～8周后calponin-3蛋白的表達(dá)變化。Note. (A) shows CNN3- shRNA2 vs. the control pGMLV-SC5 vector; (B) shows CNN3-OE vs. the control pGMLV-PA6 vector. The left figures show the representative results of Western blot. The right figures are the results of statistical analysis. Ctl: negative control; *：P<0.05.Fig.3　Changes of the expression of calponin-3 protein in the hippocampus of rats from 1-8 weeks after transfection with the lentiviral vectors of CNN3-shRNA2 or CNN3-OE.

3討論

自CNN3基因及其編碼蛋白calponin-3被發(fā)現(xiàn)以來，各國研究者開展了機(jī)制研究，但除Flemming等采用基因敲除鼠研究B細(xì)胞發(fā)育[5]外，其余都是構(gòu)建慢病毒載體后轉(zhuǎn)染神經(jīng)元、表皮成纖維母細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層、肌原細(xì)胞等細(xì)胞模型[2-4，10]。然而腦部結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，僅腦細(xì)胞就有上百億，腦細(xì)胞又分為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞兩大類，相互之間還形成多種已知和未知的功能連接，所以僅有神經(jīng)元模型遠(yuǎn)不能滿足基因功能研究的需要，還需建立實(shí)驗動物模型以模擬各種生理病理過程[12,13]。在本研究中，我們設(shè)計、構(gòu)建大鼠CNN3基因的沉默及過表達(dá)慢病毒載體后，在立體定位儀引導(dǎo)下進(jìn)行活體定位注射，使大鼠海馬calponin-3蛋白表達(dá)水平顯著下降/上調(diào)50%以上，且這種高效的干擾效應(yīng)一直持續(xù)到第8周，表明該技術(shù)完全適用于動物模型的基因功能研究。

脂質(zhì)體法、電轉(zhuǎn)法和以腺病毒或慢病毒為載體的感染法是將外源性基因?qū)塍w外培養(yǎng)細(xì)胞的4種常用方法。脂質(zhì)體法、電轉(zhuǎn)法和腺病毒載體感染法這3種方法在原代細(xì)胞、干細(xì)胞、懸浮細(xì)胞中的感染效率極低，而且僅能瞬時感染，無法使目的基因在目的細(xì)胞持久表達(dá)或維持干擾的效果，故不適用于體內(nèi)實(shí)驗。而慢病毒載體的出現(xiàn)較好地解決了上述問題：首先，慢病毒對神經(jīng)元等非常難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞依舊有較高的轉(zhuǎn)染效率；其次，慢病毒載體上含有抗生素標(biāo)記基因，通過抗生素篩選即可獲得穩(wěn)定株，利于下游實(shí)驗的進(jìn)行；更為重要的是，慢病毒可將外源性基因有效地整合到宿主染色體上從而達(dá)到持久性表達(dá)，適合活體動物模型的基因操作，因此盡管我們選擇的CNN3基因靶點(diǎn)序列和其他課題組報道的都不一樣，但是將其克隆入shRNA/過表達(dá)慢病毒載體后，均成功沉默/上調(diào)大鼠腦內(nèi)CNN3基因，而且在轉(zhuǎn)染后8周基因沉默/過表達(dá)的效應(yīng)仍持續(xù)存在，為后續(xù)實(shí)驗提供穩(wěn)定的CNN3基因干擾動物模型。此外，與基因敲除/敲入通過改變DNA序列來達(dá)到基因功能的“全或無”不同[14]，基因沉默/過表達(dá)技術(shù)不改變DNA序列，可將基因水平調(diào)控在更多水平，最重要的是該技術(shù)操作更簡單、費(fèi)用更低,對開展基因功能學(xué)的動物研究和開辟新的基因治療方法更為實(shí)用。

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〔修回日期〕2015-11-23

Construction and identification of lentivirus-mediated vectors targeting CNN3 gene in the rat hippocampus

SUN Jun-mei1, LONG Jing-jing1, HAN Yan-bing1, CAI Xue-mei2, LU Di3, BIAN Li-gong3, GUO ia-Zhi3, LI Mei1

(1. Department of Neurology, 2. Department of Clinical Laboratory,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, 650031, China;3. Biomedical Engineering Research Center, Kunming Medical University, Kunming, 650500)

【Abstract】ObjectiveTo establish a method focusing on regulation of CNN3 gene in the rat hippocampus and help to explore the role of CNN3 gene played in the brain physiology and pathology. Methods One cDNA sequence and three shRNAs targeting CNN3 gene were designed and synthesized. The recombinant lentivirus-mediated expressing and three short hairpin RNA (shRNA) vectors targeting CNN3 gene in the rats were constructed with engineering technology. All recombinant vectors were intravenously injected into rats hippocampi guided by stereotaxic apparatus. Western blot was performed to explore the best shRNA and to study the changes of CNN3 gene in the rat hippocampus after transfection with the silence and over-expressed vectors. ResultsThe lentivirus-mediated vector expressing CNN3-OE and three shRNA vectors targeting CNN3 gene were successfully constructed. Within eight weeks after transfection, the vectors of CNN3-OE and three CNN3-shRNAs changed the expression of CNN3 gene in the rat hippocampus, in particular, all the protein levels of calponin-3 encoded by CNN3 gene were significantly down-regulated along with the time, with the highest inhibitory rate of 73.6% in the CNN3-shRNA2 group. Significant up-regulation of calponin-3 protein level by 93.88%, was found only on the 14th day after transfection. ConclusionsLentivirus-mediated vectors of CNN3-OE and CNN3-shRNAs may regulate in vivo the CNN3 gene level in the local brain region of rats via stereotactic injection.The study lays a foundation for disease prevention and treatment in the future.

【Key words】CNN3; Gene; Silencing; Recombination; Lentiviral vector

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.012

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 02-0055-07

[作者簡介]孫俊梅(1989-)，女，研究生，專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)。E-mail: 675181708@QQ.com。[通訊作者]韓雁冰(1972-)，女，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：癲癇的發(fā)病機(jī)制和臨床防治。E-mail: ynhyb@163.com。

[基金項目]國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金(81260199)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合基金(2012FB030)；云南省衛(wèi)生科技計劃項目(2012WS0002)。