任目瑾，周建峰

(陜西省苗木繁育中心，陜西 眉縣 722305)

植物組織培養(yǎng)的常見污染及其防控技術

任目瑾，周建峰

(陜西省苗木繁育中心，陜西 眉縣 722305)

在分析植物組織培養(yǎng)污染分類、污染原因基礎上，提出了外殖體選擇、采集、預培養(yǎng)、清洗消毒等外植體污染防控措施，熏蒸消毒、紫外燈照射滅菌、設備器械消毒等環(huán)境污染防控措施，操作人員衛(wèi)生、操作規(guī)程執(zhí)行等操作污染防控措施。

植物；組織培養(yǎng)；污染；管理

植物組織培養(yǎng)是利用細胞的全能性通過無菌操作把植物體的外植體接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的環(huán)境條件下進行離體培養(yǎng)的一套技術和方法。隨著科技的發(fā)展，這項技術已越來越多地應用于植物快繁、種質保存和遺傳改良。植物組織培養(yǎng)是在無菌條件下進行的，盡管各個環(huán)節(jié)的操作有嚴格的要求，但是污染還是經常發(fā)生，甚至影響到實驗的成敗和規(guī)?；a。污染的出現增加了成本，浪費了資源，延誤了時間，影響了工作效率。因此，分析植物組織培養(yǎng)中的污染種類，提出相應防控措施，對這項技術的推廣利用具有重要意義。

1 污染分類

污染是指在培養(yǎng)過程中由于外界真菌、細菌或培養(yǎng)材料的內生菌所侵染，而使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗的現象。按污染種類分為細菌污染、真菌污染和病毒污染。

細菌是所有微生物中數量最多的一類，無孔不入，泥土里、水里、空氣里都散布著細菌，或者與其他生物共生，形狀各異，大小不一。細菌污染的特點是在培養(yǎng)基表面或材料表面出現黏液狀物體、菌落或者是渾濁的水跡狀，有時甚至出現泡沫發(fā)酵狀，一般在接種1～2d即能發(fā)現，菌落小，表面呈乳脂狀光澤，一般有臭味。細菌污染主要來源于接種材料及工具。細菌污染占52.13%[1]，通常有球菌和芽孢桿菌等[2]。

真菌喜歡溫暖潮濕的環(huán)境。真菌污染的特點是菌斑呈絨毛狀、絮狀，界限不明顯，伴有不同顏色的孢子，一般在接種3～10d后才能發(fā)現，菌落大，顏色多樣，表面呈毛絨狀，一般有霉味。真菌的污染主要來源于環(huán)境。真菌中通常有青霉菌、芽枝霉菌、黑曲菌和酵母菌等[2]。

病毒顆粒特別微小，所以病毒污染的概率比較小。病毒肉眼看不到，污染難于發(fā)現，用電子顯微鏡才能觀察到。由于病毒一般潛伏在細胞內，對整個細胞培養(yǎng)不會致死。多數病毒來源于外植體本身。

2 污染原因

組織培養(yǎng)中的污染原因很多，主要有外植體污染，外植體消毒不過關，組織培養(yǎng)中的設備、儀器、工具消毒滅菌不徹底，接種環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境不清潔[3]，操作人員衛(wèi)生習慣不良，不能對原瓶苗污染情況仔細辨認，培養(yǎng)材料攜帶內生菌；不能嚴格地執(zhí)行消毒流程等等。

3 污染的防控措施

3.1 外植體的污染

3.1.1 外殖體的選擇和采集 為減少外植體污染，要從外植體采集源頭注意防控，不同環(huán)境下的外植體其帶菌程度不同。分生組織生長快，細菌幾乎來不及感染，因此挽救瀕臨的植物、需要脫毒的植物都采用分生組織進行組織培養(yǎng)，可大大較少污染。一般情況下外植體的采集時間選擇在春季晴天的中午，盡可能選擇溫室內的植株或新生嫩芽。因為春季萬物復蘇，蘊藏了一冬的新芽開始萌發(fā)，比其它任何季節(jié)污染都少，晴天陽光可以殺死一部分細菌，下雨天濕度大，植株上殘留水分多，污染幾率大，溫室內植物比露天植物帶菌少，新生嫩芽比老芽裸露時間短，帶菌少。另外采集前人手、工具、用具必須用75%的酒精進行消毒，以免產生污染。

3.1.2 外植體的預培養(yǎng) 如果室外栽培的材料污染太嚴重，可先將植物樣本挖出，改為室內盆栽，種植到蛭石或珍珠巖中，按要求控制生長，可使用抗生素，不要施肥，澆水時水不能濺到葉片上，保持稍強光照(不灼燒葉片為宜)，濕度保持在50%～60%的環(huán)境，待抽出新芽，有條件的進行細菌病毒檢測，沒有細菌的可做為外植體。不便移栽的植株，可套塑料袋，待長出新枝條后，再行采樣。也可將田間采集的枝條用水沖洗干凈后插入無糖的液體培養(yǎng)液或自來水中使其發(fā)枝，以這種新抽的嫩枝作為外植體，可大大減少內源菌的污染。

有些植株可進行黃化處理，采集田間的枝條放在無菌條件下，進行暗培養(yǎng)，待抽出徒長的黃化枝條時取材，可減少污染。

3.1.3 外植體的清洗消毒 外植體表面消毒既要求將外植體表面的微生物徹底殺死，又要求盡可能少傷害外植體組織和表層細胞。外植體采回來后，先用自來水沖掉表面的灰塵和雜物，剪掉不要的枝、葉等組織，放入燒杯中用洗潔精水浸泡3min，再用水沖洗干凈，流水下再沖洗30min。然后帶進無菌操作臺，用75%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗一遍，再用次氯酸鈉、次氯酸鈣或0.1%的升汞浸泡10～30min(視植株品種、幼嫩程度而定)，無菌水再沖洗5遍。升汞的消毒效果是最好的。但應當記住， 消毒劑是對植物有毒害作用的。應正確選擇消毒劑的種類、濃度和處理時間，盡量減輕對外植體的傷害。

3.2 環(huán)境的污染

3.2.1 熏蒸消毒 組織培養(yǎng)室在啟動生產前，進行熏蒸處理，甲醛用量4～6ml·m-3,高錳酸鉀3～6g·m-3配比液熏蒸。使用時，先關閉所有的門窗，分別量取好需要的甲醛和高錳酸鉀，將甲醛溶液倒入裝有高錳酸鉀的容器中，立刻會有煙霧產生，操作人員應避開煙霧馬上離開，熏蒸30min即可，將室內環(huán)境的真菌減少87%～100%[4]。以后每月一次熏蒸。

3.2.2 紫外燈照射滅菌 培養(yǎng)架保持整潔干凈無雜物，污染物品和污染培養(yǎng)基應及時清理出培養(yǎng)室，培養(yǎng)室和接種室每天用次氯酸鈉消毒液進行地面消毒，每次接種前要用75%的酒精噴灑室內，使灰塵落地，防止微笑塵粒飛揚，然后紫外燈照射30min[5]。

3.2.3 設備器械的消毒 每天使用的工具、用具提前進行滅菌處理，操作臺每次使用前用紫外燈照射30min，然后用75%的酒精噴濕脫脂棉擦拭操作臺內的各個面，每月更換操作臺上的過濾網，保持操作臺上干凈整潔，不能堆放不需要的物品，長期未使用的操作臺使用前要進行徹底清洗消毒，每月用培養(yǎng)皿放培養(yǎng)基檢測操作臺的潔凈度和高壓滅菌鍋的滅菌效果。高壓滅菌鍋如果滅菌不徹底，培養(yǎng)基也會出現污染，除嚴格執(zhí)行操作規(guī)程外應每月用測試帶檢測滅菌效果。接種用的刀、鑷子、剪刀等一般采用干熱滅菌法,使用前用酒精棉球擦拭,并在火焰上灼燒,然后冷卻備用[6],玻璃器皿、工作服等用濕熱滅菌法，用報紙或棉布包好，放入高壓滅菌鍋，等壓力穩(wěn)定在0.105MPa,溫度為121℃的條件下,維持18～20min,時間,冷卻后備用。

3.3 操作污染的管理

3.3.1 操作人員衛(wèi)生 操作污染控制首先要從工作人員衛(wèi)生入手。操作人員應養(yǎng)成常剪指甲、勤洗澡的衛(wèi)生習慣，進入無菌區(qū)不能戴戒指，不能吃東西，不能喝水，不能聽音樂，禁止吸煙，工作服里外要分開，里面的只能在實驗室穿，更衣室保持整潔干凈，每天用消毒水拖地消毒；工作服每周清洗消毒一次，夏季每三天清洗消毒一次，口罩、帽子要非常干凈，一次性用品要及時更換；進入無菌室前要用肥皂洗手，換好實驗室的衣服和鞋之后用消毒液對雙手進行消毒，進入培養(yǎng)室再次用75%的酒精對雙手進行消毒。

3.3.2 操作規(guī)程的執(zhí)行 操作污染是組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)中最普遍的污染，也是可以控制的污染，操作人員除養(yǎng)成良好地衛(wèi)生習慣外，還要嚴格執(zhí)行操作規(guī)程和消毒流程。

(1) 配制室

每一月重新配制母液和激素，培養(yǎng)基一般提前2天配制，化學藥品4℃保存，定期檢查pH計、天平、溫度計等、不能使用過期及質量不好的藥品，高壓滅菌鍋爐嚴格執(zhí)行操作規(guī)程。

(2)培養(yǎng)室

溫濕度和光照要控制在適宜的范圍內，溫度25±1℃，濕度40%，光照1 500～3 000Lux，按時記錄溫濕度，及時調整，如果濕度過高，可使用空調“除濕”功能，保持室內濕度適宜，也可減少真菌生長繁殖，濕度過低可采用加濕器進行加濕。不定時檢查燈管，及時更換，保證光照強度。

(3)操作室

每天酒精噴灑后，紫外燈消毒30min，用消毒液對地面進行清理消毒，定期檢測操作臺的潔凈度，工具、用具的擺放位置，工具的滅菌時間等。

(4)操作過程

每次使用前對操作臺進行全面消毒，用75%的酒精把脫脂棉噴濕，然后按照從上到下，從里到外，從左到右的順序把操作臺的每個面擦拭一遍，可以重復擦但不能有遺漏的地方，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，注意操作時的先后順序，工具的使用方法，瓶口的朝向等等。

[1] 方麗,王連平,茹水江，等. 植物組培過程中污染微生物種類及其季節(jié)性的變化[J].浙江農業(yè)學報，2013，25(2)：284-287.

[2] 鄧小梅.植物組織培養(yǎng)過程中污染現象的研究進展[J].江西林業(yè)科技,2004(6):33-36.

[3] 胡凱，張立軍，白雪梅，等.植物組織培養(yǎng)污染原因分析及外植體的消毒[J].安徽農業(yè)科學,2007，35(3): 680-681.

[4] 汪一婷.工廠化組培苗的污染及控制研究[J].安徽農業(yè)科學,2005,33(12):2357-2358.

[5] 徐連峰.林木組織培養(yǎng)及工廠化育苗中污染的控制技術[J].防護林科技,2005,66(3):119-120.

[6] 杜雪玲,張振霞,余如剛,等.植物組織培養(yǎng)中的污染成因及其預防[J].草業(yè)科學,2005(1)：24-28.

Contamination Control measures in Plant Tissue Culture

RENMu-jin,ZHOUJian-feng

(Shaanxi Seedling Reproduction Center, Mei County, Shaanxi 722305)

Contaminationsintheprocessofplanttissueculturewereclassifiedbasedonsourcesandreasons.Explantsselection,collectionandsterilizationaswellascontaminationcontrolmeasureslikesteaming,ultravioletlampandequipmentsterilizationwerehighlighted.Relevantregulationsforworkersandoperationprocedurestopreventcontaminationwereanalyzedinlightofthecontaminationtypesandreasons.

Plant;tissueculture;contamination;control

2016-07-15 作者簡介：任目瑾(1969-),女，本科，工程師，主要從事植物組織培養(yǎng)和溫室花卉栽培。

Q

A