高 娜，亢澤峰，褚文麗，陶方方

·論著：實驗研究·

加減駐景方含藥血清對CoCl2誘導ARPE-19細胞表達VEGF及HIF-1α的影響

高 娜1，亢澤峰2，褚文麗2，陶方方2

目的探討加減駐景方含藥血清對二氯化鈷（CoCl2）誘導后人視網膜色素上皮細胞（ARPE-19細胞系）中血管內皮生長因子（VEGF）及缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）蛋白表達的影響。方法1.體外培養(yǎng)ARPE-19細胞，取對數生長良好的細胞用于實驗，分為正常組，缺氧模型組，陽性對照組、含藥血清組，并設立不同時間點。2.酶聯免疫吸附試驗（ELISA）觀察CoCl2誘導后不同時間、各組細胞上清液中HIF-1α的表達。3.蛋白質印跡法（Western blot）觀察CoCl2誘導后不同時間、各組細胞中VEGF、HIF-1α的表達情況。結果缺氧損傷后可誘導ARPE-19細胞中VEGF、HIF-1α蛋白的表達增加；與正常組比較，缺氧模型組VEGF及HIF-1α的表達高于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；含藥血清組與模型組比較，VEGF及HIF-1α的表達低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論加減駐景方含藥血清對缺氧損傷后ARPE-19細胞中VEGF、HIF-1α蛋白的表達有抑制作用。

加減駐景方；視網膜色素上皮細胞；血管內皮生長因子；低氧誘導因子

研究表明脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）的發(fā)生中，由于炎癥及缺氧致局部微環(huán)境的改變，導致視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）增加，促進了CNV的發(fā)生[1]。其中缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α）相關信號轉導通路是脈絡膜新生血管形成過程中的重要通路之一，是調控VEGF高表達的主要信號通路。我們在前期臨床觀察及動物實驗的研究中發(fā)現，中藥加減駐景方能促進黃斑出血的吸收，提高視力，改善視功能，并能抑制CNV的產生[2-4]。在進一步對ARPE-19細胞缺氧模型的研究中發(fā)現，加減駐景方含藥血清能抑制ARPE-19細胞的增殖。為了進一步探討加減駐景方含藥血清是如何調控VEGF的表達及抑制CNV形成的機制，本實驗觀察了加減駐景方含藥血清對CoCl2誘導的ARPE-19細胞表達VEGF及HIF-1α蛋白的影響，為臨床中醫(yī)治療CNV提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

正常健康SD大鼠20只[北京市維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001]，體質量150～170 g，雄性。在動物房適應生活1周后開始實驗。所有動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院實驗動物中心屏障級動物房內，恒溫恒濕，普通飲食及飲水喂養(yǎng)，循環(huán)光照（光照12 h，黑暗12 h），SPF飼養(yǎng)條件，溫度（22±2）℃。ARPE-19細胞（購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，批號：ATCCRCRL-2302TM）。

1.2 主要藥品、試劑及儀器

加減駐景方由楮實子、枸杞子、菟絲子、三七粉等組成（中藥飲片由北京燕北藥材公司提供，中藥水煎液由中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院煎藥室制備）?？蛋匚髌昭塾米⑸湟海ǔ啥伎岛肷锟萍加邢薰荆枺篠20130012，10 mg/ml，0.2 ml/支）。

MEM培養(yǎng)液（Hyclon公司）；胎牛血清（GIBCO公司）；二氯化鈷（北京化工公司）；人血管內皮生長因子酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；HIF-1α ELISA試劑盒（cloudclone corp）；蛋白定量（BCA法）試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；抗HIF-1α抗體AB5382-100 μg（Millipore）；抗VEGF抗體ABS82-100 μg（Millipore）；RIPA裂解緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司）；蛋白酶抑制劑混合物（北京普利萊基因技術有限公司）；電泳緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司）；轉膜緩沖液（北京普利萊基因技術有限公司）。

主要儀器設備：5%二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo electron corporation）；熒光倒置顯微鏡（Olympus，IX81）；4℃離心機（Germany）；電泳儀（BIO-RAD，USA）；紫外分光光度計（BIO-RAD，USA）；GE-ImageQuant-LAS-4000化學發(fā)光成像分析儀（GE Healthcare）。

1.3 含藥血清的制備方法

正常健康SD大鼠20只，按奇偶數隨機分成加減駐景方含藥血清組和空白血清組，每組10只。含藥血清組給予加減駐景方灌胃，灌胃體積均為20 ml/kg，每日2次，連續(xù)給藥3 d?？瞻籽褰M給予等量的蒸餾水溶液。末次給藥1 h后腹腔注射鹽酸氯胺酮35 mg/kg與鹽酸賽拉嗪5 mg/kg的混合液麻醉，無菌條件下腹主動脈采血，常溫靜置、離心、取上清液、滅菌、過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA法檢測細胞上清液中HIF-1α蛋白

按常規(guī)細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)ARPE-19細胞，取對數生長期良好的8代細胞用于實驗。分為正常組，缺氧模型組（100 μmol/L，CoCl2），康柏西普陽性對照組（20 μg/ml康柏西普）、加減駐景方含藥血清組（20%）。37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的MEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再次棄培養(yǎng)液，根據分組不同，正常組加不含胎牛血清的MEM，其他各組分別加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，每個濃度、時間段各設6個復孔。各組分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液于離心管內，樣品檢測前存儲于-80℃?zhèn)溆?。按照人HIF-1α ELISA檢測試劑盒說明進行檢測。實驗重復3次。

1.5 Western blot法檢測細胞中VEGF及HIF-1α蛋白

細胞的培養(yǎng)、分組、干預方法同上述實驗，采用細胞裂解提取細胞總蛋白，按BCA法測樣本蛋白質濃度，按照Western blot實驗步驟，以β-actin為內參，計算VEGF及HIF-1α蛋白的相對表達量。

1.6 統計學方法

應用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，計量資料以x±s表示，采用重復測量資料的方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA法檢測HIF-1α蛋白的表達情況

各組ARPE-19細胞在不同培養(yǎng)時間細胞上清液中的HIF-1α含量的總體差異不同（重復測量資料的方差分析，F分組=147.839，P＜0.001；F時間=895.702，P＜0.001；F交互作用=3.215，P＜0.05），缺氧組HIF-1α水平明顯高于正常組（P＜0.001），含藥血清組、康柏西普陽性對照組的HIF-1α數值與正常組較為接近（P＞0.05）（表1，圖1）。

表1 ELISA法檢測各組ARPE-19細胞上清液中HIF-1α的含量（x±s）

圖1 各組ARPE-19細胞在不同培養(yǎng)時間細胞上清液中HIF-1α含量的變化情況HIF-1α：缺氧誘導因子-1α

2.2 Western blot檢測VEGF及HIF-1α蛋白的表達情況

各組ARPE-19細胞中VEGF表達的變化趨勢比較接近（隨培養(yǎng)時間延長逐漸增高），且不同組間以及不同時點之間均存在統計學意義的差異（重復測量資料的方差分析，F分組=18.261，P＜0.01；F時間= 113.018，P＜0.001；F交互作用=0.615，P=0.715）。模型組細胞中的VEGF含量高于其他三組（P＜0.001），而正常組、康柏西普組及含藥血清組細胞中的VEGF水平整體上差異不大（表2，圖2～圖3）。

表2 Western blot法檢測各組ARPE-19細胞中VEGF的相對表達量（x±s）

圖2 Western blot法檢測各組ARPE-19細胞中VEGF表達的電泳圖。1～3、4～6、7～9、10～12分別為正常組、缺氧模型組、康柏西普陽性對照組、加減駐景方含藥血清組在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時的結果VEGF：血管內皮生長因子

圖3 Western blot法檢測各組ARPE-19細胞在不同培養(yǎng)時間VEGF相對表達量（VEGF/β-actin）的變化情況VEGF：血管內皮生長因子

各組不同時間細胞中HIF-1α的變化情況與VEGF的變化相似，組間以及各時點間的總體差異均有統計學意義（重復測量資料的方差分析，F分組= 54.186，P＜0.001；F時間=355.808，P＜0.001；F交互作用= 1.210，P=0.355）。與VEGF類似，模型組細胞中HIF-1α表達水平明顯高于其他三組（P＜0.001），而其他三組的HIF-1α水平十分接近（表3，圖4～圖5）。

表3 Western blot法檢測各組ARPE-19細胞中HIF-1α的相對表達量（x±s）

圖4 Western blot法檢測各組ARPE-19細胞中HIF-1α表達的電泳圖。1～3、4～6、7～9、10～12分別為正常組、缺氧模型組、康柏西普陽性對照組、加減駐景方含藥血清組在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時的結果HIF-1α：缺氧誘導因子-1α

圖5 Western blot法檢測各組ARPE-19細胞在不同培養(yǎng)時間HIF-1α相對表達量（HIF-1α/β-actin）的變化情況HIF-1α：缺氧誘導因子-1α

3 討論

研究表明，人類疾病和動物模型的CNV細胞成分主要由血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、周細胞、RPE和炎癥細胞等組成，在CNV形成的不同階段，RPE起著不同的作用。在新生血管形成的起始期和活動期缺血缺氧、氧化應激、衰老等因素可誘發(fā)RPE細胞分泌多種促血管生成因子，促進內皮細胞活化、增殖、遷移，導致CNV的形成；在退化期，RPE基底膜增厚，分泌的促血管生成因子下調，血管生成抑制因子上調，促使CNV退化?？梢奟PE細胞在CNV發(fā)生過程中起著雙重調節(jié)作用。體外研究目前廣泛采用細胞或組織培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)簡化了環(huán)境條件，排除了一些復雜因素的影響，具有簡化性、針對性強等特點，其中的人視網膜色素上皮細胞系ARPE-19是此類研究比較常用的細胞模型[5-6]。因此本實驗體外培養(yǎng)ARPE-19細胞，采用二氯化鈷模擬細胞缺氧，觀察各處理因素對ARPE-19缺氧后細胞增殖活性的影響。康柏西普眼用注射液作為抗VEGF藥物于2013年底在我國批準上市，用于治療濕性年齡相關性黃斑病變[7]，該藥是一種VEGF受體與人免疫球蛋白Fc段重組的融合蛋白，能特異性地結合VEGF，通過抑制VEGF及其受體的信號傳遞達到對新生血管的抑制，從而達到治療相關新生血管性眼病[8-9]，因此選擇以康柏西普為陽性對照組。

體外實驗中血清藥理的研究方法是重要環(huán)節(jié)，中藥含藥血清有著自身眾多的優(yōu)勢，在細胞培養(yǎng)中，細胞所處的內環(huán)境與血清的理化性質基本相同，這很好地排除了制劑本身對實驗結果的影響。中藥含藥血清在方法學上為中藥及中藥復方的研究提供了新的途徑，排除了中藥制劑的理化干擾，為藥動學、藥化學、中藥及中藥復方藥理學提供了新的研究思路[10]。

本實驗采用ELISA方法和Western blot方法分別檢測了加減駐景方對低氧誘導的ARPE-19細胞上清液HIF-1α蛋白，以及ARPE-19細胞中VEGF和HIF-1α蛋白表達的影響。實驗結果顯示，模型組（100 μmol/L氯化鈷）中VEGF、HIF-1α蛋白表達顯著高于正常組，藥物干預組（20%的加減駐景方含藥血清組、20 μg/mL康柏西普陽性對照組）中VEGF、HIF-1α蛋白表達則顯著低于模型組，說明20%的加減駐景方含藥血清、20 μg/mL康柏西普均對VEGF、HIF-1α蛋白表達有抑制作用。在Western blot檢測細胞內VEGF和HIF-1α水平的結果中,我們未能觀察到組別因素對各指標隨時間變化趨勢的影響,考慮可能與樣本量過小，實驗設計等因素有關，我們將在后續(xù)實驗中結合體內實驗進一步研究細胞增殖與時間和藥物的具體關系。

本實驗是從缺血模型著手進行的中醫(yī)藥研究，下一步將試對加減駐景方治療CNV的多靶點多通路作用機制進行探討，為臨床用藥提供更多的實驗依據。

[1]Korff T，Dandekar G，Pfaff D，et al.Endothelial ephrinB2 is controlled by microenvironmental determinants and associates contextdependently with CD31[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26（3）：468-474.

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[3]田楠楠，張慶，亢澤峰，等.駐景方對病理性近視脈絡膜新生血管VEGF表達的影響[J].國際眼科雜志，2013，13（8）：1525-1528.

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Effects of serum with modified Zhujing prescription on expression of VEGF and HIF-1α in cobalt chloride induced ARPE-19 cells

GAO Na,KANG Zefeng,CHU Wenli,et al.
The Second People's Hospital of Xining,Xining 810003,China

OBJECTIVE To explore effects of serum with modified Zhujing prescription on expression of vascular endothelium growth factor(VEGF)and hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α)protein in cobalt chloride induced ARPE-19 cells.METHODS 1.The ARPE-19 cells cultured in vitro and cells in well logarithmic growth were chosen to be assigned randomly into normal group,hypoxia group，positive control groups and medicated serum group.Time interventions were set for observation.2.Effects on expression of HIF-1α in supernate at different time point were assessed by ELISA.3.The expression of VEGF and HIF-1α protein in ARPE-19 cell under hypoxia were detected by Western Blot.RESULTS Expression of VEGF and HIF-1α increased after hypoxic injury,in addition, they were higher than counterparts of normal group.The difference was statistically significant(P<0.05).While compared with model group,expression of VEGF and HIF-1α in medicated serum group were higher statistically(P< 0.05).CONCLUSIONS Medicated serum with modified Zhujing prescription inhibited the expression of VEGF and HIF-1α in ARPE-19 cells under hypoxia injury.

modified Zhujing prescription;retinal pigment epithelium(RPE)cell;vascular endothelium growth factor(VEGF);hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α)

R285.5

A

1002-4379（2016）06-0351-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.06.001

國家自然科學基金面上項目（81574032）

1.青海省西寧市第二人民醫(yī)院眼科，西寧810003 2.中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院，北京100040

亢澤峰，E-mail：zefeng2531@163.com