張俊平，蔣鳳英，楊惠萍，李春華，倪建平，趙本進，何錫忠*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海201106）

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鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）純化及其檢驗

張俊平1，2，蔣鳳英1，2，楊惠萍1，李春華1，2，倪建平2，趙本進2，何錫忠1，2*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海201106）

摘 要：在鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）分離鑒定試驗確定為鴿副黏病毒Ⅰ型強毒株的基礎(chǔ)上，對該病毒株進行了蝕斑純化，獲得了鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）純化毒株，并對純化株傳代后進行無菌檢驗、血凝試驗、血凝抑制試驗和病毒含量測定。結(jié)果顯示，該純化毒株純凈、有血凝性和血凝抑制性，病毒含量為108" 5ELD50/0" 1 mL，初步判定純化的鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）可作為鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗（S-1株）免疫效力試驗攻毒毒株。

關(guān)鍵詞：鴿副黏病毒Ⅰ型；純化；檢驗

鴿副黏病毒Ⅰ型（Pigeon Paramyxovirusl，PPMV-Ⅰ）病又稱鴿新城疫，是由禽Ⅰ型副黏病毒（Avian Paramyxovirusl，APMV-1）引起的急性、高度接觸性傳染病，以腸炎、嚴重下痢和神經(jīng)癥狀為特征，是危害養(yǎng)鴿業(yè)的主要疫病之一［1-2］。該病于1981年首先在蘇丹和埃及的信鴿中發(fā)現(xiàn)，隨后迅速傳播到歐洲、美國、加拿大等地［1-3］，我國1985年在香港進口種鴿中分離到此病毒，同年8月珠海拱北動物檢疫局在中國臺灣引進的種鴿中也檢出該病毒，現(xiàn)全國大多數(shù)地區(qū)已有發(fā)病報道［4-6］。目前我國控制鴿副黏病毒Ⅰ型病多用雞新城疫疫苗，在一些鴿場起到了一定的預(yù)防作用，但該病仍有發(fā)生，常出現(xiàn)免疫失?。?-8］。目前沒有針對此病的特效藥，比較成熟、免疫效果好的專用疫苗尚未見報道［9］。為了有效預(yù)防該病，開展鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗（S-1株）的研制及疫苗免疫效力試驗是必不可少的，免疫效力的成敗與選擇的攻毒用強毒株的純凈及毒力直接相關(guān)。在對鴿副黏病毒Ⅰ型分離株（川沙株）分離鑒定試驗確定為鴿副黏病毒Ⅰ型強毒株的基礎(chǔ)上，本研究通過蝕斑純化獲得鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）純化株，并對純化株進行了相關(guān)檢驗，以期為鴿副黏病毒Ⅰ型滅活疫苗（S-1株）的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1．1 材料

1" 1" 1 毒株

鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）第5代（E5代）由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定、保存。

1" 1" 2 試劑

DMEM干粉、瓊脂糖、特級新生牛血清（FBS）購自GIBCO BRL公司；中性紅購自上海試劑三廠；胰蛋白酶購自上?；瘜W(xué)試劑站。

1" 1" 3 試驗動物

SPF雞胚為購自梅里亞-維通實驗動物技術(shù)有限公司的SPF種蛋自行孵化至所需的日齡獲得。

1" 1" 4 無菌檢驗用培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T" G）小管、酪胨瓊脂（G" A）斜面、葡萄糖蛋白胨（G" P）按常規(guī)方法［10］配制。

1" 1" 5 1％紅細胞懸液

取SPF青年雞血液，按常規(guī)方法［10］洗滌制備。

1" 1" 6 參考血清

抗雞NDV陽性血清、EDS76V陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；AIV-H5、AIV-H9、AIV-H7陽性血清購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1．2 方法

1" 2" 1 病毒雞胚復(fù)壯

將本實驗室保存的鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）E5代用滅菌生理鹽水按照1∶10 000稀釋，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚15枚，0" 1 mL/枚，37℃繼續(xù)孵育，24 h照蛋，將死亡雞胚棄去，以后每6 h照蛋1次，將死亡雞胚隨時取出放于4℃冰箱冷藏，直至56 h全部取出，收獲死亡雞胚尿囊液，混合后分裝于西林瓶中，標(biāo)記為E6代，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1" 2" 2 病毒細胞培養(yǎng)

將E6代病毒凍融1次，按總量10％接種雞胚成纖維細胞（CEF）單層，37℃吸附1 h，將接種液棄去，加入含2％血清的DMEM營養(yǎng)液，37℃、5 mol/L CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察病變，當(dāng)細胞病變達到80％時收獲病毒。連續(xù)傳3代，分別標(biāo)為C1代、C2代、C3代，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1" 2" 3 病毒蝕斑純化

用瓊脂法做蝕斑。取細胞毒C3代用DMEM倍比稀釋，取10－4—10－85個稀釋度，按10％接種CEF單層（棄去培養(yǎng)液，用DMEM洗滌2次），每個稀釋度接種3個孔，37℃吸附1 h，用DMEM洗滌2次，加入3％預(yù)熱的瓊脂與含4％FBS的2×DMEM混合液，37℃、5％CO2環(huán)境中避光培養(yǎng)，每隔6 h觀察1次蝕斑形成情況，待蝕斑形成后選取最高稀釋度1個典型蝕斑用毛細吸管挑斑，將蝕斑再分別接種CEF單層進行反復(fù)純化4代，獲得鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）純化株，標(biāo)記為A1代、A2代、A3代、A4代。

1" 2" 4 純化病毒細胞擴增

將形成CEF單層的細胞培養(yǎng)瓶棄去培養(yǎng)液，用DMEM洗滌2次，A4代種毒用DMEM 1∶10稀釋接毒，37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)，逐日觀察病變，當(dāng)細胞病變達到80％時收獲病毒，獲得鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）純化細胞毒，標(biāo)記為A4C1，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1" 2" 5 純化株細胞毒雞胚傳代

按常規(guī)方法取原倍、1∶500、1∶1 000、1∶10 000稀釋的A4C1病毒液尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，觀察雞胚的死亡情況，直至48 h全部取出，收獲死亡雞胚尿囊液，獲得鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）純化雞胚毒，標(biāo)記為A4E1代、A4E2代、A4E3代、A4E4代，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1" 2" 6 無菌檢驗

按常規(guī)方法［10］對鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）收獲尿囊液、細胞毒、純化株細胞毒和純化雞胚毒進行無菌檢驗。

1" 2" 7 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗

應(yīng)用β-微量法，對鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）收獲尿囊液、細胞毒、純化株細胞毒和純化雞胚毒進行血凝效價測定，并用雞新城疫（ND）標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、EDS76V陽性血清和AIV-H5、AIV-H9、AIV-H7陽性血清進行HI試驗［11］。

1" 2" 8 鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）A4E3代病毒含量測定

按常規(guī)方法［11］測定A4E3代病毒液病毒含量，計算其ELD50。

2 結(jié)果與分析

2．1 病毒蝕斑純化結(jié)果

鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）C3代病毒接種CEF后60 h左右形成不同大小的蝕斑，挑取單個蝕斑進行傳代，傳兩代后，出斑時間和蝕斑大小趨于穩(wěn)定，大約在2 mm（圖1）。

圖1　純化后蝕斑（川沙株）Fig．1 The purified plaque（Chuansha strain）

2．2 無菌檢驗結(jié)果

對鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）收獲尿囊液、細胞毒、純化株細胞毒和純化雞胚毒進行無菌檢驗，結(jié)果均為陰性。

2．3 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗結(jié)果

對鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）收獲尿囊液、細胞毒、純化株細胞毒和純化雞胚毒進行HA和HI測定，結(jié)果見表1，根據(jù)HA試驗結(jié)果判定病毒含量測定選擇A4E3代。

表1　HA和HI試驗結(jié)果Table 1 Results of hemagglutination test（HA）and hemagglutination-inhibition test（HI）

2．4 鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）A4E3代病毒含量測定

由表2可見，雞胚集中死亡時間為60 h內(nèi)，病毒含量為108" 5ELD50/0" 1 mL，符合副黏病毒強毒株致雞胚死亡時間規(guī)律。

表2　病毒含量測定結(jié)果Table 2 Determination results of virus content

3 結(jié)論與討論

3" 1 本試驗通過對純化株細胞傳代和雞胚傳代獲得純化株的傳代病毒，并對純化株的傳代病毒進行了無菌檢驗、血凝試驗、血凝抑制試驗和病毒含量測定。試驗結(jié)果表明：該純化毒株無菌，具有血凝性，能被ND陽性血清抑制，但不能被禽流感H5、H7、H9株陽性血清、EDS76陽性血清所抑制，因此判定該純化病毒為鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）純化株。雞胚測定病毒含量為108" 5ELD50/0" 1 mL，雞胚集中死亡時間為60 h內(nèi)，符合副黏病毒強毒株致雞胚死亡時間規(guī)律。

3" 2 由于直接從病死鴿體內(nèi)用SPF雞胚分離獲得的病毒可能不單純?yōu)橐环N病毒，若要想獲得純凈的一種病毒必須對分離株進行純化。本實驗室通過蝕斑純化的方法對鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）進行了純化。

3" 3 本實驗室通過對鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）分離鑒定［12］測得致死雞胚的平均死亡時間（MDT）為55" 2 h，腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）為1" 8，靜脈致病指數(shù)（IVPI）為2" 39，鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）攻毒劑量確定［13］判定該病毒為鴿副黏病毒Ⅰ型強毒株。因此，初步判定鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）純化株可作為研究鴿副黏病毒Ⅰ型疫苗免疫效力試驗攻毒毒株。

參 考 文 獻

［1］Alexander D J" Avian paramyxoviride recent developments［J］" Vet Microbiol，1990，23：103-104"

［2］Alexander D J，Russell P H，Parson G，et al" Antigenic and biological characterization of avian paramyxovirus typeⅠisolates from pigeon an international collaboration study［J］" Avian Pathol，1985，14：365-376"

［3］Alexander D J，Russell P H，Collins M S" Paramyxovirus typeⅠinfections of racing pigeon：characterization of isolated viruses［J］" Veterinary Record，1984，114：444-446"

［4］劉業(yè)兵，田春利，胡艷麗，等"鴿Ⅰ型副黏病毒的分離鑒定及生物學(xué)特征研究［J］"中國家禽，2006，28（24）：63-65"

［5］陳鐘鳴，劉懷然，孫敏華，等"鴿Ⅰ型副黏病毒的分離鑒定及其F基因、HN基因的序列分析［J］"中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30（9）：1167-1172"

［6］隋修錕，李剛，李鐵，等"四株鴿Ⅰ型副黏病毒的分離鑒定及基因型分析［J］"中國獸醫(yī)科學(xué)，3013，43（2）：136-140"

［7］崔曉萍，秦愛建，崔治中，等"鴿新城疫病毒的分離及鴿群自然感染狀況的調(diào)查［J］"中國獸藥雜志，2000，31（2）：6-10"

［8］楊瑛"鴿新城疫野毒株的分離及生物學(xué)特性研究［J］"畜牧與獸醫(yī)，1998（5）：198-199"

［9］陳麗君"鴿Ⅰ型副黏病毒（HT-40）的純化與防治試驗研究［D］"保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007"

［10］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部"中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程2000年版［Z］"北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000"

［11］中國獸藥典委員會"中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部［S］"北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010"

［12］張俊平，楊惠萍，蔣鳳英，等"鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）的分離鑒定［J］"中國獸藥雜志，2013，47（11）：13-17"

［13］張俊平，楊惠萍，蔣鳳英，等"鴿副黏病毒Ⅰ型（川沙株）攻毒劑量研究［J］"病毒學(xué)報，2014，30（2）：177-179"

（責(zé)任編輯：閆其濤）

Purification and test of pigeon paramyxovirus typeⅠ（Chuansha strain）

ZHANG Jun-ping1，2，JIANG Feng-ying1，2，YANG Hui-ping1，LI Chun-hua1，2NI Jian-ping2，ZHAO Ben-jin2，HE Xi-zhong1，2*
（1Institute of Animal Husbandry＆Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；2Shanghai Jiamu Biological Products Company Limited，Shanghai 201106，China）

Abstract：On the basis of isolation and identification of pigeon paramyxovirus typeⅠas virulent strain （PPMV-Ⅰ，Chuansha strain），the strain was purified by plaque purification，and the purified strain of pigeon paramyxovirus typeⅠ（Chuansha strain）was obtained" The results of sterility test，hemagglutination test，hemagglutination-inhibition test and virus content determination showed that the purified PPMV-Ⅰwas sterility，with hemagglutination and hemagglutination-inhibition，and the virus content was 108" 5ELD50/0" 1 mL" It was preliminary determined that the purified strain of pigeon paramyxovirus typeⅠ（Chuansha strain）can be used as a pigeon paramyxovirus type I virus inactivated vaccine（S-1 strain）challenge strain for immune efficacy test"

Key words：Pigeon paramyxovirus type I；Purification；Test

*通信作者：何錫忠（1966—），男，碩士，獸醫(yī)師，研究方向為獸醫(yī)傳染病的診斷和疫苗研制，Tel：13817780200；E-mail：sjhxz＠163" com

作者簡介：張俊平（1978—），女，碩士，助理研究員，從事動物生物制品研發(fā)工作。Tel：15301903906；E-mail：zhangjunping5259＠sina" com

基金項目：上海市科委科技支撐項目（133919N2000）

收稿日期：2014-12-17

文章編號：1000-3924（2016）01-029-04

中圖分類號：S852" 4

文獻標(biāo)識碼：A