王苑螈，王 波，王秀英，申 強(qiáng)，薛 永，李大偉，彭日荷，姚泉洪*

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106；3上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；4無(wú)錫市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，無(wú)錫214023）

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畢赤酵母異源表達(dá)β-葡聚糖酶酶學(xué)特性的研究

王苑螈1，2，王 波2*，王秀英2，3，申 強(qiáng)4，薛 永2，李大偉1，2，彭日荷2，姚泉洪2**

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106；3上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；4無(wú)錫市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，無(wú)錫214023）

摘 要：根據(jù)酵母密碼子的偏好性對(duì)來(lái)自某異源菌種的葡聚糖酶基因進(jìn)行化學(xué)合成改造，用電轉(zhuǎn)化方法整合到畢赤酵母基因組中進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)表達(dá)出的內(nèi)切β-葡聚糖酶進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)特性研究。結(jié)果表明：酶的最適pH為4" 5，最適溫度為40℃；酶的pH穩(wěn)定性范圍與緩沖溶液類型有關(guān)，為4" 0—6" 0；Al3＋對(duì)酶有激活作用，但Mn2＋和Cu2＋則會(huì)抑制酶的活性；此酶對(duì)羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）有較強(qiáng)的分解能力；胃蛋白酶對(duì)該酶有抑制作用。

關(guān)鍵詞：β-葡聚糖酶；畢赤酵母；酶學(xué)特性；DNS法

β-葡聚糖是一種自然合成多糖，在細(xì)胞壁中屬于非淀粉性結(jié)構(gòu)多糖，是一種由β-1，3和β-1，4糖苷鍵鏈接的D-葡萄糖聚合物［1］。β-葡聚糖酶是一類能夠降解葡萄糖聚合物的酶系，大部分由微生物產(chǎn)生，如細(xì)菌（芽孢桿菌屬）、真菌（曲霉屬、毛霉屬、木霉屬等）和瘤胃微生物，同時(shí)也存在于谷物中［2-4］。β-葡聚糖酶屬于糖基水解酶，根據(jù)其作用方式可分為內(nèi)切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶（E" C" 3" 2" 1" 73）、內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶（E" C" 3" 2" 1" 39）、外切-β-1，3-葡聚糖酶（E" C" 3" 2" 1" 58）和外切-β-1，4-葡聚糖酶（E" C" 3" 2" 1" 74），隨機(jī)水解β-1，3或β-1，4糖苷鍵，生成葡萄糖和寡糖［5-6］。

植物種子可以產(chǎn)生β-葡聚糖酶，在萌發(fā)過(guò)程中分解胚乳細(xì)胞壁中的β-葡聚糖，解除其對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的抑制作用，促進(jìn)種子正常萌發(fā)［7］。β-葡聚糖酶還是一種綠色飼料添加劑，它可以降低腸胃內(nèi)容物的黏度，改善單胃動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高飼料利用率［8-9］。在釀造工業(yè)中，啤酒過(guò)濾、啤酒非生物沉淀等問(wèn)題都可以通過(guò)添加β-葡聚糖酶得到解決［10-11］。另外，β-葡聚糖酶在植物抗真菌基因工程中也有所研究。β-葡聚糖酶廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、紡織、日化、廢水處理等行業(yè)，前景可觀［12-13］。

玉蜀黍赤霉菌無(wú)性型又稱為禾谷鐮刀菌，是一種植物病原體，能夠引起小麥、大麥的赤霉病和玉米的穗腐病，造成農(nóng)作物品質(zhì)降低和產(chǎn)量嚴(yán)重減少，引起糧食問(wèn)題［14］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)來(lái)自玉蜀黍赤霉菌的葡聚糖酶研究甚少，本試驗(yàn)重新改造合成來(lái)自玉蜀黍赤霉菌的葡聚糖酶基因，并利用電轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入到畢赤酵母細(xì)胞中，對(duì)表達(dá)出的β-葡聚糖酶進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)特性研究。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

所用藥品均為分析純，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN infinite M200瑞士帝肯公司；DK-8D型電熱恒溫水槽購(gòu)自上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠。

1．2 方法

1" 2" 1 酶促反應(yīng)體系

酶促反應(yīng)的基本體系為280 μL，包括70 μL粗酶液、70 μL Na2HPO4-檸檬酸緩沖（pH 5" 0）、140 μL 1％的CMC-Na（溶于100 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 4" 5），40℃反應(yīng)60 min；反應(yīng)結(jié)束后，加入等體積（280 μL）DNS試劑，100℃反應(yīng)10 min顯色，冷卻后在550 nm下測(cè)定OD值；每組設(shè)1個(gè)空白對(duì)照和3個(gè)平行，在允許誤差內(nèi)數(shù)據(jù)用平均值呈現(xiàn)。

1" 2" 2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的葡萄糖母液（稱取2 g葡萄糖溶于100 mL蒸餾水），分別稀釋成0" 01％、0" 02％、0" 04％、0" 06％、0" 08％、0" 1％、0" 12％、0" 14％8個(gè)梯度。每個(gè)梯度做1個(gè)對(duì)照和3個(gè)平行（以失活酶作為空白對(duì)照），依次加入70 μL葡萄糖溶液、70 μL粗酶液、140 μL緩沖液（Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 4"5），直接加入等體積（280 μL）DNS試劑反應(yīng)顯色，冷卻后于550 nm下測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．3 玉蜀黍赤霉菌β-1，4-葡聚糖酶純化后的酶學(xué)特性研究

1" 3" 1 反應(yīng)的最適溫度和最適pH

調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋，在不同溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、pH 5" 0下反應(yīng)60 min，根據(jù)DNS法測(cè)定其550 nm吸光值。

配制不同pH（2" 2、3" 0、4" 0、5" 0、6" 0、7" 0、8" 0）的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，用來(lái)溶解反應(yīng)底物羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），于最適溫度（40℃）下反應(yīng)。

1" 3" 2 熱穩(wěn)定性的研究

將酶液分為7組，分別于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃預(yù)處理60 min；每隔10 min取樣一次，置于4℃冰箱中，待樣品完全處理后加入CMC-Na于最適條件下（40℃，pH 4" 5）進(jìn)行酶活反應(yīng)，以未處理組（0 min，40℃）活力值為100。

1" 3" 3 pH穩(wěn)定性的研究

將酶液與不同pH的緩沖液混合，于4℃條件下放置24 h，取出后進(jìn)行正常的酶活反應(yīng)；對(duì)照組則不經(jīng)過(guò)低溫、緩沖液處理，直接于不同pH下反應(yīng)。

1" 3" 4 不同金屬離子對(duì)酶活力的影響

分別配置不同濃度的金屬離子（Na＋、Al3＋、Li＋、Ca2＋、Cr3＋、K＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋、Mn2＋、Pb2＋和Fe3＋）溶液，使其在反應(yīng)體系中的最終濃度為1 mmol/L和10 mmol/L，加入等體積（70 μL）酶液于40℃下處理30 min；對(duì)照組不添加任何金屬離子，以其活力值為100，在最適條件下反應(yīng)。

1" 3" 5 消化酶對(duì)酶活力的影響

分別將胃蛋白酶（用pH 2" 2的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配置，終濃度為50 U/mL）和胰蛋白酶（用pH 7" 0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，終濃度為50 U/mL）與酶液混合，在最適條件下分別反應(yīng)1 h和2 h，測(cè)定酶活力。

1" 3" 6 底物專一性

另選取3種不同的反應(yīng)底物微晶纖維素、濾紙、脫脂棉，分別稱取8 mg（±0" 1 mg），溶于pH 4" 5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，與酶液在40℃下分別反應(yīng)1 h、2 h、3 h，觀察其分解結(jié)果，測(cè)定550 nm吸光值。

2 結(jié)果與分析

2．1 最適溫度和熱穩(wěn)定性

由圖1可以看出，β-葡聚糖酶適合反應(yīng)的溫度范圍為30—50℃，最大酶活力在40℃左右，反應(yīng)曲線呈拋物線型；以未處理的酶樣為對(duì)照（40℃），計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活力。由圖2可知，酶在最適溫度40℃以下活力穩(wěn)定，在很小范圍內(nèi)波動(dòng)；當(dāng)溫度不斷升高時(shí)，活力開(kāi)始緩慢下降（50℃）；當(dāng)溫度達(dá)到60℃、70℃或更高時(shí)，處理10 min后酶即快速失活為0，說(shuō)明此酶不是耐高溫酶。

圖1　β-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度Fig．1 The optimal temperature of β-1，4-glucanase

圖2　β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性Fig．2 The thermostability of β-1，4-glucanase

2．2 最適pH和pH穩(wěn)定性

在不同pH下測(cè)定的酶活力顯示，β-葡聚糖酶的最適pH在4" 5左右，在pH 3" 0—7" 0時(shí)，酶活相對(duì)值高于70％。經(jīng)過(guò)24 h、4℃處理后，此酶的穩(wěn)定性較好，穩(wěn)定值在pH 4" 0—6" 0；當(dāng)pH＜2" 5或＞7" 5時(shí)，酶活力較低（圖3）。

圖3　β-葡聚糖酶的最適pH和pH穩(wěn)定性Fig．3 The optimal pH and pH stability of β-1，4-glucanase

2．3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

研究了高濃度（10 mmol/L）和低濃度（1 mmol/L）金屬離子對(duì)酶活的影響，結(jié)果表明：不管是在高濃度還是低濃度下，Mn2＋對(duì)酶活力均有一定的抑制作用，相對(duì)酶活低濃度為69" 4％，高濃度為79" 1％；高濃度的Cu2＋對(duì)酶活力有相當(dāng)強(qiáng)的抑制作用，相對(duì)酶活為49" 5％；高濃度的Al3＋對(duì)酶活力有一定的促進(jìn)作用，相對(duì)酶活為142" 8％（圖4）。

圖4　不同濃度金屬離子對(duì)β-葡聚糖酶的影響Fig．4 Effects of different concentrations of mental ions on β-1，4-glucanase

2．4 消化酶對(duì)酶活的影響

從表1可以看出，胃蛋白酶對(duì)此酶有一定程度的抑制作用；而胰蛋白酶則對(duì)酶活無(wú)明顯影響；生產(chǎn)中作為動(dòng)物飼料添加劑時(shí)，需考慮消化酶的相互作用。

表1　胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)β-葡聚糖酶活性的影響Table 1 Effects of pepsin and trypsin on β-1，4-glucanase

2．5 酶的底物專一性

由表2可以看出，此酶的底物專一性較好，只對(duì)羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）等纖維素類物質(zhì)有較強(qiáng)的分解作用，對(duì)微晶纖維素、濾紙、脫脂棉等的分解能力微弱。

表2　β-葡聚糖酶的底物專一性Table 2 The substrate specificity of β-1，4-glucanase

3 討論

本研究表明，β-1，4-葡聚糖酶的最適pH為4" 5，最適溫度為40℃，是一種常規(guī)酶［15-17］，偏酸性；其最適溫度與動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境溫度十分相似，可以更好地促進(jìn)葡聚糖分解為寡糖，利于消化和吸收，是綠色動(dòng)物飼料添加劑的新選擇。在工業(yè)應(yīng)用中，酶與各種金屬離子的相互作用應(yīng)予以考慮。鑒于Al3＋對(duì)該酶具有一定的促進(jìn)作用，可以考慮適當(dāng)添加；而Mn2＋和Cu2＋則需避免或少量添加，并且考慮到生化反應(yīng)中Mn2＋和Cu2＋的出現(xiàn)及其相互作用，應(yīng)做到抑制作用最小化。不同的金屬離子對(duì)不同的葡聚糖酶的影響也不盡相同，也許是因?yàn)槊傅幕騺?lái)源不同導(dǎo)致金屬離子與葡聚糖酶內(nèi)電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的相互作用能力不同。目前，其具體的作用機(jī)制還不是非常清楚，有待于進(jìn)一步探究［18-19］。該酶對(duì)羧甲基纖維素鈉具有很強(qiáng)的分解作用，且該酶的專一性較強(qiáng)。羧甲基纖維素鈉為當(dāng)今世界上使用范圍最廣、用量最大的纖維素種類，本研究所得到的玉蜀黍赤霉菌β-1，4-葡聚糖酶的相關(guān)酶學(xué)特性數(shù)據(jù)，將為其實(shí)際應(yīng)用提供重要借鑒和參考。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Characterization of endo-β-1，4-glucanase heterologously expressed in Pichia pastoris

WANG Yuan-yuan1，2，WANG Bo2*，WANG Xiu-ying2，3，SHEN Qiang4，XUE Yong2，LI Da-wei1，2，PENG Ri-he2，YAO Quan-hong2**
（1College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Agro-Biotechnology Research Center，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；3College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University Shanghai 200234，China；4Wuxi City Agricultural Technology Extension Station，Wuxi 214023，China）

Abstract：The β-1，4-glucanase gene from Gibberella zeae was re-synthesized chemically according to the yeast bias condon and tansformed into Pichia pastoris by electroporation" The expressed endo-β-glucanase was characterized，and the results showed that the optimal pH is 4" 5 and the optimal temperature is 45℃" The pH stability of the enzyme was 4" 0—6" 0，which was related to the type of buffer solution" Al3＋had activation on the enzyme，but Mn2＋and Cu2＋inhibited the enzyme activity" The substrate specificity on carboxylmethyl cellulose sodium salt（CMC-Na）was strong" Pepsin had an inhibiting effect on the enzyme"

Key words：β-glucanase；Pichia pastosis；Enzymatic characteristics；DNS method

作者簡(jiǎn)介：王苑螈（1989—），女，在讀碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：yuanyuanw29＠163" com；Tel：18674383752*共同第一作者

基金項(xiàng)目：上海市農(nóng)委重大項(xiàng)目（滬農(nóng)科種字2013-8、滬農(nóng)科種字2014-2）

收稿日期：2015-01-04

文章編號(hào)：1000-3924（2016）01-010-05

中圖分類號(hào)：S816" 3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

**通信作者：姚泉洪（1965—），男，博士，研究員，研究方向：植物和微生物基因工程。E-mail：yao" quanhong65＠yahoo" com