顏琦松,舒啟超,巨修練*
1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院,湖北武漢430074;2.綠色化工過程教育部重點實驗室(武漢工程大學(xué)),湖北武漢430074
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家蠅鈉離子通道的同源模建及分子對接和構(gòu)效關(guān)系
顏琦松1,2,舒啟超1,2,巨修練1,2*
1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院,湖北武漢430074;
2.綠色化工過程教育部重點實驗室(武漢工程大學(xué)),湖北武漢430074
摘要:利用大鼠腦電壓門控鉀離子通道DII區(qū)的S4-S5片段的結(jié)構(gòu)和古細菌Aeropyrum pernix的鉀離子電壓門控通道S6區(qū)的結(jié)構(gòu)為模板,通過同源模建的方法構(gòu)建家蠅的鈉離子通道受體開啟狀態(tài)的模型,并利用拉氏圖和分子動力學(xué)分析驗證其模型的合理性.將31個擬除蟲菊酯類化合物與模建的家蠅鈉離子通道受體進行對接研究,并研究其作用機理.結(jié)果表明,對接打分與實測活性值相一致,說明了該模型的合理性.通過對接分析和三維定量構(gòu)效關(guān)系實驗可以看出,家蠅電壓門控鈉離子通道上929位蘇氨酸與擬除蟲菊酯類化合物的羧基形成氫鍵,且化合物上的氯原子與918位甲硫氨酸具有范德華作用力,同時苯環(huán)上增加取代會增加位阻降低化合物活性,鄰位和間位取代對化合物活性相對影響較小,而苯環(huán)對位取代對活性影響最大,且對位取代基的吸電子能力越強,化合物活性越低.另外,結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究的CoMFA模型與上述對接結(jié)果一致.
關(guān)鍵詞:擬除蟲菊酯類化合物;鈉離子通道受體;分子對接;3D-QSAR
電壓門控離子通道(Voltage-gated Ion Chan?nel,VGICs)屬于跨膜蛋白,它在細胞內(nèi)電信號傳導(dǎo)中扮演著重要角色. VGICs的狀態(tài)由細胞膜電勢調(diào)節(jié),通道打開讓離子可以沿著電勢差通過細胞膜.電壓門控鈉離子(NaV)通道有三個主要狀態(tài):關(guān)閉狀態(tài),開啟狀態(tài)和失活狀態(tài),其中擬除蟲菊酯類殺蟲劑結(jié)合于Nav通道開啟狀態(tài),并且將通道穩(wěn)定在開啟狀態(tài)[1],因此抑制了通道向其他狀態(tài)的過渡[2-3],導(dǎo)致向內(nèi)的鈉電流延續(xù),引起反復(fù)的神經(jīng)沖動和超興奮,使得昆蟲麻痹和死亡.這類通道調(diào)節(jié)劑與昆蟲鈉離子通道的親和力明顯大于與哺乳動物鈉離子通道的親和力,使其具有選擇性.不幸的是,同類殺蟲劑DDT早期的廣泛使用導(dǎo)致了昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了交叉抗性,減弱了這類殺蟲劑的作用.昆蟲對DDT和擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗藥性的重要機制是擊倒抗性(kdr),它會導(dǎo)致昆蟲的電壓門控鈉離子通道對擬除蟲菊酯類殺蟲劑敏感性減弱.構(gòu)成離子通道氨基酸殘基突變導(dǎo)致抗性已被實驗證實,目前研究已揭示了擬除蟲菊酯可能的作用位點(圖1):IIS4-IIS5linker中的Met918,IIS5區(qū)中的Leu925、Leu929和Leu932,IIS6區(qū)Leu1014[4].當(dāng)然也有一些突變并不在DII區(qū),但是也主要集中在DI-DIII的S6片段,包括IS6中的V410M和IIIS6區(qū)中F1538I[5-6].目前并沒有完整開啟狀態(tài)鈉離子通道晶體結(jié)構(gòu)的報道,但是由于鉀離子通道與鈉離子通道屬于同一家族且具有高度的同源性,因此我們利用電壓門控鉀離子通道作為模板模建家蠅鈉離子通道,包括D1-D4的S6區(qū)和DII的S4-S5區(qū).此外,將兩類含有苯環(huán)的擬除蟲菊酯類化合物(圖2)與構(gòu)建的家蠅鈉離子通道模型進行對接,并進行擬除蟲菊酯類化合物的3D-QSAR研究,研究其作用機理,為更好設(shè)計擬除蟲菊酯類殺蟲劑提供理論依據(jù).
圖1 擬除蟲菊酯類化合物可能的結(jié)合位點Fig. 1 Possible binding sites for the pyrethroids
圖2 兩類擬除蟲菊酯的結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structures of two kinds of pyrethroids
所有計算通過SYBYL-X1.2軟件完成,若無特別說明,參數(shù)均為默認值.
2.1模板準備
由于目前并沒有完整的開啟狀態(tài)時鈉離子通道的晶體結(jié)構(gòu),所以利用X-射線解析出來大鼠腦中同一家族的電壓門控鉀離子(Kv1.2)(蛋白質(zhì)序列號2A79)通道為模板,其在Kv1.2中S6區(qū)域包含PXP(Pro Xaa Pro)結(jié)構(gòu)(圖3),這種結(jié)構(gòu)能改變蛋白質(zhì)內(nèi)部作用的氫鍵,使細胞末端S6片段張開并形成一個孔道,大約1.2 nm,使通道持續(xù)開放激活狀態(tài),然而這在電壓門控鈉離子通道和真核生物的鉀離子通道中并不存在,因此利用Kv1.2來模建家蠅的S6區(qū)是不適的.由于Kv1.2和KvAP是同一個家族的,且主要結(jié)構(gòu)區(qū)別是在Kv1.2的S6區(qū)后半部分包含PXP結(jié)構(gòu),在Kv1.2中的PXP結(jié)構(gòu)的C端的關(guān)鍵連接位置為甘氨酸[7],其在古細菌Acro?pyrum pernix中的電壓門控鉀離子通道(KvAP)同樣位置發(fā)現(xiàn)了甘氨酸,同時將KvAP的S6螺旋與家蠅的D1-III的S6區(qū)域比對(圖4)使我們相信KvAP能夠添加在Kv1.2上從而提供一個更加合理的模板.
圖3 Kv1.2通道跨膜段結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structure of channel Kv1.2 transmembrane segment
圖4 KvAP通道與家蠅電壓門控鈉離子通道D1-D4區(qū)域S6螺旋序列比對Fig. 4 Comparion of sequence alignments of the KvAP channel and the housefly voltage-gated sodium channel S6 helices from domains I-IV
其中S4-S5區(qū)(殘基312-347)和P-LOOP區(qū)螺旋(殘基362-372)來自大鼠腦Kv1.2通道X-射線單晶結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)序列號2A79),S6螺旋(殘基210-240)來自于KvAP(蛋白質(zhì)序列號為1ORQ),模型利用軟件CCP4中的SUPERIMPOSE,將KvAP中的S6螺旋疊加到Kv1.2晶體結(jié)構(gòu)上,KvAP骨架原子殘基序列中219~221和231~233分別疊加到Kv1.2的殘基序列397~399和410~412上,以保證覆蓋保守的關(guān)鍵連接位點.
2.2構(gòu)建步驟
首先通過SYBYL-X1.2的Biopolymer版塊中compare sequence功能將家蠅DI,DIII,DIV的S6區(qū)和DII區(qū)的S4LOOP-S6相互對照(sequence align?ment)產(chǎn)生MSF(multiple sequence format)的對比文件[8],然后利用Medel Proteins將MSF文件導(dǎo)入并以模板的晶體結(jié)構(gòu)為基準構(gòu)筑靶肽鏈結(jié)構(gòu),并構(gòu)建保守區(qū),P-loop區(qū)以及添加側(cè)鏈.
2.3模型組合
利用Biopolymer模塊中Compare Structure里align Structure By Homology,將模建的序列坐標疊加到模板上相應(yīng)的部分.
2.4模型的分子動力學(xué)優(yōu)化
通過分子動力學(xué)的方法對模型進行修正和能量優(yōu)化,證明模型的可靠性.此實驗選擇了立體場AMBER7FF99[9],運用共軛梯度法優(yōu)化體系能量梯度的RMS小于5 kcal/mol/nm,并通過分子動力學(xué)(molecular dynamics,MD)優(yōu)化模型,確定模型的穩(wěn)定度.模擬條件設(shè)定在溫度300 K,大氣壓為1 T,其中2.5 ps間隔采集一次軌跡數(shù)據(jù),單位步長1 fs,總步長500 ps.
2.5配體分子的準備
兩類配體分子由SYBYL里畫出,并利用軟件中的Compute模塊中Minimize將分子進行能量優(yōu)化,其中Gradient中Termination為0.005 kcal/mol,立場(Force Field)為Tripos,電荷:Gasteiger-Huck?el,選擇方法為Powell法.
2.6分子對接
利用分子對接的方法將前面兩類擬除蟲菊酯類化合物與模建出的家蠅電壓門控鈉離子通道結(jié)合位點部位進行對接,通過定義重要結(jié)合殘基Met918,Thr929,Val410,Leu1014,Phe1538,利用SYBYL-1.2中Surflex-docking模塊進行,并結(jié)合打分函數(shù),分析打分函數(shù)與實測活性的關(guān)系,驗證模型的可靠性,進而研究化合物與受體蛋白之間的相互作用機理.分子對接結(jié)構(gòu)通過Cscore面板顯示,打分函數(shù)根據(jù)熵,極性作用,疏水作用,排斥作用,溶劑化作用綜合得到總得分,該得分與結(jié)合自由能具有相關(guān)關(guān)系[10-11].
2.7分子疊合
分子疊合是CoMFA中最關(guān)鍵的一步,疊合好壞的直觀表現(xiàn)為交叉驗證系數(shù)q2值.一般來說,當(dāng)q2大于0.3時,所建模有較好的統(tǒng)計意義,而當(dāng)q2大于0.5時,模型的統(tǒng)計意義十分顯著[12-13]. r2(非交叉驗證相關(guān)系數(shù))大于0.9時,說明模型的預(yù)測能力很好.本文考慮到影響化合物活性主要官能團集中在苯環(huán)上且與氯原子有關(guān),因此可選擇苯環(huán)上6個C和Cl原子及雙鍵上兩個C共9個骨架位點,利用SYBYL中Align database將31個化合物的基本骨架疊合,每個分子立場的取向具有一致性.
3.1同源模建結(jié)果分析
將家蠅DI,DII,DIII的S6區(qū)和DII區(qū)的S4 LOOP-S5與模板分別進行比對(sequence align?ment),得到同源性(identity)分別是22.6%,13.3%,16.7%,28%,其中關(guān)鍵區(qū)域S4 LOOP-S5比對的同源性為28%,Kv1.2通道與家蠅的S4-S5 linker、S5區(qū)域序列比,如圖5所示.
圖5 Kv1.2通道與家蠅電壓門控鈉離子通道的S4-S5linker和S5螺旋序列對比圖Fig. 5 Comparion of sequence alignments of the Kv1.2 channel with the housefly voltage?gated sodium channel S4-S5 linker and S5 helix
利用SYBYL軟件中Protable分析家蠅受體模型的立體化學(xué)性質(zhì),得到該模型的Ramachandran構(gòu)象圖,如圖6所示.
圖6 家蠅電壓門控鈉離子通道受體中央孔道區(qū)域氨基酸Ramachandran圖Fig. 6 Ramachandran graph of the central pore domain of houseflyvoltage?gated sodium channel receptor
在家蠅的NaV通道受體中央孔道區(qū)的拉氏構(gòu)象,觀察到大量的氨基酸集中在-120度與-45度處,這與模型中具有大量的螺旋結(jié)構(gòu)相吻合,此外經(jīng)過統(tǒng)計表明,在家蠅NaV通道受體模型中,其中99.1%的氨基酸殘基位于允許區(qū)或最大允許區(qū),在此說明了該模型是合理的.因此本試驗利用同源模建構(gòu)建的家蠅NaV通道受體中央孔道區(qū)可用在此后分子對接試驗中.見圖7.
同時,最終模型還將利用SYBYL-X1.2軟件中Dynamics模塊進行分子動力學(xué)優(yōu)化,其中勢能-時間圖,見圖8.由勢能-時間圖可知,NaV受體模型在前80 ps能量下降比較快,而之后能量保持平穩(wěn)狀態(tài),通過分子動力學(xué)實驗,證明了該模型是可靠的[12-13].
圖7 家蠅電壓門控鈉離子通道中央孔道區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)Fig. 7 Three?dimensional structure of the central pore domain of housefly voltage?gated sodium channel
圖8 家蠅的NaV通道受體模型分子動力學(xué)勢能-時間圖Fig. 8 Molecular dynamics graph of potential energy?time for the housefly Navchannel receptor
3.2分子對接結(jié)果分析
該實驗利用分子對接的方法將兩類共31種擬除蟲菊酯類化合物與家蠅NaV通道受體進行對接,并通過SYBYL1.2軟件打分函數(shù)評價對接結(jié)果.
利用軟件中對接模塊為Surflex-docking Geom (SFXC),考慮分子氫鍵,通過分子對接和打分函數(shù),并選擇最優(yōu)構(gòu)象打分,如表1所示.
表1 兩類擬除蟲菊酯化合物的對接結(jié)果Tab. 1 Docking results of two kinds of pyrethroids
通過圖9可以看出實測活性與對接打分具有相關(guān)性,其中R2=0.614 2,說明了所建模型具有一定的實際意義.由于1號分子對接結(jié)果打分最高,且兩類化合物的結(jié)構(gòu)相似性比較高,故對1號分子與家蠅的NaV受體進行對接分析,如圖10.
圖9 實測LogEC50與對接打分線性圖Fig. 9 Linear graph of actual LogEC50with docking score
由圖10可知,1號分子中形成酯鍵的氧作為氫鍵的受體,與Thr929(蘇氨酸)支鏈中的氫原子構(gòu)成氫鍵,提供了配體分子與受體結(jié)合的條件,并且可以觀察的到1號分子中的氯原子與關(guān)鍵氨基酸925亮氨酸距離0.332 nm,且分子包裹在關(guān)鍵氨基酸DIIS4-S5LOOP內(nèi)的Met918,DIIS5區(qū)Leu925,Thr929,DIIIS6區(qū)Phe1534內(nèi)也說明擬除蟲菊酯類化合物通過同時連接結(jié)合家蠅NaV通道開啟時DII區(qū)與DIII區(qū)氨基酸導(dǎo)致通道無法關(guān)閉而產(chǎn)生殺蟲活性的分子機制.通過表1我們還可以發(fā)現(xiàn)在苯環(huán)上添加取代基會減弱其殺蟲活性,這是由于苯環(huán)上取代基會影響分子中氯與Leu925的相互作用,形成位阻.比較28,29,30分子發(fā)現(xiàn),在苯環(huán)的鄰位和間位引入取代基對活性影響小,進一步比較13,14,15號分子我們可以得出當(dāng)苯環(huán)4位引入吸電子基,活性明顯下降,且吸電子能力越強,活性越弱.綜上所述,此類的擬除蟲菊酯化合物中,苯環(huán)上取代會降低化合物的活性.
圖10 家蠅NaV受體與1號分子對接Fig. 10 Housefly Navreceptor docking with molecular one
3.3CoMFA結(jié)果與分析
CoMFA模型中參數(shù)為:交叉驗證系數(shù)q2=0.494(抽一法),其中最佳主成分數(shù)為10;非交叉驗證相關(guān)系數(shù)(r2)=0.990,標準方差(SEE)=0.054,立體場和靜電場的貢獻值分別為36.1%和63.9%,表明此模型統(tǒng)計意義較好且模型有較好的預(yù)測能力,靜電場在配體與受體中相互作用更加重要.圖11為CoMFA模型實測活性與預(yù)測活性的線性關(guān)系.
圖11所示的化合物實測活性與預(yù)測活性線性關(guān)系較好,證明所建CoMFA模型可靠,預(yù)測能力較強.選擇化合物1的三維靜電場場等勢圖(圖11)進行分析,在靜電場的三維等勢圖中藍色區(qū)域說明增加正電荷基團對提高化合物的活性是有利的,而紅色區(qū)域說明添加帶負電基團對化合物活性是有利的.觀察圖12可以看出在苯環(huán)的對位有大塊的藍色區(qū)域,說明在苯環(huán)的對位增加正電性取代基有利用提高活性. 4位的F原子及Me、OM取代與物取代的化合物相比較均降低了活性,如化合物10、13.
圖11 CoMFA模型預(yù)測值與實測值的線性圖Fig. 11 Linear graph of predicted values by CoMFA model versus actual values
圖12 CoMFA模型靜電場等等勢圖Fig. 12 Electrostatic field graph of CoMFA model
圖13中化合物綠色區(qū)域說明在該區(qū)域添加大體積基團,有利于增加化合物生物活性,而黃色區(qū)域說明添加大體積基團不利于化合物生物活性.由圖13可以得知,在苯環(huán)的3位及4位有大塊綠色區(qū)域,這表明增大該區(qū)域取代基體積有利于提高化合物活性,但表1中的化合物在苯環(huán)3、4位取代主要為Me及OMe取代基體積較小,如改變?yōu)楫惐?、正丁基或異丁基等較大體積基團,將更能證明模型的合理性.
圖13 CoMFA模型力場等勢圖Fig. 13 Steric field graph of CoMFA model
本研究模建了家蠅NaV受體跨膜區(qū)的三維結(jié)構(gòu),并通過分子動力學(xué)和拉氏圖驗證了該模型的可靠性.將兩類共31個擬除蟲菊酯化合物與該模型進行了對接研究,結(jié)果表明,家蠅NaV通道上929位蘇氨酸與擬除蟲菊酯類化合物形成氫鍵,且化合物上的氯原子與918號甲硫氨酸有范德華作用力.另外苯環(huán)上添加取代基會降低化合物活性,其中對位的取代對化合物活性影響最大,且對位取代基的吸電子能力越強,活性越低,此結(jié)論與CoM?FA模型所得出的結(jié)果相一致.以上結(jié)果為設(shè)計擬除蟲菊酯類殺蟲劑提供了理論依據(jù).
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本文編輯:張瑞
Homology Modeling of Housefly Voltage?Gated Sodium Ion Channel Receptor and Docking and Three Dimensional Quantitative Structure Activity Relationship
YAN Qisong1,2,SHU Qichao1,2,JU Xiulian1,2
1.School of Chemical Engineering&Pharmacy,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430074,China;
2.Key Laboratory for Green Chemical Process(Wuhan Institute of Technology),Ministry of Education,Wuhan 430074,China
Abstract:The housefly in an open state sodium channel was homology modeled by using S4?S5 fragment in DII section of rat?brain and S6 section of Aeropyrumpernix in voltage?gated potassium channel as structure tem?plates. The model was confirmed by Ramachandran graph and molecular dynamics. Furthermore,two categories of 31 pyrethroids were docked with housefly Voltage?gated sodium channel receptor and the docking score fitted well with the tested activities. The mechanism of insecticide was studied.The results of docking experiment and the three?dimensional quantitative structure?activity relationship reveal that the 929Thr of housefly Voltage?gated sodium channel receptor forms a hydrogen bond with pyrethroid and the chlorine atom on the side chain forms van der Waals force with Leu925. The effect of substituents on benzene ring may increase the steric hindrance and reduce insecticidal activity. The ortho and meta substitutes of benzene ring have weak effect on activity while the para substitute of benzene ring with strong impact on the activity. The COMFA model of the three dimensional quantitative structure activity relationship is in coincidence with docking results.
Keywords:pyrethroid;voltage?gated sodium channel receptor;molecular docking;3D?QSAR
*通訊作者:巨修練,博士,教授. E-mail:xiulianju2008@aliyun.com
作者簡介:顏琦松,碩士研究生. E-mail:215850790@qq.com
收稿日期:2015-11-13
文章編號:1674 - 2869(2016)01 - 0010 - 07
中圖分類號:R914.2
文獻標識碼:A
doi:10. 3969/j. issn. 1674?2869. 2016. 01. 002