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人胃癌組織Notch1表達及其意義

鉏莉1蔡陳效1*殷新光1鄔萬新2

嘉興市第一醫(yī)院消化內(nèi)科(嘉興市醫(yī)學(xué)重點學(xué)科 胃腸病學(xué))1(314000)病理科2

背景：胃癌是全球第四大常見惡性腫瘤。Notch信號通路在腫瘤發(fā)生機制中的作用為近年研究熱點，但其在胃癌中的作用機制尚未完全明確。目的：探討人胃癌組織中Notch1的表達情況及其意義。方法：納入2011年10月—2014年7月嘉興市第一醫(yī)院收治的胃癌患者115例，采用免疫組化法檢測癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織標本中Notch1的表達情況，并分析Notch1表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：Notch1在胃癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁非癌組織(73.9%對 3.5%，P<0.001)。胃癌組織中的Notch1表達與腫瘤脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：Notch1作為促癌基因參與了胃癌的發(fā)生，并與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。

關(guān)鍵詞胃腫瘤；Notch1；免疫組織化學(xué)；幽門螺桿菌

Expression and Significance of Notch1 in Human Gastric Cancer

CHULi1,CAIChenxiao1,YINXinguang1,WUWanxin2.

1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofPathology,JiaxingFirstHospital,Jiaxing,ZhejiangProvince(314000)

Correspondence to: CAI Chenxiao, Email: xccmail@163.com

Background: Gastric cancer (GC) is the fourth commonly seen cancer in the world. The role of Notch signaling pathway in the pathogenesis of tumors has become a focus in related studies, however, the underlying mechanism of Notch1 in GC has not yet been fully understood. Aims: To investigate the expression and significance of Notch1 in human GC tissue. Methods: A total of 115 patients with GC admitted at Jiaxing First Hospital from October 2011 to July 2014 were enrolled. Expression of Notch1 in cancerous tissue and para-cancer noncancerous tissue was determined by immunohistochemistry. The correlation between expression of Notch1 and clinicopathological characteristics of GC was analyzed. Results: Expression rate of Notch1 in cancerous tissue was significantly higher than that in para-cancer noncancerous tissue (73.9%vs. 3.5%,P<0.001). Notch1 expression in cancerous tissue was significantly correlated with depth of vascular involvement, lymph node metastasis and TNM stage of GC (P<0.05). Conclusions: Notch1 as a cancer-promoting gene is involved in the pathogenesis of GC, and has a close association with tumor invasion and metastasis.

Key wordsStomach Neoplasms;Notch1;Immunohistochemistry;Helicobacterpylori

胃癌是全球第四大常見惡性腫瘤，早期診斷率低，5年總體生存率僅為10%~40%[1-2]。我國是胃癌高發(fā)國家，發(fā)病率和死亡率分別占惡性腫瘤的第二和第三位，盡管近年來發(fā)病率呈下降趨勢，但每年新發(fā)胃癌病例仍高達40萬，死亡人數(shù)達30萬[3]。胃癌的發(fā)生是多因素參與的多步驟復(fù)雜病理過程，受飲食、環(huán)境、幽門螺桿菌(Hp)感染、遺傳等多種因素影響。近年來，Notch信號通路在腫瘤發(fā)生機制中的作用成為研究熱點，并作為某些腫瘤(如白血病、乳腺癌)新的治療靶點而備受關(guān)注[4-6]，但Notch1在胃癌中的表達及其作用機制尚未完全明確。本研究收集115例胃癌患者的癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織標本，檢測Notch1表達水平，并分析其表達在胃癌中的意義，以期為胃癌診治提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、標本獲取

納入2011年10月—2014年7月于嘉興市第一醫(yī)院行手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的胃癌患者115例，其中男83例，女32例，年齡39~82歲，平均(60.34±8.78)歲。所有患者術(shù)前均未接受放化療，臨床病理資料和隨訪記錄完整。收集患者術(shù)后胃癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織(距癌組織邊緣≥5 cm)標本。采集患者性別、年齡、腫瘤部位、大小、浸潤深度、分化程度、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Hp感染等臨床資料。研究方案經(jīng)嘉興市第一醫(yī)院倫理委員會批準，患者或其家屬簽署知情同意書。

二、研究方法

Notch1免疫組化染色：采用免疫組化EnVision二步法檢測胃癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織中Notch1的表達和分布。石蠟包埋組織5 μm厚度連續(xù)切片，脫蠟和水化；切片入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=6.0)，于微波爐內(nèi)抗原修復(fù)20 min，室溫冷卻后PBS漂洗；3% H2O2封閉10 min，PBS漂洗；加入Notch1兔抗人單克隆抗體(1∶150)(購自英國Abcam公司)，4 ℃過夜；PBS漂洗，滴加二抗，37 ℃孵育1 h；PBS漂洗，DAB顯色，自來水洗滌，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，陽性對照由一抗試劑盒提供。

結(jié)果判定：Notch1免疫組化染色陽性物質(zhì)定位于細胞質(zhì)，胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色判定為陽性細胞。由2名病理醫(yī)師進行獨立雙盲評分。每例標本于光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個200倍視野，判讀視野中Notch1染色范圍和染色強度，進行半定量評分，結(jié)果取均值。評分標準參考張勇等[7]的研究：①染色范圍計分：陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)比率<5%、6%~25%、26%~50%、51%~75%、>75%分別記0、1、2、3、4分；②染色強度計分：無染色、淡黃色、棕色、棕褐色分別記0、1、2、3分。總分為染色范圍計分與染色強度計分的乘積：0分為陰性；1~4分為(+)；5~8分為(++)；9~12分為(+++)。1~4分為低表達，5~12分為高表達。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；Notch1表達與胃癌臨床病理特征關(guān)系的分析采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、Notch1表達和分布

Notch1陽性染色物質(zhì)主要定位于細胞質(zhì)，呈黃色至棕色顆粒(圖1)。胃癌組織中Notch1陽性表達率為73.9%(85/115)，其中25.2%(29/115)為低表達，48.7%(56/115)為高表達，26.1%(30/115)呈陰性。癌旁非癌組織中Notch1陽性表達率僅為3.5%(4/115)，均為低表達。Notch1在胃癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁非癌組織(P<0.001)。

圖1胃癌組織Notch1蛋白表達(免疫組化EnVision二步法，×200)

二、Notch1表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織中的Notch1表達與腫瘤脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤部位、大小、浸潤深度、分化程度、神經(jīng)浸潤、Hp感染無關(guān)(P>0.05)。有脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM Ⅲ期的胃癌患者，其Notch1陽性表達率分別顯著高于無脈管浸潤、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM Ⅰ、Ⅱ 期患者，TNM分期越晚，Notch1陽性表達率越高(Kappa=0.036，P<0.05)(表1)。

討論

Notch基因于1917年在果蠅體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，因該基因部分缺失可致果蠅翅緣部分缺失而得名[8]。Notch廣泛表達于從無脊椎動物到哺乳動物的多個物種，是一個在進化上十分保守的跨膜受體蛋白家族[9]。1991年在人類T細胞白血病中發(fā)現(xiàn)Notch1，提示Notch信號通路與腫瘤發(fā)生相關(guān)[10]。

Notch信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，由受體、配體和DNA結(jié)合蛋白三部分組成。哺乳動物中共有Notch1~4四種Notch受體，以及五種相應(yīng)配體，包括delta樣配體(DLL)1、3、4和Jagged-1、Jagged-2[11]。Notch受體廣泛分布于造血干細胞、胚胎干細胞、淋巴細胞、血管內(nèi)皮細胞等多種細胞表面。

表1　Notch1表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系n(%)

Notch信號通路異常與某些腫瘤的發(fā)生有關(guān)，異常表達的Notch具有調(diào)控腫瘤細胞生長、代謝以及細胞周期等作用[12]。在不同組織起源的腫瘤或同種腫瘤的不同階段，Notch信號通路可發(fā)揮抑制或促進腫瘤的作用。在絕大多數(shù)腫瘤中，Notch信號通路發(fā)揮促癌作用，如T細胞白血病、結(jié)直腸癌、乳腺癌等[4,13-14]。在小部分腫瘤中，Notch信號通路發(fā)揮抑癌作用，如甲狀腺癌、非小細胞肺癌等[15-16]。

Notch信號通路在胃癌發(fā)生中的作用目前尚未完全明確，但已有研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Notch表達水平明顯增高。Yeh等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中的Notch1表達與腫瘤大小、病理分級、浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，Notch1可通過環(huán)氧合酶-2促進癌巢形成。李大衛(wèi)等[18]通過高通量組織芯片技術(shù)證實Notch1在胃癌組織中高表達，其與下游NF-κB組成的信號通路可能參與了胃癌的發(fā)生、侵襲、浸潤等惡性生物學(xué)行為；進一步行多因素生存分析，發(fā)現(xiàn)Notch1可作為預(yù)測胃癌患者生存和預(yù)后的指標。Du等[19]對15項基于胃癌Notch通路的臨床研究(共1 547例胃癌患者)行meta分析，發(fā)現(xiàn)Notch1在胃癌組織中的表達顯著高于正常組織；進一步的分析顯示，Notch1表達與腫瘤部位、大小、Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、臨床分期無關(guān)。然而，亦有研究[20]發(fā)現(xiàn)Notch1在胃癌組織中的表達低于癌旁非癌組織，認為Notch1在胃癌發(fā)生中可能起抑癌基因的作用。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中的Notch1陽性表達率高達73.9%，而癌旁非癌組織陽性表達率僅為3.5%。對胃癌組織中的Notch1陽性表達率與胃癌臨床病理特征行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Notch1表達與腫瘤脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，提示Notch1作為促癌基因參與了胃癌的發(fā)生，并與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。

Hp作為 Ⅰ 類致癌原，與胃癌的關(guān)系已得到廣泛研究，但具體致癌機制仍未完全明確。盡管有研究發(fā)現(xiàn)Jagged1、NF-κB在Hp感染相關(guān)胃黏膜慢性炎癥等病變中表達上調(diào)[21-22]，但趙娜等[23]的研究顯示胃癌組織中Notch1、Jagged1和NF-κB異常表達均與Hp感染無關(guān)。本研究中胃癌患者的Hp感染率為33.0%，相關(guān)性分析顯示胃癌組織中的Notch1表達與Hp感染無關(guān)，提示Notch1參與胃癌發(fā)生的機制可能并非通過Hp感染引起胃黏膜癌變。目前普遍認為Hp感染主要作用于胃癌發(fā)生的早期階段，當胃癌發(fā)展至進展期后，由于涉及多種遺傳物質(zhì)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，Hp的影響逐漸減弱。

綜上所述，本研究探索了胃癌組織中Notch1的表達情況及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，研究結(jié)果顯示Notch1參與了胃癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移。有研究[17-18]指出，Notch1可作為胃癌預(yù)后的獨立預(yù)測因子，其高表達提示預(yù)后不良，因此Notch1有可能成為一個新的腫瘤標記物，有助于完善現(xiàn)有胃癌預(yù)后評估系統(tǒng)，亦可能成為胃癌治療的新靶點。此外，有研究指出DLL4-Notch1信號通路在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[24]，Notch1高表達可促進CD44+胃癌干細胞增殖[25]，但目前關(guān)于Notch1在這些過程中的具體作用機制尚未闡明，有待進一步探索。

參考文獻

1 Guggenheim DE, Shah MA. Gastric cancer epidemiology and risk factors[J]. J Surg Oncol, 2013, 107 (3): 230-236.

2 Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2007[J]. CA Cancer J Clin, 2007, 57: 43-66.

3 吳菲，林國楨，張晉昕. 我國惡性腫瘤發(fā)病現(xiàn)狀及趨勢[J]. 中國腫瘤, 2012, 21 (2): 81-85.

4 Nefedova Y, Gabrilovich D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies[J]. Drug Resist Update, 2008, 11 (6): 210-218.

5 張永渠，豆曉偉，張國君. Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與乳腺癌靶向治療[J]. 國際腫瘤學(xué)雜志, 2013, 40 (9): 678-680.

6 Rizzo P, Osipo C, Foreman K, et al. Rational targeting of Notch signaling in cancer[J]. Oncogene, 2008, 27 (38): 5124-5131.

7 張勇，王德盛，周亮，等. Notch1在肝癌組織中的表達情況及其臨床意義[J]. 中華消化外科雜志, 2013, 12 (5): 378-382.

8 Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development[J]. Science, 1999, 284 (5415): 770-776.

9 Ehebauer M, Hayward P, Arias AM. Notch, a universal arbiter of cell fate decisions[J]. Science, 2006, 314 (5804): 1414-1415.

10Ellisen LW, Bird J, West DC, et al. TAN-1, the human homolog of the Drosophila notch gene, is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms[J]. Cell, 1991, 66 (4): 649-661.

11Guruharsha KG, Kankel MW, Artavanis-Tsakonas S. The Notch signalling system: recent insights into the complexity of a conserved pathway[J]. Nat Rev Genet, 2012, 13 (9): 654-666.

12祝普利，王德盛，周亮，等. Notch信號通路在肝癌中的研究進展[J]. 臨床肝膽病雜志, 2012, 28 (7): 557-558.

13Rodilla V, Villanueva A, Obrador-Hevia A, et al. Jagged1 is the pathological link between Wnt and Notch pathways in colorectal cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106 (15): 6315-6320.

14Al-Hussaini H, Subramanyam D, Reedijk M, et al. Notch signaling pathway as a therapeutic target in breast cancer[J]. Mol Cancer Ther, 2011, 10 (1): 9-15.

15Cook M, Yu XM, Chen H. Notch in the development of thyroid C-cells and the treatment of medullary thyroid cancer[J]. Am J Transl Res, 2010, 2 (1): 119-125.

16Chen Y, Li D, Liu H, et al. Notch-1 signaling facilitates survivin expression in human non-small cell lung cancer cells[J]. Cancer Biol Ther, 2011, 11 (1): 14-21.

17Yeh TS, Wu CW, Hsu KW, et al. The activated Notch1 signal pathway is associated with gastric cancer progression through cyclooxygenase-2[J]. Cancer Res, 2009, 69 (12): 5039-5048.

18李大衛(wèi)，吳晴，彭志海，等. 組織芯片研究Notch1與NF-κB在胃癌中的表達和意義[J]. 腫瘤, 2007, 27 (6): 458-461.

19Du X, Cheng Z, Wang YH, et al. Role of Notch signaling pathway in gastric cancer: a meta-analysis of the literature[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20 (27): 9191-9199.

20勾朝陽，哈敏文，李紅. Notch1 在人胃癌組織中的表達及意義[J]. 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2010, 39 (5): 356-358.

21Katoh M. Dysregulation of stem cell signaling network due to germline mutation, SNP,Helicobacterpyloriinfection, epigenetic change and genetic alteration in gastric cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2007, 6 (6): 832-839.

22Takeshima E, Tomimori K, Kawakami H, et al. NF-kappaB activation byHelicobacterpylorirequires Akt-mediated phosphorylation of p65[J]. BMC Microbiol, 2009, 9: 36.

23趙娜，周梅愷，葉玉偉，等. 胃癌組織中Notch1、Jagged1及NF-κB的表達及臨床意義[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2012, 32 (8): 1061-1065.

24Hellstr?m M, Phng LK, Hofmann JJ, et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis[J]. Nature, 2007, 445 (7129): 776-780.

25席小龍，姜波健，俞繼衛(wèi)，等. 腫瘤干細胞相關(guān)信號通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的研究進展[J]. 世界華人消化雜志, 2014, 22 (4): 494-500.

(2015-07-19收稿；2015-08-29修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.01.007

*本文通信作者，Email: xccmail@163.com