胡志剛 楊保華 (新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師新湖農(nóng)場 新疆 瑪納斯 832208)
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如何發(fā)揮獸醫(yī)實驗室檢測的最大效能
胡志剛 楊保華 (新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師新湖農(nóng)場 新疆 瑪納斯 832208)
隨著養(yǎng)殖業(yè)對生產(chǎn)系統(tǒng)和管理思維的不斷突破,致使規(guī)?;B(yǎng)殖場生產(chǎn)體系重心也發(fā)生轉(zhuǎn)變,由以前的以生產(chǎn)性能、疫苗免疫和藥物保健為重點(diǎn)的生產(chǎn)體系轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀瞬排囵B(yǎng)、繁育體系和健康管理為重點(diǎn)的生產(chǎn)體系。而生產(chǎn)體系的本質(zhì)就是如何發(fā)現(xiàn)問題、進(jìn)行決策、解決問題、群體健康預(yù)警、評價群體健康狀況是否得到改善,實驗室檢測是重要的技術(shù)手段的之一。新時代下,畜牧人已經(jīng)認(rèn)識到實驗室檢測在種畜源頭凈化、疾病風(fēng)險預(yù)警、免疫效果評估、疾病傳播控制和協(xié)助健康管理等方面的價值。專業(yè)的實驗室檢測是一個非??b密的系統(tǒng)工程,包含檢測前、檢測中、檢測后3個關(guān)鍵點(diǎn)。
背景是指所采樣品主體的生產(chǎn)性能、用藥和免疫情況及臨床現(xiàn)狀;樣品統(tǒng)計意義是指所采集樣品要具有統(tǒng)計學(xué)意義,可以按生產(chǎn)階段連續(xù)性系統(tǒng)采樣(如公豬群、后備母豬群、生產(chǎn)母豬群、仔豬群、保育豬群、育肥豬群),也可以緊密結(jié)合免疫程序采樣(仔豬分周齡,母豬分胎次連續(xù)采樣)。重點(diǎn)監(jiān)測群體和時間點(diǎn)可以按照以下方式進(jìn)行(以豬為例):
1.1 生產(chǎn)母豬群 (1)母豬群健康關(guān)系仔豬保育期間的成活率:豬場疾病的根源來自于種豬,種豬帶毒、散毒是保育期仔豬難養(yǎng)的根源。(2)適宜母豬群檢測的項目及時間:母豬的檢測應(yīng)選擇母豬的特殊敏感期,在此階段母豬免疫機(jī)能下降,容易發(fā)病或向外散毒,適宜檢測的時間及項目有:①防控流行性腹瀉于產(chǎn)前15~20d可采集奶水或肛門處的糞便,通過PCR和接種細(xì)胞檢測病原,如果為陽性,可做緊急隔離、疫苗接種或返飼;②配種前后重點(diǎn)監(jiān)測偽狂犬病毒,配種前后偽狂犬病毒感染可影響胚胎著床,通過抗體檢測可確定配種前是否需要加強(qiáng)免疫偽狂犬疫苗;③種豬凈化:空懷期活體采集扁桃體,檢測豬瘟、偽狂犬和藍(lán)耳病原,淘汰帶毒種豬,這對于溫和性豬瘟的凈化尤其重要(我國的種豬的豬瘟帶毒率為8~10%,導(dǎo)致豬場藍(lán)耳爆發(fā)時形成免疫抑制往往表現(xiàn)為混感豬瘟);④流產(chǎn)母豬管理:發(fā)生流產(chǎn)的母豬檢測臍帶血,如果確定為病毒性疾病導(dǎo)致的流產(chǎn),短期內(nèi)禁止配種。隔離至少3個月后再次檢測病原,檢測合格方可使用。
1.2 公豬群 (1)公豬關(guān)系生產(chǎn)安全:公豬主要提供優(yōu)質(zhì)精液,精液質(zhì)量影響生產(chǎn)成績。試驗已經(jīng)證實,部分病毒感染公豬精囊后可導(dǎo)致精液質(zhì)量下降,如偽狂犬、圓環(huán)和藍(lán)耳等。此外公豬精液帶毒的還可在配種過程中感染母豬,這在偽狂犬的疾病傳播途徑中表現(xiàn)的尤為顯著,因此需關(guān)注公豬精液檢測,檢測方法多用PCR;(2)公豬的檢測時間:公豬應(yīng)定期檢測,最好每季度檢測一次精液和血清。精液除常規(guī)鏡檢外,還需進(jìn)行病原檢測,如檢測出藍(lán)耳,則該公豬3個月內(nèi)禁止采精;如精液中檢測出偽狂犬病毒,則需堅決淘汰。公豬的偽狂犬檢測應(yīng)配合血清學(xué)檢測,如血清學(xué)檢測陽性,但精液病原為陰性,則此公豬需隔離飼養(yǎng),加大偽狂犬疫苗免疫頻次,預(yù)防病原向精囊傳播,但其精液仍可用,不必淘汰該公豬。
1.3 后備種豬群 后備豬群的篩選需將抗體和抗原檢測相結(jié)合,但篩選的時間需要做考量,考量標(biāo)準(zhǔn)參照病原的免疫持續(xù)期規(guī)律。如偽狂犬的母源抗體的持續(xù)期可達(dá)27個周,在偽狂犬陽性場(但生產(chǎn)基本穩(wěn)定)的采血時間需要在27周后(因為如果沒有病原中和母源抗體,其母源抗體將持續(xù)至27周,因此篩選時應(yīng)注意區(qū)別對待)。其他病毒性疾病也有類似的考量,如藍(lán)耳的持續(xù)感染期時間較長,病毒血癥期易反復(fù),這些因素均需考慮在內(nèi)。
1.4 新引進(jìn)種群 新引進(jìn)的種群是豬場引進(jìn)外來病毒的重要途徑,新引進(jìn)的種群的免疫程序與豬場現(xiàn)階段的免疫程序存在差異(至少存在疫苗產(chǎn)商的差異),所以有可能新引進(jìn)的種群在原有的免疫程序下可保護(hù)豬群不發(fā)病,不散毒,但換用豬場的免疫程序后難以防控。因此對于新引進(jìn)種群需做好以下工作:(1)嚴(yán)格的隔離,至少隔離3個月以上;(2)換用豬場的免疫程序后進(jìn)行評價,評價合格后才可配種;(3)在一年內(nèi)禁止混群,直到通過檢測確定不散毒才可以考慮混群飼養(yǎng);
1.5 保育群 保育期仔豬抵抗力差,是疾病感染高發(fā)期,所以在不穩(wěn)定場不檢測抗體。可以剖殺幾頭發(fā)病豬采集病料檢測,提高檢出效率。穩(wěn)定場保育期間大多數(shù)疫苗免疫期已超過一個月,在此期間檢測抗體,評價免疫程序,關(guān)鍵評價母源抗體是否產(chǎn)生了干擾,從而調(diào)整部分疫苗的免疫程序。
1.6 育肥豬群 育肥豬群是容易被忽視的豬群,此階段豬的抵抗力強(qiáng),疾病感染后往往不表現(xiàn)出非常嚴(yán)重的癥狀,但會影響飼料報酬。舉例說明,偽狂犬對育肥豬的危害主要在呼吸道疾病,導(dǎo)致咳喘,如有類似癥狀在咳喘后5d左右采血檢測,如果檢出病原為偽狂犬,在90~120日齡加強(qiáng)免疫1次,其產(chǎn)生的價值是比未做處理的育肥豬可提前至少5d出欄,經(jīng)濟(jì)效益遠(yuǎn)高于疫苗免疫成本。
系統(tǒng)的質(zhì)量控制體系,是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠地基礎(chǔ),檢測方法所采納的標(biāo)準(zhǔn),檢測儀器的合格使用,檢測人員知識架構(gòu)及技術(shù)操作的專業(yè)性,檢測人員對診斷檢測試劑的深入理解(根據(jù)檢測目的,選擇不同試劑)。實驗室檢測通用的方法及適用范圍如下:
2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) (1)優(yōu)點(diǎn):操作簡單,省時快捷,可同時檢測多個樣本,普通養(yǎng)殖場或獸醫(yī)站即可考慮配置,對人員素質(zhì)要求不高;(2)缺點(diǎn):大部分試劑盒不能區(qū)分野毒和疫苗毒;其抗體滴度與具有保護(hù)性的中和抗體滴度無絕對線性關(guān)系,在藍(lán)耳抗體檢測尤為明顯(即檢出的抗體滴度是雜抗體的滴度,意味著抗體滴度高,保護(hù)力未必高,這只能作為疫苗免疫后產(chǎn)生免疫力或感染發(fā)生的依據(jù))。(3)ELISA的適用范圍:①穩(wěn)定場的免疫程序評價:如首免日齡的確定,通過抗體檢測可確定母源抗體是否存在干擾及最佳的免疫日齡;②檢測疾病的感染率:適用于未做某種疫苗的疾病的感染狀態(tài)評估(偽狂犬除外)。③不穩(wěn)定場通過檢測抗體判斷是否發(fā)?。菏强梢酝ㄟ^離散度和抗體滴度判定。由于病原感染和疫苗免疫均可以產(chǎn)生抗體,因此當(dāng)疫情來臨時,通過ELISA不能判定哪些抗體是疫苗產(chǎn)生的,哪些是病原產(chǎn)生的,因此必需結(jié)合病原檢測(PCR)結(jié)果才能確診。(4)ELISA檢測的注意事項:①抗體檢測需要足夠的樣本數(shù):一般母豬群樣本數(shù)至少10%,樣本數(shù)過少,隨機(jī)性太大,容易誤判;②周期性的抗體檢測數(shù)據(jù)更有價值:抗體檢測應(yīng)具有周期性,通過對比近期數(shù)據(jù)與前幾年同時期的數(shù)據(jù),對于豬場的科學(xué)決策具有參考價值。
2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR或RT-PCR)及基因序列測定(1)優(yōu)點(diǎn):針對性強(qiáng)、可確診;可區(qū)分野毒與疫苗毒;q-PCR可確定病毒載量,確定發(fā)病的主因;(2)缺點(diǎn):操作復(fù)雜,需專業(yè)人員操作,責(zé)任心強(qiáng);要求較高,專業(yè)人員需要有深厚的分子生物學(xué)基礎(chǔ),了解病原的基因結(jié)構(gòu),此外還需要有方法的支持(針對不同病原,不同基因型的多套可靠的引物序列)。大型規(guī)模場從數(shù)據(jù)真實準(zhǔn)確的角度上考慮也需要考慮配置,如不能配置也需要有可靠的合作單位。(3)PCR及測序適用范圍:①疾病診斷,確定多種病原,適用于分析發(fā)病的主因;②通過測序可確定病原基因型,便于對癥用苗;對藍(lán)耳的免疫尤為重要。(4)PCR及測序注意事項:①不穩(wěn)定場首先應(yīng)考慮采用PCR檢測病料;②PCR檢測應(yīng)保證病料的新鮮,路途較遠(yuǎn)時需冷凍后送檢;③檢測時避免污染,實驗室中應(yīng)有相應(yīng)的設(shè)施確保不出現(xiàn)氣溶膠污染。
2.3 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試驗 體外培養(yǎng)的細(xì)胞可以模擬動物試驗體內(nèi)的結(jié)果,也可用于活毒的擴(kuò)繁、毒價的測定等工作,是未來發(fā)展的方向。目前在幾個大集團(tuán)均有此設(shè)施,但該實驗室對潔凈程度和操作人員素質(zhì)要求特別高,需要生物安全柜和相應(yīng)的細(xì)胞室,可以完成以下幾方面工作:(1)病毒分離鑒定:分離純化病毒,便于進(jìn)一步分析病毒的致病性。(2)交叉中和試驗:利用分離的毒株進(jìn)行交叉中和試驗,可更科學(xué)地判斷疫苗免疫的中和抗體對豬場分離株的中和效果,其評估的結(jié)果優(yōu)于基因測序比對。(3)血清馴化:比在活體動物上繁殖病毒安全性更高,更穩(wěn)定。(4)毒價測定:可用于測定疫苗毒價或“返飼”材料的毒價;如流行性腹瀉“返飼”成功要素有以下兩要點(diǎn):①“返飼”材料純凈,無PCV2和PRV等病原。②毒價確定,“返飼”的病毒量需要滴定,否則母豬返飼后有散毒風(fēng)險;而這些問題可通過PCR及細(xì)胞相關(guān)試驗解決。
對檢測數(shù)據(jù)的分析,數(shù)據(jù)分析需要精通專業(yè)知識,掌握分析指標(biāo)。
3.1 專業(yè)知識 系統(tǒng)的免疫基礎(chǔ)知識,如首免與二免的作用;母源抗體與半衰期(持續(xù)時間);免疫后產(chǎn)生保護(hù)及能檢測到的保護(hù)抗體的時間;檢測試劑及其所測指標(biāo)的意義:(1)豬瘟一免后無一例外地表現(xiàn)出抗體水平下降的趨勢,二免后表現(xiàn)出顯著地保護(hù)抗體上升。(2)母源抗體的半衰期:PRVgB抗體一般可維持至8~10周,CSFV抗體4~6周,而PRVgE抗體可以維持至13~16周齡。(3)疫苗免疫保護(hù)與抗體消長規(guī)律。通常情況下,活疫苗免疫后1~2周產(chǎn)生保護(hù),而2~3周試劑才能檢測到保護(hù)指征性抗體,而滅活疫苗分別為2~3周和3~4周。(4)檢測試劑及其所測指標(biāo)的意義:不同公司的試劑盒,其設(shè)計原則及檢測指標(biāo)的意義不同,不同試劑盒抗體陽性指征性完全不同(即與免疫保護(hù)力的關(guān)系不同)。例如核衣殼蛋白(N蛋白)包被的藍(lán)耳病抗體ELISA檢測試劑盒,檢測早期感染抗體,與SN檢測結(jié)果沒有相關(guān)性;膜蛋白(M蛋白)包被的藍(lán)耳病抗體ELISA檢測試劑盒;與IFA 或者IPMA方法相似,與SN抗體有一定的相關(guān)性,可在一定程度上反應(yīng)免疫保護(hù)效果。
3.2 分析指標(biāo) 主要從免疫評估和群體野毒感染/壓力監(jiān)控兩方面分析。(1)免疫評估包括抗體陽性率、抗體水平(抗體平均值,群體內(nèi)個體分布)及離散度。離散度在某種程度上比抗體水平更重要,一般情況下要控制在30%~40%,它反應(yīng)疫苗免疫的均一性及操作的穩(wěn)定性。(2)群體野毒感染/壓力抗體監(jiān)控:使用特異的抗體鑒別檢測試劑盒(PRVgE抗體及FMDV3ABC抗體);抗體水平異常高,離散度大,提示群體有感染風(fēng)險;通過連續(xù)的跟蹤監(jiān)測(至少2~3次/年)和調(diào)整,設(shè)立養(yǎng)殖場的免疫基底線,離散度及抗體水平的突然異常作為養(yǎng)殖管理異動的信號,低于基底值,說明免疫有問題(疫苗、程序、操作等),高于基底值,可懷疑感染。
總之實驗室檢測是一項系統(tǒng)工程,需要嚴(yán)格規(guī)范的硬件和軟件條件,如機(jī)構(gòu)的設(shè)備、實驗室的環(huán)境、質(zhì)量的品控、人員操作、專業(yè)的檢測試劑等,而且檢測的數(shù)據(jù)分析一定要與臨床相結(jié)合,光看原始數(shù)據(jù),非結(jié)合臨床實踐得出的檢測數(shù)據(jù)是沒有意義的。規(guī)模場可以籌建適合自身發(fā)展需要的實驗室或與可靠實驗室建立合作,發(fā)揮獸醫(yī)實驗室檢測的最大效能。
收稿日期:(2016–01–07)
中圖分類號:S851.33
文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B
文章編號:1007-1733(2016)03-0042-03