郭湘，費櫻

（1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院）

耐碳青霉烯酶類抗生素鮑曼不動桿菌的同源性及其對亞胺培南的耐藥機制

郭湘1，費櫻2

（1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院）

目的 探討耐碳青霉烯酶類抗生素鮑曼不動桿菌（AB）的同源性及其對亞胺培南的耐藥機制。方法用擴增性核糖體DNA限制性酶切片段分析法（ARDRA）對臨床收集的140株AB進(jìn)行分子分型，用腸桿菌科重復(fù)基因保守序列PCR（ERIC-PCR）對確定為AB的菌株進(jìn)行同源性分析，用熒光定量PCR法檢測20株耐藥菌株和20株敏感菌株外膜蛋白CarO和外排泵基因AdeB mRNA表達(dá)。結(jié)果 140株菌株經(jīng)ARDRA鑒定為AB的130株。90株AB經(jīng)ERIC-PCR法分為6個型別，主要為A型（65株）、B型（19株），C、D、E、F型為散在株。AB耐藥菌株外膜蛋白CarO mRNA相對表達(dá)量低于敏感菌株，外排泵AdeB mRNA相對表達(dá)量高于敏感菌株（P均＜0.05）。結(jié)論

分離的AB基因型以A、B兩型為主，且存在部分克隆株散在傳播；外膜蛋白Caro低表達(dá)、外排泵基因AdeB高表達(dá)是AB對亞胺培南耐藥的重要機制。

鮑曼不動桿菌；同源性；外膜蛋白；外排泵

鮑曼不動桿菌（AB）是革蘭陰性非發(fā)酵桿菌，是引起臨床感染的重要條件致病菌之一［1，2］，已成為院內(nèi)感染的主要病原菌之一，在非發(fā)酵菌的感染中僅次于假單胞菌［3］，并且容易引起暴發(fā)流行。近年來隨著抗菌藥物的廣泛使用，臨床分離得到的AB耐藥性越來越嚴(yán)重［4］。有研究顯示，外膜蛋白Caro是亞胺培南進(jìn)入細(xì)菌的孔道，與外排泵一起介導(dǎo)AB對亞胺培南的耐藥［5，6］。本研究探討耐碳青霉烯酶

類抗生素AB的同源性及其耐藥機制。

1　材料與方法

1.1細(xì)菌、試劑及儀器 2011年7月～2012年8月收集貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床各科室分離的對亞胺培南耐藥的非重復(fù)AB 100株，經(jīng)自動化細(xì)菌鑒定儀鑒定，用于ERIC-PCR同源性分析；收集本院臨床各科室分離的對亞胺培南耐藥和敏感的AB各20株非重復(fù)AB，藥敏結(jié)果經(jīng)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會的細(xì)菌最低抑菌圈濃度（MIC）判定標(biāo)準(zhǔn)判定，用于熒光定量PCR檢測。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、10×PCR Buffer、DNA Marker、瓊脂糖、5×TBE、EB溶液、限制性內(nèi)切酶、TRIzol試劑盒、TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix EX TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒均購于寶生物（大連）工程有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增儀GeneAmp PCR system 9700（美國PE公司）、DNA成像分析儀Gel Doc EQ（BIO-RAD公司）、DYY-Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）、Light Cycler 480熒光定量PCR儀（Rocher公司）。

1.2AB分子分型鑒定 采用擴增性核糖體DNA限制性酶切片段分析法（ARDRA）。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取細(xì)菌的基因組DNA。細(xì)菌基因組DNA擴增，反應(yīng)體系總體積為25 μL：ddH2O 8 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物（10 μmmoL／L）各1.5 μL、Premix ExTaq 12 μL。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72℃延伸7 min；ARDRA引物序列F：5′-TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGC-3′，5′-TACCTTGTTACGACTTCACCCCA-3′。將PCR產(chǎn)物分別用Cfo I、Alu I、Mbo I、Rsa I和Msp I 5種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切、電泳、掃描成像分析。每種限制性內(nèi)切酶根據(jù)所切片段大小不同可分成不同的型別，5種內(nèi)切酶型5個數(shù)字的排列組合代表不動桿菌不同基因型，如：11121、11123或11121+3。

1.3AB同源性檢測 采用腸桿菌科重復(fù)基因保守序列PCR法（ERIC-PCR）。取ARDRA鑒定為11123型和11121+3型的90株確定為AB的菌株，引物序列：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，PCR反應(yīng)體系25 μL：ddH2O 8 μL、模板DNA 2 μL、引物1 μL、Premix ExTaq 12 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃5 min，94℃45 s，55℃50 s，72℃2 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。電泳、掃描成像分析。電泳條帶數(shù)目和位置相同的為同一基因型別。

1.4AB外膜蛋白CarO和外排泵基因AdeB mRNA表達(dá)檢測 采用熒光定量PCR法。取20株耐藥菌株、20株敏感菌株，用TRIzol試劑提取AB總RNA，測定吸光度（A）值，A260／280為1.8～2.0可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。基因組DNA去除反應(yīng)：5×gDNA E-raser Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、Total RNA 2.0 μL、RNase Free dH2O 5.0 μL，將上述各試劑混合后，于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，42°C 20 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：5×PrimeScript?Buffer 2 4.0 μL、PrimeScript?RT Enzyme MixⅠ1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、基因組DNA去除反應(yīng)、RNase Free dH2O 4.0 μL，37° C 15 min、85°C 5 s。使用SYBR Premix EX TaqⅡ法進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系共25 μL，包括SYBR Premix EX TaqⅡ12.5 μL、模板從cDNA 2.0 μL、上下游引物各1.0 μL、RNase Free dH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，60℃30 s，循環(huán)40次，每個樣本重復(fù)3次。Caro引物序列F：5′-GCGGCTTACCTTGATAACG-3′，R：5′-ACCGCAATAAAGTCTTGGT-3′；AdeB引序列物F：5′-AATGCGTGAAATGGAACAACTG-3′；R：5′-TGTGATTCAGACTGCTTTTCCTG-3′；rpoB引物序列F：5′-GATGGCTGGTCGTCACGG-3′，R：5′-GATGGTACACCCAGCGGG-3′，由rpoB作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt公式計算Caro、AdeB mRNA相對表達(dá)量，其中ΔCt＝Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AB分子分型 用于ERIC-PCR同源性分析的100株菌株，90株確定為AB，10株由于酶切條帶不清晰或者沒有條帶無法判斷。用于實時熒光定量PCR檢測的40株菌株確定均為AB。

2.2AB的同源性 經(jīng)ERIC擴增后DNA片段的條帶2～6條，90株鮑曼不動桿菌經(jīng)ERIC-PCR基因分型，共有6個型別，分別命名為A～F型，其中A型65株，B型19株，C型2株，D型2株，E、F型各1株，C、D、E、F為散在株。

2.3AB耐藥菌株、敏感菌株外膜蛋白CarO、外排泵基因AdeB mRNA表達(dá) AB耐藥菌株、敏感菌株外膜蛋白CarO mRNA相對表達(dá)量分別為0.22± 0.10、1.16±0.18，外排泵基因AdeB mRNA相對表達(dá)量分別為1.99±0.33、0.50±0.26，外膜蛋白CarO、外排泵基因AdeB mRNA相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

3　討論

對于不動桿菌屬的鑒定，多數(shù)臨床實驗室采用的是自動化細(xì)菌鑒定儀，但是細(xì)菌鑒定儀Phoenix和Vitek2 Compact鑒定到種的準(zhǔn)確率分別只有44%、56%［7］，準(zhǔn)確率不高。因此在做AB的同源性分析以及耐藥機制的研究前，使用ARDAR先對臨床收集的標(biāo)本進(jìn)行了分子分型，從而保證了同源性分析及耐藥機制研究結(jié)果的可靠性。脈沖場凝膠電泳（PFGE）是細(xì)菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確率高，但是設(shè)備條件要求高，因此本試驗采用ERIC-PCR對AB進(jìn)行同源性分析。有研究顯示，運用ERIC-PCR與PFGE同時檢測48株銅綠假單胞菌同源性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法學(xué)結(jié)果的符合率為89.5%，PFGE重復(fù)3次結(jié)果相似度達(dá)96.6%，ERIC-PCR重復(fù)5次結(jié)果相似度達(dá)75.4%［8］。說明本研究采用的ERIC方法與PFGE結(jié)果一致性高，并且ERIC-PCR具有簡便、快速、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高等特點，是較為理想的用于分子流行病學(xué)調(diào)查的方法［9］。有研究表明，AB主要分布在ICU、神經(jīng)外科、呼吸內(nèi)科［10，11］，克隆株在病房內(nèi)以及在病房間的克隆播散是造成耐藥菌株不斷增加的主要原因［12，13］。對AB進(jìn)行同源性分析有助于從分子水平上明確耐藥菌株的傳播來源，從而有針對性地采取控制措施，有助于有效控制耐碳青霉烯酶類AB的播散流行。ERIC-PCR基因分型結(jié)果顯示主要為A、B兩型，其他型別為散發(fā)株，由此可見A、B型耐藥克隆株的傳播已經(jīng)成為本院AB對碳青霉烯抗菌藥物耐藥率升高的重要原因。

AB與碳青霉烯類抗生素耐藥相關(guān)的外膜蛋白是CarO［14］，由CarO基因編碼。不動桿菌對亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類抗生素的耐藥與CarO丟失或表達(dá)下降有關(guān)，隨著ABCarO表達(dá)下降或丟失，菌株對碳青霉烯類抗生素的通透性下降，藥物不能順利進(jìn)入菌體內(nèi)發(fā)揮作用而產(chǎn)生耐藥［15］。熒光定量PCR結(jié)果顯示，碳青霉烯酶類抗生素耐藥組的外膜蛋白CarO基因的表達(dá)量低于敏感組的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明外膜蛋白CarO的缺失或表達(dá)降低在AB對碳青霉烯酶類抗生素的耐藥中起重要作用。外排泵系統(tǒng)位于細(xì)菌細(xì)胞膜上，是一類具有轉(zhuǎn)運功能的蛋白質(zhì)。在細(xì)菌基礎(chǔ)代謝過程中，蛋白質(zhì)和酶的轉(zhuǎn)運一般都具有高度的特異性，但外排泵系統(tǒng)卻可以識別廣泛的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分不同的底物。外排泵系統(tǒng)可以主動泵出進(jìn)入菌體的抗菌藥物，使細(xì)菌胞內(nèi)有效藥物濃度減少而耐藥。熒光定量PCR結(jié)果顯示，碳青霉烯酶類抗生素耐藥組的外排泵AdeB基因的表達(dá)量高于敏感組的表達(dá)量，差異有有統(tǒng)計學(xué)意義，說明AB對碳青霉烯酶類抗生素的耐藥與外排泵AdeB的高度表達(dá)有關(guān)。本研究只是初步探討了外膜蛋白CarO和外排泵AdeB與AB耐藥的關(guān)系，而對其具體作用原理進(jìn)行探討，是未來研究的方向。

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Homology analysis and multidrug resistance mechanisms of carbapenem-resistant Acihetobacter baumanii

GUO Xiang1，F(xiàn)EI Ying

（1 Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

Objective To evaluate the homology of resistance to carbapenems of Acinetobacter baumannii（AB）and its resistance mechanism to imipenem.Methods The molecular classification was conducted in 140 strains of AB from clinical collection by using amplified ribosomal DNA restriction enzyme analysis（ARDRA），enterobacteriaceae repeat gene conserved sequence-PCR（ERIC-PCR）is applied to do the homology analysis of drug resistance of 90 strains of AB.The outer membrane protein CarO and efflux pump gene AdeB mRNA expression was detected in 20 strains of resistant strains and 20 strains of sensitive strains by fluorescence quantitative PCR.Results Totally 130 strains were identified as AB by ARDRA in 140 strains.After ERIC-PCR genotyping，90 strains of AB were divided into 6 types，mainly for type A（65 strains），type B（19 strains），type C，D，F(xiàn) and E（which were scattered in the strains）.The outer membrane protein CarO mRNA expression in the AB with drug-resistant strains was lower than that of the sensitive strains，while the efflux pump AdeB mRNA expression was higher（all P＜0.05）.Conclusions Type A and type B were mainly found in AB genotypes and there were scattered transmission of clone strains with resistance gene.The low expression of outer membrane protein Caro and high expression of efflux pump gene AdeB was the important mechanism of AB resistance to imipenem.

Acinetobacter baumannii；homology；outer membrane protein；efflux pump

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.007

R378

A

1002-266X（2016）21-0019-03

貴州省科技攻關(guān)計劃（黔科合SY字［2012］3147號）。

郭湘（1989-），男，在讀碩士，主要研究方向為細(xì)菌的耐藥機制。E-mail：770308473＠qq.com

簡介：費櫻（1968-），女，主任技師，本科，主要研究方向為細(xì)菌的耐藥機制。E-mail：645903661＠qq.com

（2016-02-26）