周思睿，鄧江

(1遵義醫(yī)學院，貴州遵義563000；2遵義醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院)

修復臨界及超臨界骨缺損的組織工程材料研究進展

周思睿1，2，鄧江2

(1遵義醫(yī)學院，貴州遵義563000；2遵義醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院)

臨床上臨界及超臨界骨缺損均需行手術(shù)治療，手術(shù)方法包括自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨及支架移植和組織工程技術(shù)。其中組織工程技術(shù)是一種新近發(fā)展起來的、具有廣闊前景的治療方法。自骨組織工程學建立以來，種子細胞、三維支架材料、細胞生長因子逐漸成為研究重點及熱點，目前已證實組織工程結(jié)合細胞生長因子能有效修復臨界及超臨界骨缺損，復合多種生長因子的組織工程材料可能是未來治療該病的新方向。

骨缺損；組織工程材料；種子細胞；支架；細胞生長因子

高能量損傷、腫瘤瘤段切除、感染等因素均可導致骨缺損，骨缺損在一定范圍內(nèi)骨組織可自行修復重建，但是當超過一定范圍及距離后無法自行愈合，該臨界點即為臨界骨缺損[1,2]。1986年Schmitz等基于動物實驗模型提出長骨干缺損達到直徑的1.5倍即可認定為臨界骨缺損，目前臨床上將臨界骨缺損的長度定為1.5～3.0 cm[3,4]。臨床常用治療骨缺損的方法為自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨及支架移植[5～7]。上世紀80年代美國Laner等[5]提出了組織工程學概念，Crane等[8]在此基礎(chǔ)上提出了骨組織工程學，即通過分離自體或異體組織細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)誘導其增殖分化為成骨細胞，再種植于具有良好的生物相容性、可被機體降解吸收的人工合成生物材料上，隨著支架降解吸收，逐漸形成新的骨組織而修復臨界及超臨界骨缺損(以下均簡稱為骨缺損)。用于修復骨缺損的組織工程材料主要包括種子細胞、三維支架材料和細胞生長因子，現(xiàn)對其研究進展綜述如下。

1 種子細胞

骨組織工程學所應用的種子細胞是可以增殖分化為具有成骨功能的細胞，可通過自體、異體的骨膜、骨髓或骨外組織分離培養(yǎng)獲得。理想的骨組織工程種子細胞應具備以下特點[9]:①來源方便；②在體外具有很強的增殖能力且能連續(xù)穩(wěn)定傳代；③在細胞生長因子誘導的作用下能定向分化；④無免疫原性。目前所應用的種子細胞以骨髓間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞和脂肪干細胞最為突出。

骨髓間充質(zhì)干細胞是指存在于骨髓腔內(nèi)，在特定誘導因子的作用下可以定向分化為骨細胞和成骨細胞的一類單核細胞。體外擴增的骨髓間充質(zhì)干細胞雖不會發(fā)生異常分化，但人為選擇過程中可能會導致細胞癌變。研究顯示，鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細胞在體外培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出惡性改變，長時間體外培養(yǎng)出現(xiàn)不斷累積的染色體變異[10]。據(jù)此國內(nèi)外學者提出了非細胞型組織工程化骨的概念，即紅骨髓不經(jīng)體外培養(yǎng)，與生長因子復合后立即植入支架材料，該概念的提出使臨床上應用組織工程技術(shù)修復骨缺損成為可能[11]。該方法操作簡單，不存在感染、癌變及再次手術(shù)等問題，為骨缺損的修復治療提供了新的方向[12,13]。

2 三維支架材料

理想的骨組織工程三維支架材料應具備以下特征：①有良好的生物相容性；②適中的三維多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率>80%，便于種子細胞的長入和增殖分化，同時有利于營養(yǎng)物質(zhì)、細胞生長因子的擴散及代謝產(chǎn)物的排出；④利于細胞生長，具有良好的細胞界面和表面活性；⑤良好的機械強度和可塑性，植入體內(nèi)后能在一定時間內(nèi)保持其原有形狀；⑥無免疫原性。三維支架材料不僅對細胞、組織具有鏈接和支持作用，同時能夠促進細胞的增殖、分化，并可調(diào)節(jié)細胞的爬行替代，是骨組織工程的重要成分。目前應用于骨組織工程的三維支架材料分為天然材料和人工合成材料，天然材料包括膠原蛋白、纖維蛋白、絲素蛋白、殼聚糖等，人工合成材料包括羥基磷灰石、聚乳酸及其聚合物等。

2.1 絲素蛋白 絲素蛋白是從蠶絲中提取獲得的，具有無毒、低免疫原性及良好的生物相容性等特點，是一種可吸收、可降解的高分子天然物質(zhì)。研究表明，使用絲素蛋白制備的支架材料能夠支持多種細胞的黏附、增殖及分化，已廣泛應用于組織工程領(lǐng)域[14]。也有報道認為，單一應用絲素蛋白制作的支架在干燥情況下機械強度低、易碎裂、溶失率高，需與其他生物材料復合制備來彌補其缺點[15]。

2.2 殼聚糖 殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，因其無毒、無氣味、可吸收降解、易于加工整形和良好的生物特性，在醫(yī)用材料領(lǐng)域得到廣泛應用，如制作人工皮膚、可吸收線、止血海綿等。軟骨基質(zhì)的主要化學成分是蛋白多糖，而氨基葡萄糖(GAGs)是其干鏈上許多短鏈蛋白的共價結(jié)合物。殼聚糖與GAGs分子式相似，因此有研究將殼聚糖制成支架，并應用于骨缺損的修復，取得了滿意效果[16]。但單一應用殼聚糖制備的支架機械強度較弱，降解吸收速度難以同組織細胞的生長速度相匹配。

2.3 羥基磷灰石 羥基磷灰石本身即為骨的無機成分之一，有良好的穩(wěn)固性，但不能被降解吸收；能復合骨髓間充質(zhì)干細胞分化成骨；具有良好的生物相容性，可與骨組織支架形成骨性結(jié)合，但無誘導成骨作用。有研究通過機械混合法、表面包覆法等人工合成納米羥基磷灰石，發(fā)現(xiàn)其比傳統(tǒng)羥基磷灰石更有利于成骨細胞的種植，并可加快其增殖、礦化成骨[17]。但是納米羥基磷灰石仍存在降解差、脆性大、難以塑性及生物力學特性較差等缺點，需復合其他材料制備支架。朱美忠等[18]通過納米羥基磷灰石與聚酰胺66制成具有復合生物活性的人工骨，在肢體骨缺損的修復治療中取得了滿意效果。

2.4 聚乳酸 聚乳酸是一種可降解的高分子材料，主要是以再生乳酸為原料進行人工合成而得到的，其降解產(chǎn)物為水和二氧化碳，具有良好的生物相容性。1997年美國藥品食品監(jiān)督管理局批準聚乳酸應用臨床，可用于骨組織工程支架的制備及作為藥物載體材料制備緩釋劑。目前靜電紡絲法被認為是制備聚乳酸支架最簡單有效的方法，制備出來的支架孔徑及孔隙率可接近松質(zhì)骨[19]。

應用單一材料制備出的三維支架具有明顯的局限性，將兩種及以上具有不同理化性質(zhì)及力學性能的材料以一定比例混合可制備出復合三維支架，具有良好的生物相容性以及適中的孔徑、孔隙率、降解速度、力學性能，更符合骨組織工程對支架的要求。佘榮峰等[20]將絲素蛋白和殼聚糖以1∶1的比例制備出復合支架，在體外細胞培養(yǎng)試驗中表現(xiàn)出良好的生物相容性。朱現(xiàn)瑋等[21]應用多孔型絲素蛋白/羥基磷灰石復合骨髓間充質(zhì)干細胞，在兔半月板無血運區(qū)的軟骨修復中取得了滿意效果。目前尚無公認的能作為種子細胞理想載體的三維支架，仍需深入研究。

3 細胞生長因子

骨的修復過程十分復雜，受多種激素、細胞生長因子共同調(diào)控，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGFs)、成纖維細胞生長因子(FGF)、低氧誘導因子1α(HIF-1α)和核心結(jié)合因子α1(Cbfα1)等。

3.1 BMP BMP是一種疏水酸性糖蛋白，主要由氨基酸、絲氨酸、天門氨酸及甘氨酸等組成，對羥基磷灰石有較大的親和性。目前為止已發(fā)現(xiàn)20余種BMP組成成員，除BMP-1屬于蝦紅素家族，為蛋白酶外，其余均屬于TGF-β超家族成員。骨的修復程度與BMP表達呈正相關(guān)，但機體中BMP含量少，提取很困難。目前已克隆出9種BMP，稱為重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白。其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)具有高效的成骨作用，是公認的最重要的成骨誘導因子[22]。動物模型研究顯示，BMP-2能明顯促進骨缺損的修復進程[23,24]。

3.2 TGF-β TGF-β是一種多肽，可調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化及凋亡等；同時也是一種免疫調(diào)節(jié)因子，對淋巴細胞的增殖、活動及巨噬細胞的激活均具有抑制作用。TGF包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中以TGF-β1在骨缺損修復中的作用最顯著。研究證實，TGF-β可以刺激骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖、分化，誘導促進成骨和軟骨細胞增殖，并刺激Ⅰ型膠原合成，誘導膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨[25]。

3.3 IGFs IGFs是一種由兩條肽鏈構(gòu)成的活性蛋白多肽，可分為IGF-1和IGF-2。IGFs能促進不同來源的軟骨細胞增殖分化，其中以IGF-1作用較強。在骨缺損修復的重建過程中，IGFs可通過刺激成骨細胞和成骨前體細胞的增殖分化而促進骨缺損的修復。鄧江等[26]采用IGF-1復合羥基磷灰石修復兔橈骨骨缺損，結(jié)果顯示其能誘導成骨分化而促進骨缺損的修復。

3.4 FGF FGF廣泛存在骨基質(zhì)中，是一種具有廣泛生物活性的多肽，可促進軟骨及成骨細胞的增殖、分化及膠原的合成。骨缺損患者的早期修復骨痂組織中FGF表達升高，隨著骨痂成熟為板層骨，其表達逐漸降低；FGF還能促進毛細血管的生成，為骨痂的生長及成熟提供營養(yǎng)支持。研究表明，F(xiàn)GF可以誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞增殖分化，并能明顯促進BMP-2的成骨誘導能力，與BMP-2有協(xié)同修復骨缺損的作用[27]。

3.5 HIF-1α和Cbfα1HIF是一種異二聚蛋白質(zhì)，由α 、β兩個亞基構(gòu)成。HIF-1α可直接調(diào)節(jié)骨細胞的功能，也可通過誘導血管生成因子的表達而促進骨折愈合過程。Cbfα1也稱RunX2，屬于Run基因家族中的一員，其被證實具有調(diào)控成骨細胞發(fā)育、分化和骨形成的功能，在成骨細胞動員、膜內(nèi)成骨、軟骨內(nèi)成骨和牙齒的形成過程中發(fā)揮重要作用。柏小金等[28]研究發(fā)現(xiàn)，股骨骨折合并腦損傷模型大鼠HIF-1α和Cbfα1表達明顯升高，可能是加速骨折愈合的機制之一。

綜上所述，雖然骨組織工程在種子細胞分離、支架制備及細胞生長因子提取等方面取得了較大發(fā)展，但仍有許多問題需進一步研究解決，比如需要建立標準化種子細胞，使研究結(jié)果更科學、更可靠；在材料方面，雖然復合支架更符合骨組織工程的要求，但是臨床上對復合支架方面的研究仍處于探索階段；生長因子方面，雖然目前結(jié)合多種細胞生長因子修復骨缺損逐漸成為骨組織工程的研究熱點，但是相關(guān)生長因子的選擇仍存在爭議。此外，關(guān)于骨組織工程修復骨缺損的效果多在動物實驗中得到證實，其臨床應用研究較少，尚需進一步證實。

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鄧江(E-mail： DJ3666@126.com)

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A

1002-266X(2016)48-0103-03

2016-06-01)