張文明，張媛媛，林燕萍（福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122）

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miRNA調節(jié)骨髓間充質干細胞成骨分化作用研究

The effects of imRNA in regulating osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

張文明，張媛媛，林燕萍
（福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122）

關鍵詞成骨分化；miRNA；BMSCs

miRNA是一類具有轉錄后調控功能作用的單鏈小RNA。從1993年在秀麗線蟲發(fā)育時期發(fā)現(xiàn)第一個miRNA后，miRNA的研究取得巨大突破，目前在多種生物體內發(fā)現(xiàn)數(shù)量龐大的miRNA，并且觀察到miRNA具有極其豐富的生物學功能，對生物體的發(fā)育代謝凋亡過程均具有調控作用。miRNA是一種非編碼的小RNA，長度約為19～25個核苷酸，具有高度保守性。大約占到整個人類基因組的1%，調控人類30%以上基因的表達。參與各種生物體細胞早期發(fā)育和生長、增殖、分化、分裂以及凋亡，并且參與重要基因的調控、體液調節(jié)、組織重建、內分泌調節(jié)，對疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸都具有重要影響［1-3］。其在多種生物體內具有高度保守性，在不同的生物體系均起著關鍵作用，促進快速應答與機體生理和結構的精確調控。它們基于與靶基因的3′非翻譯區(qū)序列互補，從而對靶基因進行降解或抑制，達到調控蛋白質表達的目的。

1 miRNA的作用機制

miRNA可通過兩種不同的機制來達到對靶基因的調控：mRNA剪切與翻譯抑制。近期多數(shù)研究均表明，miRNA抑制或沉默靶基因mRNA的方式，決定于其與靶基因3′非翻譯區(qū)序列互補的程度。當miRNA與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)序列完全互補時即可導致mRNA降解，當miRNA與靶基因3′非翻譯區(qū)序列不完全互補時可以導致mRNA抑制，說明miRNA與靶基因mRNA相互配對程度決定了其對靶基因調控的方式。由于多數(shù)miRNA與靶基因mRNA完全互補程度并不高，目前發(fā)現(xiàn)miRNA對靶mRNA的主要作用方式主要是抑制作用。同時miRNA也可上調靶基因的表達，從而對靶基因起到正性調控作用。研究表明大約40%～90%編碼蛋白的基因3′非翻譯區(qū)均存在miRNA靶作用點［4］，目前認為人類基因組中有1 048條miRNA［5］，而人類30%～40%的基因在翻譯水平受miRNA的調控［6］。單個miRNA可以有多個靶基因mRNA，單個基因也可以被多個miRNA調控［7］。

miRNA的靶mRNA主要是細胞生物學過程中的轉錄因子、調節(jié)因子、生長因子等，研究miRNA的功能主要通過研究其與靶基因的關系，其作用機制為miRNA 5′端的種子區(qū)與其靶基因3′UTR區(qū)結合，說明只要找到細胞中miRNA的靶mRNA，就可以研究細胞中該miRNA的作用，靶基因的確定至關重要。由于miRNA及其靶基因mRNA序列在物種間具有高度保守性，這為miRNA的預測奠定了基礎。目前研究miRNA-靶mRNA之間相互作用的方法包括：靶基因預測軟件預測、熒光素酶報告基因檢測、構建載體上調miRNA的表達和下調miRNA的表達檢測目標mRNA。其中利用表達譜分析和生物信息學方法預測靶基因為miRNA功能研究提供大量線索。利用生物信息學技術用計算機軟件預測靶mRNA后，還需通過蛋白基因組學實驗研究來驗證靶基因的可靠性。根據(jù)miRNA調控機制的不同，實驗研究驗證分為兩個方面：通過對降解產物的逆轉錄和克隆測序可以完成對靶基因mRNA降解作用的驗證。對于翻譯抑制機制，需要采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)，構建載體上調和下調miRNA對靶mRNA進行雙熒光驗證、蛋白組學分析。

2 miRNA調控BMSCs成骨分化

成骨細胞來源于骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）［8］，即決定骨形成的成骨細胞由BMSCs分化成熟而來，BMSCs的數(shù)量和成骨分化功能直接影響成骨細胞的數(shù)量和功能活性，因此BMSCs向成骨細胞分化對維持骨穩(wěn)態(tài)非常重要。那么miRNA在BMSCs向成骨細胞分化中有何作用呢？2008年，Kobayashis發(fā)現(xiàn)在敲除了小鼠的內切核酸酶Dicer后，小鼠BMSCs成骨分化功能消失［9］。小鼠軟骨細胞數(shù)量明顯減少，軟骨生成減少，密度下降。Dicer是miRNA合成所必需的一個內切酶，說明miRNA在骨形成和發(fā)育中有重要作用［10］。BMSCs的增殖活性與成骨分化過程均與miRNA密切相關。BMSCs成骨分化過程涉及多條信號通路，如BMP信號通路、Wnt信號通路、TGF-β通路、Notch信號通路等［11］。一般來說miRNA對基因進行負性調控，因此miRNA對成骨分化的作用可以是作用于促進成骨的基因而抑制成骨，也可以是作用于抑制成骨作用的基因，從而間接地對成骨進行正性調控［12］。

2.1促進成骨分化的miRNA

Li Z等［13］發(fā)現(xiàn)在MC3T3細胞成骨分化過程中，miR-29b可以通過作用于抑制成骨的靶基因HDAC4、TGF-β3、ACVR2A，通過降解作用，阻止其表達，從而促進成骨。此外還有研究發(fā)現(xiàn)miR-29a通過抑制DKK1來激活WNT通路，通過與WNT通路形成循環(huán)來促進成骨分化［14］。同樣，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-27可以抑制靶基因APC，從而反激活WNT促進成骨分化［15］。Liu Y等［16］認為miR-17可能通過抑制牙周膜間充質干細胞成骨分化的負性調控因子Smurf1，從而促進牙周膜間充質干細胞的成骨分化。He J等［17］發(fā)現(xiàn)miR-20b通過與其靶基因PPARγ結合，降低PPARγ的表達，從而提高了成骨核心轉錄因子Runx2轉錄，促進成骨分化。該研究認為PPARγ通過促進成酯分化，抑制成骨分化的轉錄因子。Zhou Q等［18］用伊班磷酸鈉干預牙周膜間充質干細胞后發(fā)現(xiàn)，miR-18及相關成骨轉錄因子表達上升，表明miR-18可能在伊班磷酸鈉促進牙周膜間充質干細胞成骨分化過程中起到正性調控作用。miR-210在ST2成骨分化過程中可能通過沉默抑制成骨分化的重要基因AcvR1b來促進成骨，過表達miR-210后堿性磷酸酶、成骨核心結合因子Runx2的表達上升［19］。

2.2抑制成骨分化的miRNA

Wei J等［20］發(fā)現(xiàn)，miR-34b和miR-34c作為miR-34家族的2個成員通過兩條途徑來實現(xiàn)抑制成骨的作用，一方面CDK4、CDK6和CyclinD1蛋白積累等被miR-34b和miR-34c所阻礙，從而抑制了成骨細胞的數(shù)量；另一方面SATB2蛋白的表達降低從而抑制成骨細胞的分化。Li Z等［21］發(fā)現(xiàn)在BMP2誘導的C2C12細胞成骨分化中，對其中顯著下調的miR-133和miR-135進行研究后發(fā)現(xiàn)，miR-133的靶基因為Runx2，而miR-135的靶基因為Smad5，兩者共同作用來抑制骨的形成。那么在臨床上可以通過降低miR-133和miR-135的表達來促進成骨作用，最終達到改善骨重建的作用。Wang X等［22］研究發(fā)現(xiàn)老年骨折患者的骨組織中高表達miR-214，miR-214是通過作用于活化轉錄因子4ATF4來降低成骨作用的。在動物實驗中miR-214也被證實具有抑制成骨細胞活性的作用。Eskildscn T等［23］發(fā)現(xiàn)miR-138可以直接作用于成簇黏附激酶FAK，抑制FAK-ERK1/2信號通路，從而降低下游成骨核心結合因子Runx2和OSX的表達來降低成骨作用。同樣，在人骨髓間充質干細胞中過表達miR-138后骨形成下降，低表達miR-138后成骨作用增加。Zeng Y等［24］發(fā)現(xiàn)miR-100抑制干細胞成骨分化，該作用通過降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體BMP-2來實現(xiàn)。Gao J［25］分離培養(yǎng)人的BMSCs后在成骨分化過程中篩選分化前后miRNA差異最大的hsa-miR-31、hsa-miR-106a、hsa-miR-148a，并且發(fā)現(xiàn)這些miRNA可能通過成骨核心結合因子Runx2、CBFB和BMPs起作用。Schaap-Oziemlak A M等［26］發(fā)現(xiàn)hsa-miR-135b可能作用于IBPS和Osterix，在無限成體干細胞（USSCs）中顯著下調。同樣miR-637在間充質干細胞向成骨細胞分化中表達也降低，可能也是通過靶基因Osterix起作用的。

3展　望

研究證實miRNA幾乎參與了生物學行為中所有的基因調控通路，具有極強的調控作用。miRNA對干細胞自我更新和分化調控機制是必須要明確的，也是目前科學家正在努力研究的熱點課題。生物，包括人類，在對環(huán)境適應及進化過程中伴隨著頻繁而持續(xù)的基因—基因和基因—環(huán)境相互作用，miRNA的高度保守性決定了其非常適合研究基因—基因和基因—環(huán)境相互作用。針對某種特殊疾病的病理，可能對某些特定表型具有陽性或陰性效應的miRNA基因，用生理及遺傳病理模型評估陽性miRNA與蛋白編碼基因潛在作用靶點的關系，從而用于疾病的診斷與治療，可能將成為未來基因與疾病研究的熱點，miRNA基因效應的分子生理學認識可能會帶來直達作用靶點的治療。

在一些增齡性疾病如絕經后骨質疏松癥（PMOP）的研究中，經過生物信息學預測及基因芯片的篩選，發(fā)現(xiàn)某些特定的miRNA可能控制著BMSCs向成骨細胞分化，這些miRNA通過降低或提高成骨關鍵轉錄因子來抑制或促進BMSCs的成骨分化過程。越來越多的證據(jù)顯示，某些miRNA調控作用具有高度保守性，在進化過程中以及不同物種間還保持完整的作用?？梢酝ㄟ^檢測絕經前后患者骨組織或血液、體液中的特異基因miRNA，由此來進行PMOP的診斷。而進一步發(fā)展和調整miRNA干擾載體，使它能在BMSCs成骨分化中起到促進成骨作用，從而預防和治療PMOP，這將是一種全新的PMOP診治模式。但成骨過程中有多少特異性miRNA參與對BMSCs生物學行為調控?這些特異性miRNA又如何調控促進代謝性骨病的發(fā)生？能否通過降低或提高特異性miRNA改變BMSCs的生物學特性？有待于我們進一步研究。

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（編輯：梁葆朱）

中圖分類號：Q522

文獻標識碼：A

文章編號：1671-0258（2016）02-0060-03

［基金項目］國家自然科學基金項目（81173282）

［作者簡介］張文明，在讀博士，E-mail：393390125@qq.com

［通訊作者］林燕萍，教授，博士研究生導師，E-mail：lyp66@126.com