陳紅軍（河南省濮陽市油田總醫(yī)院藥劑科，河南 濮陽 457000）

神州藥房

野生刺五加內(nèi)生真菌分離與鑒定

陳紅軍
（河南省濮陽市油田總醫(yī)院藥劑科，河南 濮陽 457000）

刺五加為中醫(yī)臨床常用中藥，含有多種有效成分，藥用價(jià)值極高?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外對(duì)刺五加的研究不斷深入，但是多以外在環(huán)境對(duì)植物體藥用成分的影響為主，忽略了內(nèi)環(huán)境的影響。研究與實(shí)踐證實(shí)［1］，體外培養(yǎng)刺五加的藥用成分與效果遠(yuǎn)低于野生刺五加，并且成分相對(duì)不穩(wěn)定。內(nèi)生真菌會(huì)利用自身活動(dòng)、代謝產(chǎn)物，對(duì)宿

主次級(jí)代謝產(chǎn)生一定程度的影響［2］。我們對(duì)野生刺五加內(nèi)生真菌分離與鑒定進(jìn)行分析探討，報(bào)道如下。

1 研究材料

刺五加樣品來源于2014年6月至12月吉林省梅河口市、遼寧省本溪市、吉林省柳河縣、黑龍江省穆棱市、河北省興隆縣等幾個(gè)地區(qū)的野生刺五加藥材。培養(yǎng)基選擇PDA培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、LCA培養(yǎng)基等。

2 研究方法

采取刺五加莖組織分離方法，對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、鑒定。

內(nèi)生真菌分離。采取流水沖洗刺五加，將植株上的土去掉，按照根、莖、根莖等次序進(jìn)行分割，并進(jìn)行表面的徹底消毒，消毒順序?yàn)槭紫冉?jīng)無菌水沖洗，而后采用95%乙醇漂洗1min，經(jīng)6%NaClO浸洗3min，經(jīng)75%的乙醇漂洗半分鐘，再次用無菌水漂洗3次，最后經(jīng)無菌濾紙吸干。一系列處理后，將韌皮部、木質(zhì)部進(jìn)行無菌分離，將韌皮部切成0.5cm×0.5cm的薄片，而后將薄片經(jīng)直插、水平貼附方式放置在分離平板上，25℃～28℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，材料邊緣長(zhǎng)出菌絲后挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)入平板，展開分離，頂端法純化后轉(zhuǎn)接至斜面。同時(shí)設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)植株表面是否徹底消毒進(jìn)行檢查，經(jīng)上述條件處理過的材料，不進(jìn)行切割，直接滾印在對(duì)照平板上，最后一次漂洗過的無菌水涂布在對(duì)照平板上，同樣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

菌株形態(tài)學(xué)鑒定。對(duì)菌落表面形態(tài)、顏色、大小、質(zhì)地、生長(zhǎng)速度、邊緣形態(tài)等進(jìn)行仔細(xì)觀察，經(jīng)插片法在顯微鏡下對(duì)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)、菌絲顏色、是否存在橫隔等特征進(jìn)行觀察。

內(nèi)生真菌鑒定。挑取純化菌株尖端菌絲，將其接種在PDA培養(yǎng)基上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，25℃條件下培養(yǎng)，對(duì)菌落形態(tài)特征、生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，而后進(jìn)行內(nèi)生真菌的鑒定、分類。

3 結(jié) 果

3.1 內(nèi)生真菌培養(yǎng)分離結(jié)果

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，自野生刺五加莖中共計(jì)分離內(nèi)生真菌25株，共4目、7科、9屬。叢梗孢目中包括叢梗孢科、暗色孢科、瘤座孢科、肉座菌科，叢梗孢科包括曲霉屬1株，暗色孢科包括有長(zhǎng)蠕孢屬1株、枝頂孢酶屬1株，鏈格孢屬3株，瘤座孢科中包括鐮孢屬2株，肉座菌科包括赤霉素屬1株；散子囊菌目包括紅曲霉科紅曲霉屬2株；毛霉目包括毛霉科根霉屬1株，黑盤孢目包括黑盤孢科炭疽菌屬1株；不產(chǎn)孢真菌共計(jì)12株。

3.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

鏈格孢屬：菌株在PDA培養(yǎng)基上，25℃條件下暗培養(yǎng)完成后，菌落形態(tài)較厚，菌絲體開始時(shí)呈現(xiàn)白色，而后逐漸變成褐色至暗褐色，存在明顯的絨邊，邊緣相對(duì)整齊，存在裂片狀或者波狀。菌絲體細(xì)長(zhǎng)、發(fā)達(dá)，有明顯的隔，開始時(shí)沒有顏色或者是淡淡的顏色，而后逐漸變成褐色至暗褐色。分生孢子梗單生或簇生，呈現(xiàn)出直或者是屈膝狀彎曲，有隔，顏色褐色。分生孢子具有明顯的分支狀長(zhǎng)鏈，顏色暗褐色。

鐮孢屬：菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)鑒別發(fā)現(xiàn)，初期菌絲呈現(xiàn)為白色，隨著菌落的不斷擴(kuò)大，顏色逐漸變?yōu)榉凵?，中間相對(duì)較深，邊緣顏色較淺，培養(yǎng)基背面中間呈現(xiàn)粉紅色；菌落分散呈現(xiàn)片狀，表面粉狀，不平整，邊緣整齊。菌絲存在明顯的分枝，有隔，分生孢子著生在菌絲之上。

長(zhǎng)蠕孢屬：菌落形狀為圓形，表面開始呈現(xiàn)為灰色，生長(zhǎng)一段時(shí)間后，中間顏色呈現(xiàn)為墨綠色，底部中間同樣呈現(xiàn)為墨綠色，兩邊顏色相對(duì)較淺。顯微鏡觀察菌絲較粗壯，顏色為綠色，有隔，直立或者是彎曲，存在明顯分枝，孢子卵圓形或者是橢圓形。

赤霉屬：菌落生長(zhǎng)狀態(tài)良好，平板培養(yǎng)完成后，菌落中央菌絲體的頂部長(zhǎng)出了少量的，顏色為淺黃色的突起，后期菌落中央的顏色會(huì)逐漸變深。菌落背面呈現(xiàn)為深紫紅色，菌落密集，呈現(xiàn)為棉絮狀平展?fàn)顟B(tài)。顯微鏡觀察基內(nèi)菌絲存在密集交織，有分支，存在隔。

紅曲霉屬：菌落正面呈現(xiàn)出白色絨毛狀，背面呈現(xiàn)為粉紅色，邊緣相對(duì)整齊。顯微鏡觀察菌絲存在明顯分枝，有隔，呈無色透明狀，分生孢子呈現(xiàn)為卵圓形或者是球形，散在生存。

枝頂孢酶屬：菌株生長(zhǎng)正常，菌落呈現(xiàn)為明顯的圓形，正面呈現(xiàn)為灰白色絨毛，顯微鏡觀察分生孢子梗單生，1次分枝，梗呈現(xiàn)為柱狀，分生孢子橢圓形或者是球形。

根霉屬：生長(zhǎng)狀況良好，表面存在大量的黃色孢子，氣生菌絲呈現(xiàn)為白色，稀疏，菌落的底面呈現(xiàn)為橙黃色，顯微鏡觀察孢子囊存在明顯的囊軸，壁薄，孢子囊破裂后釋放，數(shù)量較多。

4 討 論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)內(nèi)生真菌的研究較多，多以內(nèi)生真菌多樣性、抗腫瘤、產(chǎn)抗菌等活性物質(zhì)篩查為主，篩選的模型相對(duì)比較單一，使得有效物質(zhì)的開發(fā)利用受到一定程度的限制［3］。關(guān)于內(nèi)生真菌與宿主之間相互作用、作用機(jī)制等方面的研究，多以內(nèi)生真菌對(duì)宿主直接或者是間接的促生作用為主［4-5］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共計(jì)從野生刺五加植物中分離25株內(nèi)生真菌，通過形態(tài)學(xué)鑒定，有13株確定菌株種屬，另外的12株不產(chǎn)孢菌株被定義為不產(chǎn)孢真菌，分離結(jié)果證實(shí)，刺五加內(nèi)生真菌種類繁多，數(shù)量較大。

綜上所述，刺五加內(nèi)生真菌具有生物多樣性，其中鏈格孢屬、鐮孢屬、紅曲霉屬等均有較高的分離度，屬于穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)菌屬［6］。在其他木本植物中，上述菌屬也為優(yōu)勢(shì)菌種，其能夠適應(yīng)植物生長(zhǎng)環(huán)境，微生物營(yíng)養(yǎng)要求、生理代謝等均與植物體內(nèi)微環(huán)境、遺傳、生理、代謝相互適應(yīng)，在今后的研究中，應(yīng)對(duì)其給予足夠的重視［7］。

［1］ 陸曉東，王琦.駱駝蓬內(nèi)生真菌抑菌活性的研究［J］.菌物研究，2010，12（2）：211-214.

［2］ 于湘莉，趙靜雅，張利達(dá)，等.楸樹內(nèi)生真菌抗癌性能研究［J］.上海醫(yī)藥，2012，23（13）：784-785.

［3］ 解斐，婁紅祥.地衣內(nèi)生真菌及其活性次生代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展［J］.中藥材，2013，11（4）：109-112.

［4］ 劉兆迪，解修超，陳文強(qiáng)，等.藥用植物三尖杉內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗菌活性［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，25（9）：902-905.

［5］ 周鳳，劉瑞，張弘弛，等.一株具抗菌活性的恒山黃芪內(nèi)生真菌的分離與鑒定［J］.陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，15（3）：90-93.

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［7］ 嚴(yán)寒靜，高曉霞，何夢(mèng)玲，等.鷹爪花莖和葉中內(nèi)生真菌的組織化學(xué)定位與分子鑒定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，11（13）：572-575.

R282.5 ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］B

1004-2814（2016）07-0740-02

2016-02-29