陳青 盧麗萍

(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原030006)

多苯并咪唑鋅配合物抑制蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)的活性

陳青 盧麗萍＊

(山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原030006)

本文報(bào)道了5種多苯并咪唑鋅配合物，即[Zn(TDB)2]Cl2(1)、[Zn(NTB)Cl]Cl(2)、[Zn(EDTB)]Cl2(3)、[Zn2(EGTB)Cl2]Cl2(4)和[Zn2(DTPB)Cl3]Cl(5)，其中TDB=1，2-二(2-苯并咪唑)-1，2-二羥基乙烷、NTB=N，N，N-三(2-甲基苯并咪唑)胺、EDTB=N，N，N′，N′-四(2-苯并咪唑亞甲基)-1，2-乙二胺、EGTB=N，N，N′，N′-四(2-苯并咪唑甲基)-1，4-二乙胺基乙二醚以及DTPB=N，N，N′，N″，N″-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙三胺，對(duì)5種蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B、TCPTP、PTP-MEG2、SHP-1和SHP-2)的抑制作用，結(jié)果顯示這些配合物強(qiáng)烈抑制PTP1B的活性，其IC50值在0.15～0.28 μmol·L-1范圍內(nèi)，但對(duì)PTP-MEG2和SHP-1抑制較弱，幾乎不抑制SHP-2，而配合物1、3、5對(duì)與PTP1B高度同源的TCPTP的抑制明顯強(qiáng)于2和4，因而2和4對(duì)PTP1B表現(xiàn)較強(qiáng)的選擇性，對(duì)PTP1B抑制活性是TCPTP的7～12倍、PTP-MEG2的10～15倍、SHP-1的20～40倍，大約是SHP-2的1 000倍，表明配合物的結(jié)構(gòu)影響其對(duì)PTP1B的選擇性。酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示2和4對(duì)高度同源的PTP1B和TCPTP抑制類型不同，對(duì)PTP1B的抑制為競(jìng)爭(zhēng)型，而對(duì)TCPTP的抑制為非競(jìng)爭(zhēng)型，推測(cè)其選擇性可能與其抑制方式有關(guān)。熒光滴定表明2和4與PTP1B和TCPTP發(fā)生了1∶1結(jié)合作用。結(jié)合常數(shù)分別為1.12×106、5.47×105、1.19×106和4.95×105L·mol-1，表明它們與PTP1B的結(jié)合能力強(qiáng)于TCPTP，與它們對(duì)這兩種酶的抑制能力一致。

鋅配合物；蛋白酪氨酸磷酸酶；抑制；選擇性

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的不含金屬的酶，與蛋白酪氨酸激酶(PTKs)共同調(diào)控細(xì)胞內(nèi)酪氨酸的磷酸化水平，在生物體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明酪氨酸磷酸化水平的異常與糖尿病、肥胖、癌癥和免疫性缺陷等多種人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1-5]，其中有些PTPs，如PTP1B通過使胰島素受體去磷酸化，負(fù)向調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，已經(jīng)成為當(dāng)前公認(rèn)的抗糖尿病藥物研究的作用靶點(diǎn)，尋找和開發(fā)針對(duì)PTP1B的高效特異性抑制劑成為近年來該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[2]。

鋅是生物體內(nèi)僅次于鐵、含量第二豐富的微量金屬元素，具有胰島素樣活性，其作為潛在的抗糖尿病藥物引起了生物無(wú)機(jī)化學(xué)研究者的廣泛興趣[6-7]。最近的研究顯示鋅離子具有抑制PTP1B、TCPTP、SHP-1和SHP-2的作用[8-9]，但至今未見鋅配合物抑制PTPs活性的研究報(bào)道。我們對(duì)釩、銅配合物抑制PTPs的研究結(jié)果表明，配合物的結(jié)構(gòu)能影響其對(duì)PTPs的抑制效果和選擇性[10-27]。鋅配合物能否選擇性抑制PTPs，進(jìn)而探索鋅配合物抗糖尿病藥物?為此，本文報(bào)道了5種不同結(jié)構(gòu)的多苯并咪唑鋅配合物對(duì)5種PTPs的抑制作用，發(fā)現(xiàn)2種配合物對(duì)PTP1B表現(xiàn)較好的選擇性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(p-NPP)購(gòu)自上海西寶生物有限公司;MOPS[3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]購(gòu)自北京華美生物有限公司；所用其它試劑均為國(guó)內(nèi)市售分析純，購(gòu)回直接使用。紅外測(cè)定使用Shimadiu-FTIR-8300型傅立葉變換紅外儀(KBr壓片)，4 000～400 cm-1范圍測(cè)譜；元素分析使用Vario Micro型微量元素分析儀；電噴霧質(zhì)譜分析使用Quattro Micro API型電噴霧質(zhì)譜儀；紫外光譜用Hewlett-Packard 8453 UV-Vis型吸收光譜儀記錄；酶活性測(cè)試使用BIO-RAD550 USA型酶標(biāo)儀，pH測(cè)試使用PHS-3TC型pH計(jì)(裝配有復(fù)合玻璃電極)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

PTP1B、TCPTP、PTP-MEG2、SHP-1和SHP-2的表達(dá)與純化按文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。5種酶的重組表達(dá)質(zhì)粒菌株由吉林大學(xué)生命科學(xué)院Edmond H.Fischer信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室付學(xué)奇教授提供。具體表達(dá)和純化步驟大同小異，以PTP1B為例說明如下：挑取單個(gè)克隆菌接種于5 mL Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中(含100 μmol·L-1Amp，34 μmol·L-1Cam,下同)，置于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。擴(kuò)大培養(yǎng)于1 000 mL LB液體培養(yǎng)基中至OD550=0.6，加入IPTG(Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)，使其終濃度為100 μmol·L-1，在37℃培養(yǎng)6 h后離心收集菌體。取10 g菌體用PBS洗滌，加100 mL提取緩沖液[25 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-12-mercaptoethanol(2-ME)，0.002%phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF)]，超聲波破碎，13 000 r·min-1離心45 min，收集上清液。將其上樣于用Buffer Q(25 mmol· L-1Tris-HCl，pH 7.5，2 mmol·L-12-ME，1 mmol·L-1EDTA)平衡過的FFQ柱，用含0.1 mmol·L-1NaCl的Buffer Q洗滌，除去雜蛋白，然后用含0.2 mol·L-1NaCl的Buffer Q洗脫，得到活性組分。再用Buffer Q平衡S-100層析柱，將洗脫得到的活性組分除鹽、濃縮后，經(jīng)S-100柱，收集活性峰部分，濃縮，用MOPS buffer(20 mmol·L-1MOPS，500 mmol·L-1NaCl，pH 7.2)透析，Bradford法以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白濃度。

1.3 鋅配合物的合成與表征

5種配體1，2-二(2-苯并咪唑)-1，2-二羥基乙烷(TDB)，N，N，N-三(2-甲基苯并咪唑)胺(NTB)，N，N，N′，N′-四(2-苯并咪唑亞甲基)-1，2-乙二胺(EDTB)，N，N，N′，N′-四(2-苯并咪唑甲基)-1，4-二乙胺基乙二醚(EGTB)以及N，N，N′，N″，N″-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙三胺(DTPB)的合成和表征見文獻(xiàn)[23]。鋅配合物1～5的合成參考相應(yīng)的銅配合物的合成方法[23]。具體步驟如下：按適量的物質(zhì)的量配比將氯化鋅溶液逐滴加入到熱的TDB、NTB、EDTB、EGTB和DTPB甲醇溶液中，攪拌數(shù)小時(shí)得到白色沉淀，靜置、抽濾、洗滌、干燥后得到相應(yīng)的鋅配合物粉末，表征如下：

1.3.1 [Zn(TDB)2]Cl2(1)

配合物1,產(chǎn)率:45%。元素分析(C32H28Cl2N8O4Zn，1，%)：理論值C 53.02，H 3.89，N 15.46；實(shí)驗(yàn)值C 53.29，H 3.87，N 15.38。IR(KBr，cm-1)：3 420s(O-H，NH)，1 627m(C=N)，1 542w，1 456s(苯環(huán)C=C)，1 323 w,1 275m(C-N),1 107s(O-H)，734m，618m，569m。ESIMS(VCH3OH/VH2O=9∶1，正離子模式，下同)：峰295.50 (100%)為[TDB+H]+(295.12)，峰651.42(24%)為[1-2Cl-H]+(651.14)，峰326.50(23%)為[1-2Cl]2+(326.08)。

1.3.2 [Zn(NTB)Cl]Cl(2)

配合物2，產(chǎn)率：54%。元素分析(C24H21Cl2N7Zn· H2O，2·H2O，%)：理論值C 51.31，H 4.13，N 17.45；實(shí)驗(yàn)值C 51.43，H 4.30，N 17.26。IR(KBr，cm-1)：3 560 br(N-H，C-H)，1 611s(C=N)，1 541w，1 448s(苯環(huán)C= C)，1 385w，1 348w，1 278m(C-N)，1 138s(C-H)，757s，626 w，563m。ESI-MS：峰508.58(100%)為[2-Cl]+(508.31)。

1.3.3 [Zn(EDTB)]Cl2(3)

配合物3，產(chǎn)率：46%。元素分析(C34H32Cl2N10Zn· H2O，3·H2O，%)：理論值C 55.56，H 4.66，N 19.06；實(shí)驗(yàn)值C 55.34，H 4.53，N 18.82。IR(KBr，cm-1)：3 560～3 273s(N-H)，1 619m(C=N)，1 541w，1 456s(苯環(huán)C= C)，1 385w，1 323w，1 278w(C-N)，1 122s(C-H)，726m，626w，571m。ESI-MS：峰322.50(100)%為[3-2Cl]2+(322.10)，峰679.17(10%)為[3-Cl]+(679.18)，峰643.25 (6%)為[3-2Cl-H]+(642.20)。

1.3.4 [Zn2(EGTB)Cl2]Cl2(4)

配合物4,產(chǎn)率:54%。元素分析(C38H40O2N10Cl4Zn2，4，%)：理論值C 48.48，H 4.28，N 14.88；實(shí)驗(yàn)值C 48.21,H4.41，N14.55。IR(KBr，cm-1)：3490br,s,1627m (C=N),1 541w,1 456s(苯環(huán)C=C),1 386w,1 339w,1 270 m,1 115s,750s,626w，567m。ESI-MS：峰869.17(100%)為[4-2Cl-H]+(869.45)，峰435.33(36%)為[4-2Cl]2+(435.23)，峰417.33(22%)為[4-3Cl-H]2+(417.01)。

1.3.5 [Zn2(DTPB)Cl3]Cl(5)

配合物5，產(chǎn)率：42%，元素分析(C44H43N13Cl4Zn2·H2O，5·H2O，%)：理論值C 50.60，H 4.34，N 17.43；實(shí)驗(yàn)值C 50.49，H 4.46，N 17.38。IR(KBr，cm-1)：3 531 (N-H)，3 055br，1 623m(C=N)，1 602w，1 455m(苯環(huán)C =C)，1 387w，1 272w(C-N)，1 121s(C-H)，853w，746m，617m，567m。ESI-MS：峰460.00(100%)為[5-3Cl-H]2+(459.55)，峰949.83(27%)為[5-2Cl-H]+(950.16)，峰918.33(14%)為[5-3Cl-2H]+(918.10)。

1.4 電位滴定分析

為了確定配合物在水溶液中的物種，以配合物2為代表進(jìn)行了pH電位滴定分析。由于NTB及它的鋅配合物在水溶液中的溶解性不好，pH電位滴定分析在25%甲醇的水溶液中氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行，pH測(cè)量使用PHS-3TC型pH計(jì)帶復(fù)合玻璃電極。滴定條件為：室溫，離子強(qiáng)度為0.2 mol·L-1NaCl，初始體積40 mL 25%甲醇的水溶液，NTB的濃度為0.025 mmol·L-1，ZnCl2濃度為0.025 mmol·L-1，HCl濃度為0.175 mmol·L-1，用除二氧化碳的0.009 08 mol·L-1氫氧化鈉滴定。平行滴定3次，記錄滴定結(jié)果。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SUPERQUAD2000軟件擬合[28]，分別得到配體的質(zhì)子離解常數(shù)pKa及鋅配合物的逐級(jí)穩(wěn)定常數(shù)。

1.5 鋅配合物對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制作用

酶活性抑制實(shí)驗(yàn)基于底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(p-NPP)被磷酸酶水解的產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚(p-NP)在405 nm處有強(qiáng)吸收峰[11,18]，其摩爾吸光系數(shù)為1.78×104L·mol-1·cm-1。配合物對(duì)PTP1B、TCPTP、PTP-MEG2、SHP-1和SHP-2的抑制作用在pH 7.20緩沖液(20 mmol·L-1MOPS，50 mmol·L-1NaCl)體系中進(jìn)行;即將不同濃度的配合物10 μL加入82 μL的酶溶液中，37℃反應(yīng)30 min，加入2 μL 100 mmol·L-1p-NPP啟動(dòng)酶反應(yīng)，20 min后用6 μL 2 mol·L-1NaOH終止反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)體系對(duì)p-NPP水解產(chǎn)生p-NP在405 nm處的光吸收變化計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值，半數(shù)抑制濃度IC50的計(jì)算見文獻(xiàn)[10,24]。

酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究配合物對(duì)PTPs的抑制類型和抑制常數(shù)。固定酶濃度，分別選取不同濃度的抑制劑和底物，測(cè)定不同抑制劑濃度下，隨著底物濃度的增加初始反應(yīng)速率的變化值，根據(jù)Lineveaver-Bruk方程分析配合物的抑制類型，并計(jì)算抑制常數(shù)Ki值[20,23]。

熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)在pH 7.20的MOPS緩沖溶液中進(jìn)行。取2 mL一定濃度的PTP1B或TCPTP溶液加入到1 cm的石英比色皿中，控制溫度為37℃。設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，掃描PTP1B或TCPTP的發(fā)射峰。待酶溶液的熒光強(qiáng)度穩(wěn)定后，用一定濃度的配合物滴定酶溶液。每次滴加4 μL，吸打均勻，靜置5 min掃描。依次進(jìn)行，直到熒光強(qiáng)度不再發(fā)生變化。根據(jù)熒光猝滅方程計(jì)算配合物與PTP1B或TCPTP的相互作用位點(diǎn)和結(jié)合常數(shù)[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的合成與表征

本文所用配合物按文獻(xiàn)類似方法合成。紅外光譜顯示配體TDB、NTB、EDTB、EGTB和DTPB的C= N鍵伸縮振動(dòng)位于1 642～1 619 cm-1，而在配合物中吸收峰為1 627～1 604 cm-1，發(fā)生了一定的位移，說明苯并咪唑上的N與鋅離子發(fā)生了配位作用。位于563～571 cm-1的吸收峰可歸屬于Zn-N的伸縮振動(dòng)。盡管多種方法嘗試了5個(gè)配合物的結(jié)晶試驗(yàn)，但均未獲得適合X射線衍射的單晶樣品。根據(jù)元素分析得到它們的組成分別是[Zn(TDB)2]Cl2(1)、[Zn(NTB)Cl]Cl(2)、[Zn(EDTB)]Cl2(3)、[Zn2(EGTB)Cl2] Cl2(4)、[Zn2(DTPB)Cl3]Cl(5)。結(jié)合類似鋅或銅與同類配體的晶體結(jié)構(gòu)文獻(xiàn)[28-33]，推測(cè)鋅的可能配位環(huán)境見圖1，鋅離子處于五或六配位環(huán)境中。

2.2 Zn/NTB體系溶液中的物種分布

5種鋅配合物對(duì)PTPs的抑制作用主要在pH= 7.20條件下進(jìn)行。由于配合物的水溶性較差，通過電噴霧質(zhì)譜儀的正離子方式進(jìn)行配合物樣品檢測(cè)，歸屬見合成部分。在甲醇和水(9:1，V/V)的溶液中，配合物分子離子峰的實(shí)驗(yàn)值與計(jì)算值一致，證明鋅配合物也存在于溶液中。

為進(jìn)一步研究配合物在溶液中的形式，本文以Zn/NTB體系為代表進(jìn)行了pH值電位滴定分析。研究其在不同pH值下的物種分布，實(shí)驗(yàn)獲得的pH值電位滴定數(shù)據(jù)用SUPERQUAD 2000[28]軟件擬合。25%甲醇水溶液中的離子常數(shù)按文獻(xiàn)校正值pKM/W=-lg(cH+·cA-)=14.10[34]，此處A-代表OH-和

CH3O-。配合物的累積結(jié)合常數(shù)定義為：

圖1 配合物1～5中Zn的可能配位環(huán)境Fig.1Coordinated environments of complexes 1～5

圖2 (左)Zn/NTB配合體系的滴定曲線;(右)Zn/NTB配合體系的物種分布曲線,NTB濃度為0.025 mmol·L-1Fig.2(Left)Titration and fitted curves of Zn/NTB system;(Right)species distribution as a function of pH value for the Zn/NTB system

表1 NTB的質(zhì)子化常數(shù)和Zn/NTB配合體系的穩(wěn)定常數(shù)Table 1Stoichiometry,notation,pKaof the ligand NTB and lgβ of Zn/NTB species

其中p，q，r分別代表Zn2+、NTB、H+的化學(xué)計(jì)量數(shù)。擬合結(jié)果見圖2和表1，實(shí)驗(yàn)曲線與擬合曲線能很好的吻合(見圖2左圖)。物種分布曲線(見圖2右圖)給出在pH=7.2溶液下，Zn/NTB體系的物種主要以

2.3 配合物對(duì)PTPs的抑制作用及選擇性

5種多苯并咪唑鋅配合物對(duì)PTP1B、TCPTP、PTP-MEG2、SHP-1和SHP-2的抑制作用的評(píng)估結(jié)果見表2和圖3。這些結(jié)果表明鋅配合物對(duì)5種PTPs的抑制作用不同。5種鋅配合物對(duì)PTP1B都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，其IC50值在0.15～0.28 μmol· L-1范圍內(nèi)。但對(duì)PTP-MEG2、SHP-1和SHP-2抑制作用較弱，特別是對(duì)SHP-2幾乎不產(chǎn)生抑制作用。值得注意的是配合物1、3、5對(duì)與PTP1B高度同源的TCPTP的抑制效果明顯強(qiáng)于2和4。鋅配合物2和4對(duì)PTP1B的抑制表現(xiàn)出較強(qiáng)的選擇性，其對(duì)PTP1B抑制活性是TCPTP的7～12倍、PTP-MEG2的10～15倍、SHP-1的20～40倍，大約是SHP-2的1 000倍。可見，配合物的結(jié)構(gòu)差異不僅影響它們對(duì)不同PTPs的抑制活性也對(duì)不同PTPs的抑制具有選擇性。但是單核(1和2)與雙核配合物(3～5)對(duì)五種PTPs的抑制沒有表現(xiàn)出明顯的區(qū)別。其結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究探討。金屬離子不同也存在差異，與相應(yīng)配體的銅配合物比較，鋅配合物對(duì)PTP1B的選擇性明顯較強(qiáng)[23]，或許是鋅配合物具有胰島素樣活性[6-7]的原因之一。

圖3 配合物1～5對(duì)PTP1B、TCPTP、PTP-MEG2和SHP-1的抑制作用Fig.3Inhibition of zinc(Ⅱ)complexes 1～5 against PTP1B,TCPTP,PTP-MEG2 and SHP-1

表2 鋅配合物對(duì)PTPs的抑制作用Table 2PTPs inhibition of zinc(Ⅱ)complexes(IC50(S.D.))

2.4 配合物2和4對(duì)PTP1B和TCPTP抑制類型研究

圖4 配合物2、4對(duì)PTP1B和TCPTP的抑制類型圖(5個(gè)抑制劑濃度下1/v對(duì)1/cpNPP的Lineweaver-Burk作圖)Fig.4Inhibition modes of the complexes 2 and 4 on PTP1B&TCPTP,Lineweaver-Burk plot of 1/v versus 1/cpNPPat five fixed concentrations of complexes:

生物學(xué)上PTP1B與TCPTP高度同源，但配合物2和4對(duì)它們表現(xiàn)出一定的抑制差異。為了探討這種差異的來源，本文通過酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究了配合物2和4對(duì)PTP1B和TCPTP的抑制類型和抑制常數(shù)，結(jié)果如圖4。不難看出，配合物2和4對(duì)PTP1B抑制的L-B(Lineweaver-Burk)方程交于y軸上，屬于典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。說明配合物2和4與PTP1B的結(jié)合在酶的活性部位，求得抑制常數(shù)Ki值分別為0.15、0.32 μmol·L-1。而對(duì)TCPTP抑制的L-B方程交于x負(fù)軸上，屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。提示配合物2和4與TCPTP的結(jié)合發(fā)生在非活性中心部位，導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而抑制酶的活性，計(jì)算得到抑制常數(shù)Ki值分別為1.98、2.52 μmol·L-1。由此得出配合物2和4對(duì)PTP1B和TCPTP的抑制差異可能源于抑制方式的不同。

2.4 配合物2和4與PTPs的結(jié)合作用

為了進(jìn)一步研究鋅配合物與PTP1B、TCPTP作用，以對(duì)PTP1B選擇性較好的單核配合物2和雙核配合物4為例進(jìn)行了熒光滴定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5。圖5A中，隨著2的加入，335 nm處的熒光峰迅速減弱，且逐漸位移到340 nm，表明配合物2與PTP1B之間發(fā)生了相互作用。以335 nm處的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，c2/cPTP1B為橫坐標(biāo)作圖。從圖5B可看出2與PTP1B的結(jié)合比1∶1，即配合物2與PTP1B只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。通過Stern-Volmer方程作圖(圖5C)得到一條直線，求得kq值為1.02×1014L·mol-1·s-1遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，屬于靜態(tài)猝滅[24]。根據(jù)熒光猝滅方程計(jì)算配合物與PTP1B的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.01，結(jié)合常數(shù)為1.12×106L·mol-1。

同樣的方法得到配合物2對(duì)TCPTP以及4對(duì)PTP1B、TCPTP的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合比等，結(jié)果列于表3。2和4對(duì)PTP1B的結(jié)合常數(shù)大于TCPTP，表明其對(duì)PTP1B的結(jié)合能力強(qiáng)于TCPTP，與其對(duì)兩者的抑制能力一致。

圖5 配合物2對(duì)PTP1B作用的熒光分析:(A)熒光猝滅曲線;(B)配合物2滴定PTP1B的擬合曲線; (C)配合物2對(duì)PTP1B作用的Stern-Volmer圖Fig.5Fluorescence emission spectra of the titration of PTP1B by 2,(A)fluorescence quenching curves;(B)a plot of the intensities of emission at 331 nm against the ratio c2/cPTP1Bat 310 K;(C)Stern-Volmer plots for the quenching of PTP1B by 2 at 310 K

表3 配合物2、4與PTP1B及TCPTP的結(jié)合數(shù)n，熒光猝滅常數(shù)Ksv和結(jié)合常數(shù)KaTable 3Interaction parameters of complexes 2 and 4 with PTP1B and TCPTP

3 結(jié)論

本文研究了5種多苯并咪唑鋅配合物對(duì)5種蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制作用，結(jié)果顯示這些配合物強(qiáng)烈抑制PTP1B的活性。其中2種配合物對(duì)PTP1B表現(xiàn)出較強(qiáng)的選擇性，表明配合物的結(jié)構(gòu)影響其對(duì)PTP1B的選擇性。進(jìn)一步研究顯示其選擇性可能與其抑制方式有關(guān)。熒光滴定表明鋅配合物與蛋白酪氨酸磷酸酶發(fā)生了結(jié)合作用。這些結(jié)果提示進(jìn)一步深入研究鋅配合物對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制作用，或許能篩選出對(duì)PTP1B具有較好選擇性的低毒高效的鋅配合物抗糖尿病藥物。

參考文獻(xiàn)：

[1]Andersen J N,Jansen P G,Echwald S M,et al.FASEB J., 2004,18:8-30

[2]Zhang S,Zhang Z Y.Drug Discovery Today,2007,12:373-381

[3]Stuible M,Doody K M,Tremblay M L.Cancer Metast.Rev., 2008,27:215-230

[4]Blaskovich M A T.Curr.Med.Chem.,2009,16:2095-2176

[5]Rhee I,Veillette A.Nat.Immunol.,2012,13:439-447

[6]Haase H,Maret W.Biometals,2005,18:333-338

[7]Maret W.Biometals,2013,26:197-204

[8]Haase H,Maret W.Exp.Cell Res.,2003,291:289-298

[9]Haase H,Maret W.J.Trace Elem.Med.Biol.,2005,19:37-42

[10]Yuan C,Lu L,Gao X,et al.J.Biol.Inorg.Chem.,2009,14: 841-851

[11]Lu L,Wang S,Zhu M,et al.Biometals,2010,23:1139-1147

[12]Yuan C,Lu L,Wu Y,et al.J.Inorg.Biochem.,2010,104: 978-986

[13]Lu L,Yue J,Yuan C,et al.J.Inorg.Biochem.,2011,105: 1323-1328

[14]Han H,Lu L,Wang Q,et al.Dalton Trans.,2012,41:11116-11124

[15]Lu L,Gao X,Zhu M,et al.Biometals,2012,25:599-610

[16]GAO Xiao-Li(高曉麗),LU Li-Ping(盧麗萍),ZHU Miao-Li (朱苗力),et al.Acta Chim.Sinica(化學(xué)學(xué)報(bào)),2009,67:929-936

[17]LI Peng-Yu(李鵬宇),LU Li-Ping(盧麗萍).Chinese.J.Inorg. Chem.(無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)),2013,9:1830-1834

[18]Lu L,Zhu M.Anti-Cancer Agents Med.Chem.,2011,11:164-171

[19]Ma L,Lu L,Zhu M,et al.Dalton Ttrans.,2011,40:6532-6540

[20]Wang Q,Lu L,Yuan C,et al.Chem.Commun.,2010,46: 3547-3549

[21]Wang Q,Zhu M,Lu L,et al.Dalton Trans.,2011,40:12926-12934

[22]Yuan C,Zhu M,Wang Q,et al.Chem.Commun.,2012,48: 1153-1155

[23]Li Y,Lu L,Zhu M,et al.Biometals,2011,24:993-1004

[24]Ma L,Lu L,Zhu M,et al.J.Inorg.Biochem.,2011,105: 1138-1147

[25]Zhu R,Lu L,Zhu M,et al.Inorg.Chim.Acta,2013,405:91-97

[26]Lu L,Zhu M.Antioxid.Redox Signaling,2014,20:2209-2224

[27]YUAN Cai-Xia(袁彩霞),LAN Shu-Fen(蘭淑芬),LU Li-Ping (盧麗萍).Chinese.J.Inorg.Chem.(無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)),2015, 31:915-922

[28]Gans P,Sabatini A,Vacca A.J.Chem.Soc.Dalton Trans., 1985,38:1195-1200

[29]Isele K,Broughton V,Matthews C J,et al.Dalton Trans., 2002:3899-3905

[30]Quiroz-Castro E,Bernes E,Barba-Behrens N.Polyhedron, 2000,19:1479-1484

[31]Liu Y C,Ma J F,Hu N H,et al.Acta Crystallogr.,Sect.E, 2003,59:m361-m362

[32]ZHU Li(朱莉),LIAO Zhan-Ru(廖展如),LONG Yun-Fei(龍?jiān)骑w),et al.Chinese.J.Inorg.Chem.(無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)),2004, 20:399-402

[33]Birker P J M W L,Schierbeek A J,Verschoor G C,et al. Chem.Commun.,1981:1124-1125

[34]Woolley E M,Tomkins J,Hepler L G.J.Solution Chem., 1972,1:341-351

PTPs Inhibition by Zinc(Ⅱ)Complexes with Multi-benzimidazole Derivatives

CHEN QingLU Li-Ping＊
(Institute of Molecular Science,Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

The inhibitory effects against human protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B),T-cell protein tyrosine phosphatase(TCPTP),megakaryocyte protein tyrosine phosphatase 2(PTP-MEG2),srchomology phosphatase 1 (SHP-1)and srchomology phosphatase 2(SHP-2)of five zinc(Ⅱ)complexes with multi-benzimidazole derivatives, [Zn(TDB)2]Cl2(1),[Zn(NTB)Cl]Cl(2),[Zn(EDTB)]Cl2(3),[Zn2(EGTB)Cl2]Cl2(4)and[Zn2(DTPB)Cl3]Cl(5)(TDB= 1,2-bis(1H-benzo-imidazol-2-yl)ethane-1,2-diol,NTB=tris(1H-benzoimidazol-2-ylmethyl)amine,EDTB=N,N,N′,N′-tetrakis(1H-benzoimidazol-2-ylmethyl)ethane-1,2-diamine,EGTB=bis(1H-benzoimidazol-2-ylmethyl)-[2-(2-{2-[bis-(1H-benzoimidazol-2-ylmethyl)-amino]ethoxy}ethoxy)ethyl]amine and DTPB=1,1,4,7,7-pentakis(1H-benz-imidazol-2-ylmethyl)-1,4,7-triazaheptane),were evaluated in vitro in this paper.The five zinc(Ⅱ)complexes potently inhibit PTP1B with IC50at range from 0.15 to 0.28 μmol·L-1，but show weaker inhibition against PTP-MEG2,SHP-1, almost no inhibition against SHP-2.It is interesting that complexes 2 and 4 exhibit weaker inhibition than 1,3 and 5 against TCPTP that is highly homologous with PTP1B.Therefore,2 and 4 display obvious selective against PTP1B with 7～12 times stonger than against TCPTP,10～15 times stonger than against PTP-MEG2,20～40 timesstonger than against SHP-1 and about 1 000 times stonger than against SHP-2,suggesting the structure of zinc(Ⅱ) complexes influence the selectivity against PTP1B.Kinetic analysis indicates that complexes 2 and 4 are reversible competitive inhibitors of PTP1B but noncompettitive inhibitors for TCPTP.Fluorescence study on the interaction between complex 2 or 4 and PTP1B or TCPTP suggests that the complexes bind to PTP1B or TCPTP with the formation of a 1∶1 complex.The binding constant are about 1.12×106,5.47×105,1.19×106,and 4.95×105L·mol-1respectively,showing stronger binding ability of 2 and 4 to PTP1B than to TCPTP,agreeing with their inhibition against the two enzymes.

zinc(Ⅱ)complex;protein tyrosine phosphatase;inhibition;selectivity

O614.24+1；O611.3

A

1001-4861(2016)06-1001-08

10.11862/CJIC.2016.123

2015-12-11。收修改稿日期：2016-02-09。

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.21271121)和山西省回國(guó)留學(xué)人員科研項(xiàng)目(No.2013-026)資助。

＊通信聯(lián)系人。E-mail：luliping@sxu.edu.cn