李張軍，牛新武，肖生祥，Khan Abidullah，劉彥婷，馬慧群，彭振輝

(西安交通大學(xué)：1.第二附屬醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710004；2. 第一附屬醫(yī)院燒傷整形科，陜西西安 710061)

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◇技術(shù)方法研究◇

小鼠皮膚光老化動物模型建立方法的改良

李張軍1，牛新武1，肖生祥1，Khan Abidullah2，劉彥婷1，馬慧群1，彭振輝1

(西安交通大學(xué)：1.第二附屬醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710004；2. 第一附屬醫(yī)院燒傷整形科，陜西西安 710061)

目的 改良小鼠皮膚光老化動物模型的建立方法，為臨床防治皮膚光老化打下基礎(chǔ)。方法 設(shè)計制作一種構(gòu)建小鼠皮膚光老化動物模型的裝置，利用裝置中紫外線(UVA 315～400 nm；UVB 280～315 nm)照射ICR小鼠，3次/周，共12周，累計照射劑量：UVA為151.20 J/cm2，UVB為22.68 J/cm2；觀察照射部位皮膚的臨床表現(xiàn)、組織病理及超微結(jié)構(gòu)的改變情況，測定皮膚中羥脯氨酸含量。結(jié)果 與正常對照組小鼠皮膚比較，模型組皮膚出現(xiàn)粗糙增厚、彈性喪失、粗深皺紋、毛細血管擴張、脫屑及皮革樣外觀；組織病理可見表皮不規(guī)則增厚，真皮膠原纖維變性，斷裂減少，排列紊亂，分布不均；超微結(jié)構(gòu)顯示膠原纖維排列紊亂，分布不均，周期性橫紋不清，橫斷面膠原纖維直徑增大，粗細不等；皮膚中羥脯氨酸含量顯著減少(P<0.01)。提示造模成功。結(jié)論 利用改良的自制造模裝置建立ICR小鼠皮膚光老化動物模型是一種簡便易行、經(jīng)濟實用、可復(fù)性強的方法。

小鼠；皮膚；光老化；動物模型；方法改良

光老化導(dǎo)致皮膚過早出現(xiàn)粗糙、深亂皺紋、色素異常、脆性增加、毛細血管擴張及皮革樣外觀等損美性癥狀，嚴(yán)重影響人們的外表[1]。隨著審美標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，人們對皮膚光老化的防治越來越重視。光老化動物模型是研究光老化發(fā)病機制和篩選防治皮膚光老化藥物的重要媒介。因此，建立一種模擬性強、操作簡便和評價指標(biāo)明確的光老化動物模型一直是研究熱點[2]，相關(guān)報道也很多，但主要采用紫外線光療儀和自制的紫外線燈箱長期反復(fù)照射無毛小鼠進行造模[3-6]，其成本高昂，小鼠易脫水死亡，應(yīng)用受限。本研究對造模方法作了一些改良，首先設(shè)計制作一種構(gòu)建小鼠皮膚光老化動物模型的裝置，然后利用裝置的中長波紫外線照射ICR小鼠背部皮膚建立皮膚光老化動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性ICR小鼠20只，體質(zhì)量(24±2)g，由西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，常規(guī)飼食飲水，無不良因素影響，生活環(huán)境相對穩(wěn)定[溫度(23±2)℃、濕度(55±5)%、12 h晝夜交替]。

1.2 主要儀器及試劑

自制的一種構(gòu)建小鼠皮膚光老化動物模型裝置(圖1)；40 W長波紫外線(UVA)燈管2支，發(fā)射光譜315～400 nm，峰值365 nm，40 W中波紫外線(UVB)燈管4支，發(fā)射光譜280～315 nm，峰值312 nm(北京電光源研究所)；UVA和UVB型紫外線輻照計(上海希格瑪高技術(shù)有限公司)；H-600透射式電子顯微鏡(日本日立公司)；羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 紫外線照射

將20只雄性ICR小鼠隨機分為正常對照組和模型組，每組10只，用電動剃毛刀剃除約3 cm×3 cm面積小鼠背部毛發(fā)，以后每次照射前均剃毛。調(diào)整造模裝置的小鼠箱高度，使燈管距離背部皮膚30 cm。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自第2周開始照射模型組，3次/周(周一、周三、周五)，每次照射前燈管預(yù)熱15 min，第2～4周每次照射時間分別為20、40、60 min，自第5周開始每次80 min，共照射12周(UVA輻照強度累計為151.20 J/cm2，UVB輻照強度累計為22.68 J/cm2)。

1.4 組織取材及標(biāo)本制備

照射12周后用40 g/L硫化鈉給小鼠背部脫毛，100 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉，立即切取背部皮膚組織在冰生理鹽水中漂洗，去除血液，濾紙拭干后分成3份，一份標(biāo)本經(jīng)100 mL/L中性甲醛固定，石蠟包埋，切片(5 μm)進行常規(guī)HE染色、膠原纖維MASSON染色，用于普通光學(xué)顯微鏡觀察；一份切成1 mm3的小方塊，經(jīng)25 g/L戊二醛及10 g/L四氧化餓雙固定，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，切超薄片(70 nm)進行醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，用于透射電鏡觀察；剩余標(biāo)本立即置液氮中速凍，然后放入-80 ℃冰箱中凍存，用于檢測皮膚羥脯氨酸含量。光鏡下每個MASSON染色切片隨機選取5個區(qū)域(×200)，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算膠原纖維面積占皮膚總面積的百分比。

與戴威漸行漸遠的，還有他的員工?！暗胶笃冢蠹腋杏X老戴太過堅持，以致員工沒有善終，這跟餓了么的張旭豪、小藍的李剛形成鮮明對比。到后期，員工其實期待公司能夠賣得好，這樣大家的利益都有保障，而戴威堅持獨立發(fā)展，員工就要接受裁員，這是很痛苦的，大家都沒有善終?！盧aven說。

1.5 小鼠皮膚羥脯氨酸含量的測定

取小鼠皮膚組織50 mg，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明操作，采用堿水解法檢測皮膚組織中羥脯氨酸的含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異性比較采用獨立樣本的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建小鼠皮膚光老化動物模型的裝置

該裝置包括照射箱和小鼠箱；其中，照射箱內(nèi)側(cè)的頂部安裝有6支紫外線燈管(2支UVA燈管+4支UVB燈管)；照射箱的兩個相鄰側(cè)壁上設(shè)置有通風(fēng)孔，與其中一個通風(fēng)孔相對的側(cè)壁上設(shè)置有電源開關(guān)組和排氣扇，電源開關(guān)組中的一個電源開關(guān)用于控制排氣扇，其余電源開關(guān)用于控制6支紫外線燈管；照射箱上設(shè)置有箱門，其與設(shè)置有電源開關(guān)組的側(cè)壁相鄰，箱門設(shè)置有透明觀察孔和把手，其上端活動鉸接于照射箱的頂部；小鼠箱為具有六面體的箱體，其側(cè)壁由透明材料制成，其頂部設(shè)置有網(wǎng)柵，網(wǎng)柵一端活動鉸接于小鼠箱的側(cè)壁上，另一端通過搭扣鎖定；小鼠箱側(cè)壁上設(shè)置有飲水器，其底部設(shè)置有高度可調(diào)解的支撐腳；使用時，將小鼠箱放置在照射箱內(nèi)(圖1)。

正常對照組小鼠背部皮膚色澤正常、光滑、彈性好；模型組皮膚出現(xiàn)粗糙增厚、彈性喪失、粗深皺紋、毛細血管擴張、脫屑及皮革樣外觀等光老化改變(圖2)。

2.3 組織病理學(xué)改變

正常對照組表皮正常、結(jié)構(gòu)完整，真皮膠原纖維呈波浪狀排列，整齊有序，分布均勻，血管正常，細胞成分及數(shù)量適中；模型組表皮不規(guī)則增厚，真皮膠原纖維變性，排列紊亂，膠原束增粗、卷曲、斷裂、疏密分布不均，可見毛細血管擴張，附屬器增生，炎性細胞浸潤(圖3)。

2.4 膠原纖維Masson染色

正常對照組膠原纖維呈波浪狀緊密排列，整齊有序，分布均勻；模型組膠原纖維變性，含量減少，排列紊亂，疏密分布不均(圖4)。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對膠原纖維面積占皮膚總面積比值進行測定，結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型組皮膚膠原纖維相對含量減少(P<0.01，圖5)。

圖1 一種構(gòu)建小鼠皮膚光老化動物模型的裝置

Fig.1 The device for establishing skin photoaging model in mice
A：裝置整體剖視圖；B：照射箱結(jié)構(gòu)示意圖；C：小鼠箱結(jié)構(gòu)示意圖；D：小鼠箱主視圖。1：照射箱；2：電源開關(guān)組；3：水瓶；4：排氣扇；5：紫外線燈管；6：通風(fēng)孔；7：支撐腳；8：小鼠箱；9：四通飲水管；10：燈架；11：觀察孔；12：把手；13：箱門；14：搭扣；15：網(wǎng)柵；16：橡膠管；17：直接飲水管；18：瓶塞。

圖2 ICR小鼠皮膚外觀

Fig.2 Appearance of the dorsal skin of ICR mice
A：正常對照組；B：模型組。

圖3 ICR小鼠皮膚組織病理學(xué)的改變

Fig.3 Histopathologic changes of ICR mouse dorsal skin by HE staining (HE, ×200)
A：正常對照組；B：模型組。

圖4 ICR小鼠皮膚膠原纖維Masson染色結(jié)果

Fig.4 Findings of skin collagen fibers by Masson staining (Masson, ×200)
A：正常對照組；B：模型組。

2.5 透射電鏡下皮膚中膠原纖維的變化

正常對照組膠原纖維分布均勻，可見周期性橫紋，橫斷面膠原纖維直徑大小相等、均勻分布；模型組膠原纖維排列紊亂，分布不均，周期性橫紋不清，橫斷面膠原纖維直徑增大，粗細不等(圖6)。

2.6 小鼠皮膚羥脯氨酸含量的變化

與正常對照組(2.64±0.57)μg/mg比較，模型組小鼠皮膚羥脯氨酸含量顯著減少[(1.83±0.49)μg/mg](P<0.01，n=10)。

3 討 論

皮膚老化包括時程老化和光老化，前者是由遺傳學(xué)控制下不可逆的自然生理過程，后者是由慢性紫外線暴露所致的皮膚老化[7]。光老化動物模型是醫(yī)學(xué)研究的重要實驗?zāi)Ｐ?，對研究皮膚光老化發(fā)病機制和治療光老化疾病有著重要意義。然而，國內(nèi)外皮膚光老化動物模型的造模方法及檢驗?zāi)Ｐ偷某晒εc否仍沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[2]。當(dāng)前科研工作者主要以無毛小鼠為動物模型，可以避免造模時反復(fù)脫毛，這類動物經(jīng)紫外線反復(fù)照射后引起真皮結(jié)締組織的改變非常類似于人光老化皮膚[3-4]。但是，無毛小鼠價格昂貴，國內(nèi)數(shù)量少，限制了其應(yīng)用。本實驗選擇最常用的ICR小鼠作為實驗動物，價格低廉，適用性廣，且通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ炷：?，出現(xiàn)了典型的皮膚光老化特征。

圖5 皮膚膠原纖維圖像分析結(jié)果

Fig.5 Image analysis results of skin collagen fibers
與正常對照組比較，*P<0.01(n=10)。

圖6 透射電鏡下皮膚膠原纖維的變化

Fig.6 Changes of skin collagen fibers under transmission electron microscope (TEM, ×20 000)
A：正常對照組；B：模型組。

目前，缺乏專門用于構(gòu)建小鼠皮膚光老化動物模型的設(shè)備。國內(nèi)外文獻報道，構(gòu)建皮膚光老化動物模型主要通過紫外線光療儀和自制的紫外線燈箱產(chǎn)生紫外線，然后利用紫外線長期反復(fù)照射小鼠[4-6]。但是，紫外線光療儀因?qū)嶒炘O(shè)計中對紫外線波長的不同要求而應(yīng)用受限，且價格昂貴，一般實驗者因經(jīng)費有限購置的可能性不大；自制的紫外線燈箱標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，照射時間過長，大量產(chǎn)熱，易造成小鼠脫水死亡。因此，我們設(shè)計制作了一種構(gòu)建小鼠皮膚光老化動物模型的裝置，為光老化動物實驗提供借鑒。與現(xiàn)有的技術(shù)設(shè)備相比，該裝置使用方便，成本低廉，可滿足多只小鼠同時造模；照射箱設(shè)有通風(fēng)孔和排氣扇，小鼠箱設(shè)有飲水器，能改善箱內(nèi)的空氣質(zhì)量和溫度，滿足小鼠飲水，從而降低小鼠死亡率；可通過調(diào)整紫外線燈管的類型和數(shù)量，配合電源開關(guān)組，實現(xiàn)對紫外線波長及照射強度的調(diào)節(jié)，來滿足不同實驗設(shè)計對照光的要求；小鼠箱設(shè)有高度可調(diào)節(jié)的支撐腳，能滿足實驗設(shè)計對照光距離的不同要求。

太陽光中到達地球表面的紫外線主要是長波紫外線(UVA 315～400 nm，95%)和中波紫外線(UVB 280～315 nm，4%～5%)[8]。UVB穿透力弱，大部分被表皮所吸收，但階能較高；UVA能穿透表皮深達真皮、皮下組織，但其階能低，發(fā)揮效應(yīng)所需的劑量較UVB大1 000倍[9]。研究發(fā)現(xiàn)，UVA和UVB照射皮膚可產(chǎn)生活性氧/活性氮(ROS/RNS)，損傷DNA，影響多種細胞通路和基因表達，最終導(dǎo)致皮膚炎癥、光老化和皮膚癌[9-10]。因此，本實驗采用UVA和UVB聯(lián)合照光。

皮膚光老化最具特征性的組織病理表現(xiàn)是膠原纖維變性紊亂、含量減少和異常彈性纖維沉積[11-12]。與正常對照組小鼠皮膚相比，模型組表皮不規(guī)則增厚，真皮膠原纖維變性，斷裂減少，排列紊亂，分布不均。超微結(jié)構(gòu)顯示模型組膠原纖維排列紊亂，分布不均，周期性橫紋不清，橫斷面膠原纖維直徑增大，粗細不等。羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸，測定它的含量可以間接反映皮膚中膠原蛋白含量的變化。本研究發(fā)現(xiàn)模型組羥脯氨酸含量顯著減少，提示模型組皮膚膠原蛋白含量減少。這些改變均為皮膚光老化的典型特征，結(jié)合肉眼觀察可確證造模成功。

綜上所述，本研究通過對造模方法進行適當(dāng)改良，利用自制的構(gòu)建小鼠皮膚光老化模型裝置，成功建立了ICR小鼠皮膚光老化動物模型，為臨床開展光老化的防治研究提供一種簡便易行、經(jīng)濟實用、可復(fù)性強的造模方法。

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(編輯 卓選鵬)

Improvement of establishing skin photoaging model in mice

LI Zhang-jun1, NIU Xin-wu1, XIAO Sheng-xiang1, KHAN Abidullah2, LIU Yan-ting1, MA Hui-qun1, PENG Zhen-hui1

(1. Department of Dermatology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Xi’an 710004; 2. Department of Burn and Plastic Surgery, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To improve the method of establishing skin photoaging model in mice so as to provide basis for the prevention and treatment of skin photoaging. Methods A device for establishing skin photoaging model in mice was designed and made. ICR mice were irradiated under ultraviolet A (UVA 315-400 nm) and ultraviolet B (UVB 280-315 nm) with the device for 12 weeks (three times a week), at the total dose of UVA and UVB of 151.20 J/cm2and 22.68 J/cm2, respectively. The irradiated skin was analyzed by clinical observation, histopathologic examination, electron microscopy; the hydroxyproline content in the skin was determined. Results Compared with those in control group, clinical signs in model group included skin coarseness, increased thickness, loss of resilience, deep and coarse wrinkles, telangiectases, scales, and a leathery appearance. Histopathologic examination showed that the epidermis was hypertrophic and that collagen fibers in the dermis were denatured, disorganized, decreased, and unevenly distributed. These findings were supported by electron microscopy. The hydroxyproline content in model group decreased significantly (P<0.01), suggesting that the skin photoaging model in ICR mice was established successfully. Conclusion This improved method is easy, economical and reproducible. It can be widely applied to research on skin photoaging.

mouse; skin; photoaging; animal model; method improvement

2014-11-29

2015-02-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81271741) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81271741)

牛新武. E-mail: nxw192@126.com

R751

A

10.7652/jdyxb201601028

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1703.020.html(2015-12-09)