陳 茜，陳麗娟，黨媛媛，李 牧，吳曉玲

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004)

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姜黃素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-B侵襲轉(zhuǎn)移的影響

陳 茜，陳麗娟，黨媛媛，李 牧，吳曉玲

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004)

目的 研究姜黃素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-B侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其可能的機(jī)制。方法 不同濃度(0、10、20、30 μmol/L)的姜黃素處理HEC-1-B細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)其對(duì)HEC-1-B細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；體外Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素和/(或)PDTC對(duì)HEC-1-B細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；Western blot檢測(cè)姜黃素對(duì)MMP-2、MMP-9表達(dá)、活性以及p65、p50蛋白水平的影響。結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及侵襲，且其作用呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。此外，姜黃素處理HEC-1-B細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)、蛋白酶活性及P65、P50水平均明顯減弱。單獨(dú)使用姜黃素、PDTC組均可抑制其侵襲力，兩者聯(lián)合用藥后對(duì)癌細(xì)胞侵襲能力的抑制效應(yīng)較單獨(dú)使用更明顯，且明顯下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，從而進(jìn)一步拮抗HEC-1-B細(xì)胞的粘附和侵襲。結(jié)論 姜黃素通過抑制上游核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)活性而下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，姜黃素是一種潛在的子宮內(nèi)膜癌治療劑。

姜黃素；子宮內(nèi)膜癌；侵襲；MMPs；核轉(zhuǎn)錄因子κB

隨著發(fā)病率的逐年上升，子宮內(nèi)膜癌已成為發(fā)達(dá)國(guó)家最常見的婦科惡性腫瘤之一[1-3]。根據(jù)發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為特點(diǎn)可分為：Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌(子宮內(nèi)膜樣癌)，為雌激素依賴型，腫瘤分化較好，通常被認(rèn)為是低危且可治療的；Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌(非子宮內(nèi)膜樣癌)，為非雌激素依賴型，其特點(diǎn)為發(fā)病率高、腫瘤惡性度高、易發(fā)生深肌層浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，故預(yù)后不良、死亡率高[4]。目前其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，探索并闡明子宮內(nèi)膜癌的遷移及侵襲機(jī)制有助于我們尋找新的治療途徑。姜黃素(curcumin)是香料姜黃(Curcuma longa)的活性成分，具有廣泛的藥理作用，近年來其抗腫瘤作用成為研究熱點(diǎn)[5]。多項(xiàng)研究證實(shí)，姜黃素可以通過調(diào)控多種生長(zhǎng)信號(hào)通路來發(fā)揮其抗腫瘤的作用[6]，但目前其對(duì)子宮內(nèi)膜癌的抗侵襲轉(zhuǎn)移作用鮮有報(bào)道。因此，本研究將探討姜黃素對(duì)子宮內(nèi)膜癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并探索其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)

HEC-1-B細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。細(xì)胞均培養(yǎng)于DMEM或含100 mL/L胎牛血清的DMEM-F12，然后在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2 細(xì)胞活性的評(píng)估

細(xì)胞活性采用MTT比色法判定。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1-B細(xì)胞消化重懸后接種于96孔培養(yǎng)板(每孔2×104細(xì)胞)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至70%～80%細(xì)胞融合后，加入不同濃度的姜黃素，其中無藥物干預(yù)組為對(duì)照組，不含細(xì)胞的為空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。然后用PBS沖洗2次，每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)于37 ℃孵育4 h。小心棄去孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，與平板搖床上振蕩10 min，酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值。細(xì)胞活力=(給藥組吸光度-空白組吸光度)/(對(duì)照組吸光度-空白組吸光度)×100%。

1.3 侵襲實(shí)驗(yàn)

腫瘤細(xì)胞的侵襲潛力通過體外Transwell小室實(shí)驗(yàn)來評(píng)估。首先，用Matrigel覆蓋Transwell板上室，將含不同濃度姜黃素或/和20 μmol/L核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活化抑制劑吡咯烷二硫代甲酸銨(ammonium pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC)預(yù)處理的細(xì)胞(1×106)于無血清培養(yǎng)基中加入上室，100 mL/L FBS加入下室，培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室取出，小心擦去上層細(xì)胞，晾干后，固定、染色，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.4 Western blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平

經(jīng)藥物處理的HEC-1-B細(xì)胞裂解、離心后，提取總蛋白。取80 μg蛋白樣品進(jìn)行100 g/L或120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，50 g/L脫脂牛奶(TBST配制)室溫封閉1 h后，一抗(抗-MMP-2、MMP-9、P65、P50、Histone H3和β-actin)4 ℃孵育過夜。次日，室溫下用相應(yīng)的二抗孵育1 h。暗室中顯色，并用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.5 明膠酶譜法分析MMP-2/MMP-9蛋白的活性

HEC-1-B細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、10、20、30 μmol/L)的姜黃素處理24 h后，細(xì)胞條件培養(yǎng)基樣本經(jīng)由含1 g/L明膠的80 g/L SDS-PAGE電泳收集及分離。在室溫條件下用2.5%的TritonX-100(50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)洗滌凝膠2遍，時(shí)間為45 min。然后置于反應(yīng)液(40 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L CaCl2和0.01% NaN3，pH 8.0)中37 ℃孵育14 min。繼之用考馬斯亮藍(lán)R-250凝膠染色劑進(jìn)行染色。應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算凝膠條帶的強(qiáng)度。根據(jù)活細(xì)胞數(shù)目調(diào)整樣本量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞增殖的抑制作用

采用MTT法檢測(cè)不同濃度(0～100 μmol/L)的姜黃素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞活性的作用(圖1)。結(jié)果表明，與對(duì)照組(即未處理組)相比，濃度為10、20、30 μmol/L的姜黃素處理24、48、72 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯抑制，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Two-Way ANOVA，P>0.05)；當(dāng)姜黃素濃度為≥40 μmol/L時(shí)，隨著藥物濃度的增加以及孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，HEC-1-B細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Two-Way ANOVA- Dunnett’s檢驗(yàn)，F(xiàn)=122.1，P均<0.001)，提示姜黃素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞活力的影響呈劑量-時(shí)間依賴性。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇姜黃素的濃度范圍為0、10、20、30 μmol/L進(jìn)行研究。

2.2 不同濃度姜黃素對(duì)HEC-1-B 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用

如圖2A所示，用不同濃度(0、10、20、30 μmol/L)姜黃素處理HEC-1B細(xì)胞24 h后，細(xì)胞侵襲力顯著抑制，且Dunnett’s檢驗(yàn)結(jié)果顯示各給藥組濃度的細(xì)胞侵襲力與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈濃度依賴性(10 μmol/Lvs.對(duì)照組，P<0.05；20 μmol/Lvs.對(duì)照組，P<0.01；30 μmol/Lvs.對(duì)照組，P<0.01)。定量分析結(jié)果顯示，用10、20、30 μmol/L姜黃素處理HEC-1-B細(xì)胞時(shí)，其侵襲力分別降低了18.58%、51.89%和73.58%(圖2B)。

圖1 姜黃素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞活性的影響

Fig.1 Effects of curcumin on the viability of HEC-1-B cells
***P<0.001。

2.3 姜黃素對(duì)MMP-2、MMP-9的表達(dá)及活性的抑制作用

如圖3A和3B所示，不同濃度(0、10、20、30 μmol/L)姜黃素處理HEC-1-B細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，姜黃素對(duì)MMP-2/-9蛋白表達(dá)的顯著抑制作用呈濃度依賴性(One-Way ANOVA；F=704.3，P均<0.01)。圖3C和3D表明姜黃素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞中MMP-2/MMP-9的活性也有類似的抑制作用(One-Way ANOVA；F=245.1，P均<0.01)。

圖2 姜黃素對(duì)體外HEC-1-B細(xì)胞侵襲力的影響
Fig.2 Effects of curcumin oninvitroinvasion of HEC-1-B cells
A：采用Transwell 小室分析姜黃素對(duì)HEC-1-B細(xì)胞的侵襲力的影響；B：與未處理組相比，各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)侵襲細(xì)胞數(shù)的定量分析。與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01。

圖3 姜黃素抑制HEC-1-B 細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9的表達(dá)及活性

Fig.3 Curcumin suppressed the expression and activity of MMP-2 and MMP-9 in HEC-1-B cells
A：Western blot檢測(cè)MMP-2/MMP-9表達(dá)；B：定量分析MMP-2/MMP-9的相對(duì)表達(dá)水平；C：明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2/MMP-9活性；D：MMP-2/MMP-9活性的定量分析。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 姜黃素抑制HEC-1-B細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的活化

多項(xiàng)研究證實(shí)，姜黃素通過抑制NF-κB信號(hào)活性來達(dá)到其抗腫瘤的目的。如圖4A和4B所示，與以往研究一致，我們證實(shí)不同濃度的姜黃素處理的HCE-1-B細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，P65、P50表達(dá)水平明顯降低，且抑制率呈濃度依賴性(One-Way ANOVA；F=471.1，P均<0.01)。

2.5 姜黃素通過抑制HEC-1-B細(xì)胞中上游NF-κB活性而抑制MMPs的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移

為了進(jìn)一步闡明姜黃素抑制HEC-1-B細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們用引入NF-κB活化抑制劑PDTC。將細(xì)胞分為：空白對(duì)照組及3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：10 μmol/L姜黃素、20 μmol/L PDTC、姜黃素+PDTC預(yù)處理HEC-1-B細(xì)胞24 h后，實(shí)施體外細(xì)胞侵襲力分析，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用姜黃素、PDTC組均可抑制其侵襲力，兩者聯(lián)合用藥后抑制效應(yīng)較單獨(dú)使用更明顯(圖5；One-Way ANOVA-Dunnett’s檢驗(yàn)，F(xiàn)=121.3，curcuminvs.對(duì)照組，P<0.05；PDTCvs.對(duì)照組，P<0.01；curcumin+PDTCvs.對(duì)照組，P<0.01)。進(jìn)一步檢測(cè)各處理組的MMP-2、MMP-9的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用姜黃素對(duì)MMP-2/MMP-9表達(dá)的抑制效應(yīng))，類似與單獨(dú)使用NF-κB活化抑制劑PDTC的作用(One-Way ANOVA-Dunnett’s檢驗(yàn)，F(xiàn)=266.4，vs.對(duì)照組，P<0.01，P<0.001)，兩者聯(lián)合用藥效果明顯強(qiáng)于兩者單獨(dú)使用，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，姜黃素是通過抑制上游的NF-κB活性來調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，從而進(jìn)一步拮抗HEC-1-B細(xì)胞的黏附和侵襲。

圖4 姜黃素對(duì)HEC-1B 細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路活化的影響

Fig.4 Curcumin inhibited the activation of the NF-κB signaling pathway in HEC-1B cells
A：Western blot檢測(cè)P65、P50的表達(dá)；B：定量分析各處理組P65、P50相對(duì)表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，***P<0.01。

3 討 論

姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種植物多酚，其分子式為C21H20O6，相對(duì)分子量為368.37，因其色澤穩(wěn)定且毒性很低被廣泛應(yīng)用于食品上色和佐位[7]。姜黃素具有抗炎、抗凝、降血脂、抗類風(fēng)濕等廣泛的藥理作用[8-10]，尤其是抗腫瘤作用，美國(guó)國(guó)立腫瘤所已將其列為第3代癌化學(xué)預(yù)防藥[11]。有研究指出，來曲唑和姜黃素通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制轉(zhuǎn)移性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)[12-13]。然而，姜黃素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移作用尚不明確。利用MTT及Transwell小室，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素可在無細(xì)胞毒性濃度下(<40 μmol/L)抑制HEC-1-B細(xì)胞的侵襲能力，且呈濃度-時(shí)間依賴性。腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲涉及多環(huán)節(jié)、多基因的復(fù)雜過程，而細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的降解是腫瘤細(xì)胞向正常組織侵襲和開始轉(zhuǎn)移的信號(hào)和途徑。作為一類重要的ECM降解酶，MMP-2/MMP-9被報(bào)道在子宮內(nèi)膜癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[14-17]，且與疾病的發(fā)生和進(jìn)展緊密相關(guān)，因此抑制MMP-2/MMP-9為腫瘤治療提供了新的靶點(diǎn)[18]。那么姜黃素作為一種新的MMP-2/MMP-9活性抑制劑[16]，是否通過下調(diào)HEC-1-B細(xì)胞的MMP-2/MMP-9活性來發(fā)揮其抗侵襲作用呢？我們首先檢測(cè)不同濃度姜黃素處理的HEC-1-B細(xì)胞中MMP-2/MMP-9的表達(dá)及活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制MMP-2/MMP-9的蛋白表達(dá)及活性，證實(shí)姜黃素的抗侵襲作用與MMP-2/MMP-9活性抑制相關(guān)。

圖5 姜黃素通過抑制上游NF-κB活性而介導(dǎo)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移

Fig.5 Curcumin suppressed the invasion and metastastic capabilities of endometrial carcinoma by inhibiting upstream NF-κB to downregulate the expressions of MMP-2 and MMP-9
A：Transwell小室分析姜黃素及NF-κB抑制劑PDTC對(duì)HEC-1-B細(xì)胞侵襲能力的影響；B：對(duì)A的定量分析；C：Western blot檢測(cè)姜黃素及PDTC處理后MMP-2/MMP-9的表達(dá)；D：對(duì)C的定量分析。與Control(對(duì)照組)比較，*P<0.05，**P<0.01。

NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，由亞單位P50和P65組成的異源二聚體，P50與DNA直接結(jié)合，P65具有轉(zhuǎn)錄活性。其主要功能是調(diào)控許多基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和活性，其中包括金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)[19]。姜黃素可強(qiáng)有力地抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性，抑制了P65的核保留和磷酸化，進(jìn)而影響細(xì)胞表面黏附分子、趨化因子、TNF、MMPs、COX2和NOS的表達(dá)，抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[20]。DUARTE等[21]發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過抑制NF-κB激酶介導(dǎo)的NF-κB活化下調(diào)Bcl-2、cyclin D、IL-6等基因的表達(dá)，從而抑制頭頸鱗癌的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。TSAI等[22]揭示，姜黃素通過抑制癌細(xì)胞的NF-κB、細(xì)胞色素氧化酶-2(CYP1A2)、NO和前列腺素E2活性進(jìn)而抑制裸鼠皮膚癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡。ZONG等[23]也證實(shí)姜黃素通過抑制NF-κB的活化下調(diào)uPA的表達(dá)，拮抗MCF-7細(xì)胞的粘附和侵襲。這些研究結(jié)果促使我們進(jìn)一步研究姜黃素與NF-κB通路在子宮內(nèi)膜癌侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性。通過體外實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)不同濃度姜黃素(0、10、20、30 μmol/L)處理HEC-1-B細(xì)胞24 h后，NF-κB(p65)、p50蛋白水平明顯下降，且呈濃度依賴性。BOONRAO等[24]研究證實(shí)，姜黃素通過抑制上游的AP-1轉(zhuǎn)錄、NF-κB活性而抑制人侵襲性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的MMP-3基因的表達(dá)。本研究的體外侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，單獨(dú)使用姜黃素可產(chǎn)生與NF-κB的抑制劑PDTC相似的抗侵襲效應(yīng)，同時(shí)下調(diào)了MMP-2和MMP-9的表達(dá)，且兩者聯(lián)合使用后能增強(qiáng)單獨(dú)使用所產(chǎn)生的抑制作用。說明姜黃素抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抗侵襲作用確實(shí)與NF-κB通路相關(guān)，具體的相互作用方式及機(jī)制尚需進(jìn)一步研究?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果表明，姜黃素通過抑制上游NF-κB的活化下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制HEC-1-B細(xì)胞增殖和侵襲。提示姜黃素可作為一種新的臨床應(yīng)用，為子宮內(nèi)膜癌抗侵襲轉(zhuǎn)移的臨床治療提供理論依據(jù)。

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(編輯 卓選鵬)

Effects of curcumin on invasion and metastasis of endometrial carcinoma HEC-1-B cells

CHEN Qian, CHEN Li-juan, DANG Yuan-yuan, LI Mu, WU Xiao-ling

(Department of Obstetrics & Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

Objective To investigate the effects and possible mechanisms of curcumin on invasion and metastasis in endometrial carcinoma HEC-1-B cells. Methods HEC-1-B cells were culturedinvitroand treated with 0, 10, 20 and 30 μmol/L of curcumin. MTT assay was performed to examine cell growth; then cell invasion assay using Transwell chamber was used to evaluate the effects of curcumin/PDTC on invasion of HEC-1-B cells. The expression and activity of matrix metalloproteinases MMP-2, MMP-9 as well as the protein levels of P65 and P50 were analyzed by Western blot. Results Compared with control group, curcumin could significantly inhibit the invasion and migration abilities of HEC-1-B cellsinvitroin concentration and time-dependent manners. In addition, mechanism and functional analysis revealed that the administration of curcumin decreased the expression and activity of the extracellular matrix (ECM) factors MMP-2 and MMP-9, and the protein levels of P65 and P50, which was attributed to the suppression of anti-invasion effect produced by curcumin. Furthermore, 10 μmol/L curcumin or 20 μmol/L PDTC alone could produce similary inhibitory effect on the invasion of HEC-1-B cells. Combination of curcumin and PDTC could significantly enhance the suppressive effect, which was associated with downregulation of MMP-2/MMP-9. Conclusion These findings suggest a potential mechanism by which curcumin blocks NF-κB activity to downregulate the expression of MMP-2/MMP-9 and then inhibit the invasion and metastasis of endometrial cancer cells, suggesting that curcumin is a potent therapeutic agent for endometrial carcinoma.

curcumin; endometrial carcinoma; invasion; matrix metalloproteinases (MMPs); NF-κB

2015-03-09

2015-05-21

陜西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2014k11-01-01-18) Supported by the Social Development Research Project of Shaanxi Province (No.2014k11-01-01-18)

吳曉玲. E-mail: wxlxjtu07@sina.com

R737.33

A

10.7652/jdyxb201601026

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1724.028.html(2015-12-09)