黃楦檳，陳金水，吳天敏，陳金雄

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，福建福州 350005)

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◇中醫(yī)藥研究◇

蘇子油干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-21靶向調(diào)控MMP-9的機(jī)制

黃楦檳，陳金水，吳天敏，陳金雄

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，福建福州 350005)

目的 探討不同濃度蘇子油干預(yù)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) miR-21和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達(dá)，為蘇子油改善動(dòng)脈粥樣硬化提供依據(jù)。方法 體外培養(yǎng)HUVEC，以TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行造模，將細(xì)胞分為空白組、模型組及蘇子油高、中、低劑量組。MMT法檢測(cè)各組細(xì)胞A值；PT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-21、MMP-9基因水平；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-21模擬物轉(zhuǎn)入HUVEC細(xì)胞，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MMP-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果 蘇子油高、中、低劑量能明顯改善TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC損傷，且蘇子油對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用呈劑量依賴關(guān)系；RT-PCR結(jié)果顯示，模型組miR-21及MMP-9的表達(dá)高，蘇子油干預(yù)后，miR-21及MMP-9基因的表達(dá)逐漸減弱，且二者分別與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21后，MMP-9蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)；miR-21與MMP-9 mRNA 3′UTR區(qū)經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)論 蘇子油可能通過干預(yù)miR-21靶向調(diào)控MMP-9的表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

蘇子油；微小RNA-21；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；靶向調(diào)控；抗動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，也是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病，嚴(yán)重危害人類健康[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞( vascularendothelial cell, VEC)功能失調(diào)和損傷是AS形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)，會(huì)繼發(fā)脂質(zhì)斑塊沉積、血管內(nèi)膜增生、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)等事件[2]。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)是介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的一種重要炎癥介質(zhì)，高表達(dá)的MMP-9可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成以及斑塊破裂[3]。miRNA通過靶向作用于mRNA的3′UTR區(qū)域，引起mRNA的翻譯抑制或降解[4]，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因的表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在miR-21的表達(dá)，當(dāng)內(nèi)皮損傷時(shí)，miR-21的表達(dá)發(fā)生改變，并通過mRNA剪切和抑制蛋白翻譯的方式負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[5]。蘇子油是從唇形科紫蘇屬植物蘇子(Perillafrutescens(L.) Britt.)中提取的一種富含α-亞麻酸的植物油，其含量超過60%。蘇子油具有明顯的調(diào)血脂作用，還能降低血小板花生四稀酸水平和血栓素TXA2生成，減弱血小板凝集活性，起到抗血栓作用，對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化具有重要意義[6]?；谝陨媳尘?，本課題通過檢測(cè)TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-21和MMP-9的表達(dá)，以及二者的靶向關(guān)系，闡釋蘇子油保護(hù)血管、抗AS的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物

Wistar大鼠30只，雄性，180～220 g，購(gòu)于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。蘇子油制劑采用蘇子油軟膠囊(福州三愛藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20070052)，以41.3 mmol/L羧甲基纖維素鈉液配成所需濃度的乳液，備用。

1.2 細(xì)胞來源與主要試劑

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)株購(gòu)自上海拜力生物有限公司；EGM-2培養(yǎng)基(Lonza)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(蘭州民海)；胰蛋白酶(Biosharp公司)；二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；MMP-9引物(上海生工)；miR-21模擬物、陰性對(duì)照(上海吉瑪)；RNAiso Plus、RT-PCR試劑盒、SYBR GreenI RT-PCR試劑盒(TaKaRa)；TNF-α(R﹠D公司)；DNA Marker DLiOO(碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL Plus Western Blotting Detection System(GE Healthcare公司，美國(guó))；Trizol試劑(Invitrogen公司)；鼠抗人MMP-9單克隆抗體、鼠抗GAPDH一抗(Gilbertsville, PA)；考馬斯亮蘭、羊抗小鼠辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記二抗(北京中杉)。

1.3 主要儀器

倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)；UVP凝膠成像儀(UVP公司)；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(北京六一)；熒光定量PCR儀LightCycler480 System(Roche公司)；S3006L型高壓勻質(zhì)機(jī)(Niro Soavi公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板(武漢成龍科貿(mào)有限公司)；Realtime PCR擴(kuò)增儀(美國(guó))。

1.4 蘇子油含藥血清的制備

健康雄性大鼠12只，其中6只，使用蘇子油軟膠囊(0.028 g/mL)灌胃，每次給藥容積15 mL/kg，2次/d，連續(xù)10 d，末次給藥后1 h經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，室溫放置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃滅活30 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾器過濾除菌，置于冰箱-20 ℃冷凍備用。另取雄性SD大鼠6只，以等體積等滲鹽水灌胃，所取血清作為對(duì)照使用。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC從液氮灌中取出，迅速投入37 ℃超純水中解凍，轉(zhuǎn)移至離心管中，加4 mL DMEM高糖培養(yǎng)基，離心1 000 r/min×3 min，棄去上清，用完全培養(yǎng)液(含100 mL/L胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素的DMEM)接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)，24 h換液，棄去沒貼壁的細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至約80%時(shí)，傳代。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1.5.1 MTT法檢測(cè)蘇子油對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞活力的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板中，以200 U/mL的TNF-α對(duì)細(xì)胞進(jìn)行造模[7]，實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組及蘇子油高、中、低劑量組?？瞻捉M細(xì)胞以常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞；模型組細(xì)胞以TNF-α的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；低劑量組使用50 mL/L含藥血清(50 mL/L為含藥血清在培養(yǎng)基內(nèi)的血清稀釋濃度)預(yù)先處理HUVEC 6 h，加入200 U/mL的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 12 h；中劑量組使用100 mL/L含藥血清(100 mL/L為含藥血清在培養(yǎng)基內(nèi)的血清稀釋濃度)預(yù)先處理HUVEC 6 h，加入200 U/mL的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 12 h；高劑量組使用200 mL/L含藥血清(200 mL/L為含藥血清在培養(yǎng)基內(nèi)的血清稀釋濃度)預(yù)先處理HUVEC 6 h，200 U/mL的TNF-α培養(yǎng)HUVEC 12 h。干預(yù)完成后，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)孵育，4 h后每孔加入150 mL的DMSO，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，記錄結(jié)果。

1.5.2 RT-PCR檢測(cè)miR-21和MMP-9的表達(dá) 培養(yǎng)即分組方法如1.5.1，每組12個(gè)復(fù)孔，將同一組別的細(xì)胞收集至同一EP管中，以Trizol溶液提取總RNA。使用SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以mRNA為模板，Random為引物，1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，cDNA連同特異性引物的最終濃度為1×SYBRGreen，1×Ampli-taqPCR buffer，3 mmol/L MgCl2，dNTPs(200 μm/L)，引物0.9 μm(上游和下游)，25 μL H2O中Ampli-taqGold DNA聚合酶1.25單位，內(nèi)參β-actin的反應(yīng)體系和條件同上。反應(yīng)條件：在95 ℃ 20 s解鏈后，95 ℃ 5 s，53 ℃ 20 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)[8]。檢測(cè)miR-21和MMP-9表達(dá)水平。

依據(jù)MMP-9基因的cDNA片段(NC_005102.4)，設(shè)計(jì)兩段與模板兩端互補(bǔ)的寡核苷酸序列，根據(jù)所要連接的載體上的限制性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)下游引物，在上下游引物的5′端和3′端各加一段酶切位點(diǎn)。引物由上海生工公司合成。MMP-9具體的序列為：上游：5′-AATCTCACCGACAGGCAGCT-3′，下游：5′-CCAAACTGG ATGACGATGTC-3′。內(nèi)參具體的序列為：上游：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

1.5.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染建立miR-21高表達(dá)細(xì)胞株 以5×105細(xì)胞/孔接種24孔板培養(yǎng)24 h。按照說明書應(yīng)用LipofectamineTM 2000接種濃度為50 nmol/L的miR-21模擬物。操作如下：將0.8 μg DNA稀釋于50 μL無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。將2 μL Lipofectamine2000稀釋于50 μL無血清無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。5 min后將細(xì)胞混合，并輕輕混勻，室溫孵育20 min。吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次。將100 μL的復(fù)合物加入培養(yǎng)孔，前后搖動(dòng)培養(yǎng)板使其分布均勻，孵育4～6 h后，更換成DMEM完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染的同時(shí)，摻入少量的GFP空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后觀察轉(zhuǎn)染效率，并拍照，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率較高，達(dá)到80%。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：換含血清培養(yǎng)基24 h后將細(xì)胞以1∶10傳代。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-21模擬物和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)入HUVEC細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)分成空白組、陰性對(duì)照組和模擬組?？瞻捉M細(xì)胞給予常規(guī)培養(yǎng)，陰性對(duì)照組為轉(zhuǎn)染相應(yīng)對(duì)照的細(xì)胞，模擬組為miR-21模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，每組7個(gè)復(fù)孔。24 h后，棄上清，消化，將同一組別的細(xì)胞懸液收集至同一EP管中，離心、收集細(xì)胞沉淀，備用。

1.6 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MMP-9蛋白的表達(dá)

收集各組細(xì)胞加入50 mmol/L裂解液(Tris pH=7.5，1 mmol/L EDTA中，50 mmol/L NaCl，77.2 mmol/L Triton-X-100)，持續(xù)振搖30 min，4 ℃ 2 000 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另外EP管中，4 ℃ 18 000 r/min離心45 min，保存上清液，考馬斯亮蘭測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，樣品以上樣緩沖液稀釋后煮沸5 min使蛋白變性，備用。灌制80 g/L SDS-PAGE凝膠，取已制備好的細(xì)胞蛋白，每孔上樣量50 μL，在80 V穩(wěn)壓電場(chǎng)中電泳，電泳后用250 mA電流將蛋白置于纖維素濾膜上，脫脂奶粉封閉過夜，剪膜，根據(jù)分子量分開后分別以加入PBS緩沖液按1∶1 000稀釋的一抗(MMP-9)室溫孵育1 h，洗膜3次，將膜與以1∶500稀釋的HRP標(biāo)記二抗共同孵育1 h后洗膜，暗室中X光片曝光，Gel-analyze分析軟件分析條帶灰度，進(jìn)行半定量比較分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

HUVEC細(xì)胞輪廓清晰，呈長(zhǎng)多角形、多角形或薄橢圓形，形態(tài)不一，胞質(zhì)豐富且清亮，可見少量空泡顆粒，細(xì)胞融合成單層，貼壁生長(zhǎng)，“鋪路石樣”結(jié)構(gòu)明顯(圖1A)；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，增殖加快，排列緊密。TNF-α誘導(dǎo)后的細(xì)胞貼壁不穩(wěn)，呈鵝卵石樣排列，細(xì)胞有皺縮、不規(guī)則，胞質(zhì)空泡顆粒增多(圖1B)。蘇子油干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞量多，空泡顆粒明顯減少(圖1C)。

圖1 各組HUVEC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

Fig.1 Morphological observation of HUVEC cells in each group (×100)
A：正常細(xì)胞；B：TNF-α誘導(dǎo)后的細(xì)胞；C：蘇子油高劑量組干預(yù)后的細(xì)胞。

2.2 蘇子油對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞活力的影響

與空白組比較，模型組A值顯著降低(P<0.01)，蘇子油干預(yù)組與模型組比較A值均顯著升高(P<0.01)，但低于空白組(P<0.05)；且各蘇子油組的A值隨著蘇子油劑量的升高而升高，說明蘇子油對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)呈劑量依賴關(guān)系(表1)。

表1 蘇子油對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞活力的影響

Tab.1 Effect of Perilla oil on viability of HUVEC cells induced by TNF-α

組別給藥劑量(μg/mL)A490空白組-0.867±0.113模型組-0.429±0.057**蘇子油高劑量組0.40.711±0.081*△△蘇子油中劑量組0.20.683±0.062*△蘇子油低劑量組0.10.603±0.044*△

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01。

2.3 HUVEC細(xì)胞miR-21、MMP-9基因的表達(dá)

采用RT-PCR法檢測(cè)miR-21、MMP-9基因表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組miR-21及MMP-9的表達(dá)均高，蘇子油干預(yù)后，miR-21及MMP-9基因的表達(dá)逐漸減弱，且二者分別與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2、圖2)。

表2 蘇子油對(duì)miR-21、MMP-9基因表達(dá)的影響

Tab.2 Effect of Perilla oil on miR-21 and MMP-9 gene expressions

組別給藥劑量(μg/mL)miR-21mRNA/GAPDHmRNAMMP-9mRNA/GAPDHmRNA空白組-0.204±0.0570.256±0.029模型組-1.241±0.233**1.208±0.304**蘇子油高劑量組0.40.426±0.039*△△0.502±0.076**△△蘇子油中劑量組0.20.604±0.027**△△0.721±0.128**△蘇子油低劑量組0.10.751±0.061**△0.793±0.058**△

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

圖2 各組miR-21、MMP-9基因的表達(dá)

Fig.2 The expressions of miR-21 and MMP-9 gene
A：空白組；B：模型組；C、D、E：蘇子油高、中、低劑量組。

2.4 轉(zhuǎn)染后MMP-9蛋白的表達(dá)

Western Blot結(jié)果表明，HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后，模擬組MMP-9蛋白的表達(dá)顯著增高，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，空白組與陰性對(duì)照組比較無差異(圖3)。

圖3 Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MMP-9的表達(dá)

Fig.3 The expression of MMP-9 after transfection detected by Western blot

2.5 靶向結(jié)合位點(diǎn) ST利用targetscan(http：//www.targt tscan.org)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-21與MMP-9 mRNA 3′UTR區(qū)的靶向結(jié)合作用，結(jié)果顯示，MMP-9 mRNA 3′UTR區(qū)與miR-21存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是多層次的多種因素和細(xì)胞成分間相互影響的瀑布式的發(fā)展過程，其中心環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮受損[9]。內(nèi)皮由于各種原因(機(jī)械因素、Ox-LDL、毒素)受損時(shí)可分泌單核細(xì)胞趨化因子，使單核細(xì)胞黏附于受損的內(nèi)皮細(xì)胞，兩種細(xì)胞膜的直接接觸可能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，同時(shí)還可釋放大量的細(xì)胞因子，如白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等。這些因子通過自分泌或旁分泌也可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMPs，促使內(nèi)皮屏障功能進(jìn)一步降低[10]。因此，細(xì)胞因子和MMPs與動(dòng)脈粥樣硬化的形成有重要的內(nèi)在聯(lián)系?；诖耍緦?shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)HUVEC，以TNF-α對(duì)細(xì)胞進(jìn)行造模，從miR-21及其靶向基因MMP-9的表達(dá)水平分析蘇子油對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α對(duì)HUVEC進(jìn)行造模后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，貼壁不穩(wěn)，細(xì)胞變短變圓，細(xì)胞有皺縮、不規(guī)則，胞質(zhì)空泡顆粒增多，細(xì)胞A值較空白組顯著下降，說明以TNF-α建立細(xì)胞損傷模型成功；而以蘇子油含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞狀態(tài)明顯改善，細(xì)胞增殖明顯，排列整齊，胞質(zhì)空泡顆粒減少，且各蘇子油組的A值隨劑量的升高而升高，說明蘇子油能對(duì)損傷模型的HUVEC產(chǎn)生保護(hù)作用，并呈劑量依賴關(guān)系。

MMP-9的主要生物學(xué)功能是參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的降解及重構(gòu)。ECM是血管壁的主要成分，也構(gòu)成了粥樣斑塊的纖維帽部分，ECM的重構(gòu)是參與形成AS的重要過程[11]。在AS發(fā)生過程中，損傷部位活化 MMP-9[12-13]，降解ECM，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和移行，在AS的發(fā)生、發(fā)展及斑塊破裂過程中發(fā)揮著重要作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)AS斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)水平越高，被檢出微栓子的陽性率越高[14]。microRNA(miRNA)是非常保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，長(zhǎng)度約為21～23 nt，能夠與靶mRNA的3′UTR堿基配對(duì)[15]。miR-21在血管細(xì)胞中有豐富表達(dá)，并且在修復(fù)損傷血管中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)新生內(nèi)膜的形成[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，TNF-α對(duì)HUVEC進(jìn)行造模后，模型組miR-21及MMP-9高表達(dá)，說明TNF-α造成細(xì)胞損傷，刺激細(xì)胞合成和分泌MMP-9；不同劑量的蘇子油干預(yù)后，miR-21的表達(dá)隨劑量增大逐漸減弱，而MMP-9基因的表達(dá)也隨劑量增大逐漸減弱，推測(cè)蘇子油通過抑制miR-21表達(dá)，降低MMP-9表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。進(jìn)一步對(duì)miR-21與MMP-9是否存在靶向關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)miR-21模擬物轉(zhuǎn)染后，模擬組MMP-9蛋白的表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著增高。miR-21與MMP-9 mRNA 3′UTR區(qū)通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示MMP-9 mRNA 3′UTR區(qū)與miR-21存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。

如上所示，蘇子油干預(yù)后，miR-21及MMP-9的表達(dá)顯著降低，與轉(zhuǎn)染結(jié)果一致，說明蘇子油通過干預(yù)miR-21靶向調(diào)控MMP-9的表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

[1] 周文陽. 三七皂苷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MMP-活性、巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及血小板凝集抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué), 2012.

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(編輯 卓選鵬)

Mechanism of Perilla oil’s intervention in vascular endothelial cell miR-21 targeted regulation of MMP-9

HUANG Xuan-bin, CHEN Jin-shui, WU Tian-min, CHEN Jin-xiong

(Department of Traditional Chinese Medicine, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China)

Objective To explore the intervention of different concentrations of Perilla oil in miR-21 and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) expressions of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) to provide the basis for Perilla oil’s improvement of atherosclerosis. MethodsInvitroumbilical vein endothelial cells were induced by TNF-α, and then divided into blank group, model group as well as Perilla oil high-, medium- and low-dose groups. A value was detected by MMT method, and gene levels of cell miR-21 and MMP-9 were detected by PT-PCR. Liposome transfection method was used to put the miR-21 analog into HUVEC cells; the expression of MMP-9 protein after transfection was detected by Western blot. Results Perilla oil of three doses could obviously improve HUVEC injury induced by TNF-α, and Perilla oil’s protection of endothelial cells was dose-dependent. miR-21 and MMP-9 gene expressions detected by RT-PCR showed that both of them were higher in model group. After Perilla oil intervention, the expression of miR-21 and MMP-9 gene gradually decreased with the dose of Perilla oil, both of which differed significantly from those in model group (P<0.05). After cell transfection of miR-21, the expression MMP-9 protein was significantly increased. MiR-21 and MMP-9 mRNA 3’UTR region detected by bioinformatics software could predict target binding site. Conclusion Perilla oil can protect vascular endothelial cells by intervening in miR-21’s regulation of MMP-9 expression, thus having anti-atherosclerosis effect.

Perilla oil; miR-21; MMP-9; targeted control; anti-atherosclerosis

2015-05-07

2015-07-20

福建省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(No.wzzy201316) Supported by the Science and Technology Project of Fujian Province (No.wzzy201316)

黃楦檳. E-mail: hxb2138@sina.com

R543.5

A

10.7652/jdyxb201601024

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1719.024.html(2015-12-09)