劉 平，盧 寧，蘇 慧，李林麗，宋健文，楊榮麗，劉鈺澤

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710004；2.河北省保定市第一醫(yī)院皮膚科，河北保定 071000；3.西安市兒童醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710003)

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先天性厚甲癥2型一家系的基因突變研究

劉 平1，盧 寧2，蘇 慧1，李林麗1，宋健文3，楊榮麗1，劉鈺澤1

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710004；2.河北省保定市第一醫(yī)院皮膚科，河北保定 071000；3.西安市兒童醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710003)

目的 研究先天性厚甲癥的基因突變，從而探討基因型與表現(xiàn)型之間的關(guān)系。方法 提取1個先天性厚甲癥家系中先證者及其家人的外周血基因組DNA，用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，產(chǎn)物測序檢測。取先證者母親的皮損做組織病理檢查，觀察皮損組織的角蛋白17的表達(dá)。結(jié)果 家系中兩患者的角蛋白17的1號外顯子第275位堿基發(fā)生A→G的雜合突變，其突變導(dǎo)致其編碼角蛋白17的第92位氨基酸的密碼子發(fā)生改變，使其編碼的氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸(N92S)。先證者母親皮損組織病理檢查為多發(fā)性脂囊瘤，免疫組化顯示角蛋白17 陽性表達(dá)。結(jié)論 驗證了角蛋白17的1號外顯子α螺旋1A區(qū)突變在先天性厚甲癥發(fā)病機(jī)制中的重要作用。角蛋白17 1A區(qū)突變對脂囊瘤的早發(fā)可能存在一定影響，基因型與表型存在一定關(guān)聯(lián)。

角蛋白；基因突變；角蛋白17；先天性厚甲癥；早發(fā)性多發(fā)性脂囊瘤；基因型；表現(xiàn)型

先天性厚甲癥(pachyonychia congenita, PC)是一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，其主要特征為甲營養(yǎng)不良、甲肥厚和其他外胚葉發(fā)育不良的表現(xiàn)，臨床表現(xiàn)主要分為兩型，即PC-1、PC-2[1-2]。本研究收集了來自陜西省神木縣1個PC-2型的家系，進(jìn)行基因測序，分析基因型與表型間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 家系臨床資料

先癥者，女，1歲6個月，父母非近親結(jié)婚，順產(chǎn)第二胎，出生時體質(zhì)量4 kg。出生時在下牙槽部位即有2顆牙齒，外陰散在米粒大小皮色丘疹。出生40 d后，指甲趾甲開始變黃，隨著年齡增長逐漸增厚。手掌及足跖部位多汗，聲音容易嘶啞。

皮膚科檢查：面部散在數(shù)個針尖至米粒大小白色丘疹，外陰可見數(shù)十個綠豆大小皮色結(jié)節(jié)，部分皮損變紅可擠出白色奶酪狀物質(zhì)；指甲微黃輕度增厚，趾甲棕黃色，顯著肥厚，游離緣較重。前額發(fā)跡處以及顳部頭發(fā)稀少，眉毛未見異常。掌跖部位未見角化過度和水皰?？谇晃匆婐つぐ装撸瑹o口角干裂。未見毛囊角化。根據(jù)患者的甲損害進(jìn)行真菌鏡檢及培養(yǎng)以排除甲真菌病。

其母親有類似癥狀。出生時即有牙齒，出生后不久軀干即有米粒大小皮色丘疹。指趾甲逐漸增厚，有時足底起水皰，行走時自覺疼痛。皮膚科檢查：指趾甲明顯增厚呈黑褐色，部分呈現(xiàn)楔形，游離緣向上翹起；掌跖可見明顯角化過度；頸部前胸腋下可見數(shù)百個直徑0.3 mm～1.5 cm大小的皮色丘疹結(jié)節(jié)，腋下可見暗紅色隆起瘢痕和竇道；眉毛稀疏，頭發(fā)未見異常?？谇晃匆婐つぐ装撸匆娒医腔?。家系圖(圖1)和臨床照片(圖2)如下。

圖1 PC-2患者家系圖

圖2 先證者(A、B、C)及母親(D)的臨床表現(xiàn)

Fig.2 Clinical features of the proband (A, B, C) and her mother (D)
A：先證者外陰皮損：B：先證者甲損害；C：先證者胎生牙；D：先證者母親脂囊瘤。

1.2 外周血基因組DNA提取

分別抽取家系成員中2例患者(先證者及先證者母親)、1例正常人(先證者母親的妹妹)及與該家系無關(guān)的100例正常人的外周血各3 mL，EDTA抗凝、-20 ℃冷凍保存。采用血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA。試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR

根據(jù)引物設(shè)計原則(Primer 5.0)及文獻(xiàn)[3]報道，設(shè)計并合成角蛋白17(KRT17)的8個外顯子引物并預(yù)計引物產(chǎn)物大小(表1)。應(yīng)用合成引物分別對家系中先證者、先證者母親、先證者母親的妹妹及與家系無關(guān)的正常人的角蛋白17基因各個外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中包括：100 ng DNA模板5 μL，上下游引物(上海生物工程公司合成)各2 μL，PCRTaqMasterMix 25 μL(北京天根生化科技有限公司)，雙蒸去離子水16 μL。PCR反應(yīng)在PCR儀(2720Thermal Cycler AB Appllied Biosystems)上進(jìn)行，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1.5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共32個循環(huán)，最后72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 KRT17的引物序列

Tab.1 Primer and sequence of KRT17

基因名稱引物序列(5'～3')Tm(℃)產(chǎn)物大小(bp)Exon1Primer_FGAGGAGCAAGCCTGTTGTAATC60.3Primer_RTCTTTGTTCCTGACTCAGCTTG59.7781Exon2Primer_FCCCTCCTCTGCCAATAATACAG60.0Primer_RTCCCCTCCTTCTCTTCTATTCC60.0443Exon3Primer_FCCCTTCCAACTCCTTAGAGTCC60.5Primer_RCCTTTGTTCTCCCTCTGCTCTA60.0762Exon4Primer_FAGAGGCTCCCTCTACCTACCC60.1Primer_RTCAGCTCCATGTCTGTTGATG59.8690Exon5-6-7Primer_FCCACAGTTAGATTTGGGAGGAG60.0Primer_RAATGAGTCACTTCTCCCTGCTG60.8770Exon8Primer_FGGACACACTGGATCAGAATCAA60.0Primer_RTTCCAAACTCTCCCCAGACTTA60.1677

1.4 基因序列測定及序列對比

以純化PCR產(chǎn)物制備測序模板，送至上海生物工程公司進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果用chromas及DANMAN軟件與NCBI網(wǎng)站公布的KRT17的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對比，用于篩查是否存在突變位點(diǎn)。

1.5 皮損組織的組織病理和免疫組織化學(xué)染色

在局麻下手術(shù)切取患者(先證者母親)頸部皮損組織作為檢查標(biāo)本，制作常規(guī)組織切片。在顯微鏡下觀察組織病理改變。用即用型UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒(鼠/兔)(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，鼠抗人細(xì)胞KRT17免疫組化單克隆抗體(即用型，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，進(jìn)行免疫組化實驗，具體實驗步驟參考試劑盒說明書。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增測序結(jié)果

該家系中2名患者KRT17外顯子1第275位堿基均出現(xiàn)了A→G的雜合突變，家系中的正常人及100例對照組中正常人均無此基因突變(圖3、圖4)。同時，此基因突變進(jìn)一步引起編碼KRT17的第92位氨基酸的密碼子發(fā)生改變，使其編碼的氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸(N92S，圖5)。

2.2 皮損組織的病理觀察結(jié)果

在光鏡下觀察可見先證者母親的皮損組織真皮內(nèi)薄的不含顆粒層的復(fù)層上皮包被著空的囊腔，囊壁為數(shù)層鱗狀上皮組成，呈現(xiàn)厚薄不一、折疊，且囊壁內(nèi)面有一層嗜伊紅均質(zhì)化角質(zhì)層，無顆粒層，囊內(nèi)有皮脂，提示為脂囊瘤(圖6)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

通常情況下KRT17在表皮各層中均無表達(dá)，其主要分布在毛囊、汗腺等組織。而本研究顯示，KRT17在先證者母親的皮損囊壁的復(fù)層上皮細(xì)胞表達(dá)，KRT17在囊壁上皮細(xì)胞胞質(zhì)中顯著表達(dá)，DAB顯色呈現(xiàn)為棕黃色顆粒，彌漫性分布于細(xì)胞胞質(zhì)中(圖7)。

3 討 論

先天性厚甲癥是一種罕見的常染色體顯性遺傳病。目前研究已證實5種角蛋白基因突變與此疾病有關(guān)，角蛋白K16及其成對表達(dá)的K6a基因突變導(dǎo)致PC-1型；KRT17及其成對表達(dá)的K6b基因突變導(dǎo)致PC-2型，K6c基因突變臨床病例報道很少[1-2]。

圖3 患者KRT17外顯子1第275位堿基A→G(箭頭處)

Fig.3 A heterozygous A to G transition at nucleotide position 275 of exon 1 of KRT17 (arrow indicated)

圖4 正常對照KRT17外顯子1第275位堿基(箭頭處)DNA序列

Fig.4 DNA sequence of nucleotide position 275 of exon 1 of KRT17 in control group

圖5 KRT17第92位密碼子核苷酸的替換，導(dǎo)致編碼的氨基酸由天冬酰胺N變?yōu)榻z氨酸S

Fig.5 This nucleotide substitution of codon 92 in KRT17 resulted in change of asparagine into serine (N92S)

圖6 先證者母親皮損組織病理

Fig.6 Histopathology of the skin lesion of the patient’s mother (HE, ×40)

圖7 KRT17在先證者母親皮損組織囊壁的表達(dá)

Fig.7 Expression of KRT17 on the cyst wall of the skin lesion of the patient’s mother (SP, ×40)

PC-1(OMIM 167200)患者的臨床表現(xiàn)為所有指(趾)甲增厚，掌跖角化過度，在摩擦部位和四肢末端容易發(fā)生皮膚毛囊角化，伴手足部位多汗，口腔黏膜可見白色角化性斑塊。PC-2(OMIM 167210)除具有Ⅰ型的特征外，還具有胎生牙、毛發(fā)異常、多發(fā)性脂囊瘤、聲音嘶啞及炎癥后遺留瘢痕等特點(diǎn)[4]。研究者基于一些臨床癥狀重疊的病例，提出了一種根據(jù)角蛋白突變類型命名的分類[5]。

本例先天性厚甲癥2型的家系中，患者KRT17的1號外顯子c.275A>G，從而導(dǎo)致該家系中患者的第92位密碼子AAT變?yōu)锳GT，導(dǎo)致編碼的氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸。患者皮損為多發(fā)性脂囊瘤，KRT17在脂囊瘤囊壁表達(dá)。本家系中患者脂囊瘤的發(fā)生時間較早，與文獻(xiàn)[6-11]報道一致的是發(fā)生早發(fā)性多發(fā)性脂囊瘤的突變均位于KRT17的1A區(qū)域，說明1A區(qū)的突變對脂囊瘤的早發(fā)可能有一定影響。

PC-1由角蛋白16和角蛋白6a突變引起[2,4,12]，PC-2由KRT17和角蛋白6b突變所致[2,4,13]。由于突變大都位于高度保守的螺旋區(qū)域，如果發(fā)生突變，可影響角蛋白絲的裝配，進(jìn)而影響細(xì)胞骨架的完整性，使皮膚脆性增加，導(dǎo)致相應(yīng)臨床表現(xiàn)。本例家系研究中的致病基因為KRT17，是46 ku 的Ⅰ型細(xì)胞角蛋白，正常情況下在毛囊、甲床、皮脂腺以及其他表皮附屬器中表達(dá)，正常表皮不表達(dá)[14]。在病理情況下伴隨著表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的生長分化異常，KRT17可有異常表達(dá)[15]。本研究免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者脂囊瘤囊壁上皮細(xì)胞表達(dá)KRT17，證實KRT17突變的顯性負(fù)效應(yīng)可能引起PC患者中脂囊瘤的發(fā)生[10]。

另外，KRT17對毛發(fā)、甲、牙齒、傷口愈合都有一定影響，這與家系中患者表現(xiàn)為甲肥厚、胎生牙、毛發(fā)稀疏、局部刺激后留有瘢痕等臨床特征高度一致，說明PC的基因型與表型存在一定關(guān)聯(lián)。

一般而言，脂囊瘤的發(fā)生受雄激素樣作用的影響，多在青春期后發(fā)生。通過對KRT17基因突變檢測，已證實突變位點(diǎn)N92S為突變熱點(diǎn)區(qū)域[4,16-17]。在本研究中，該家系患者脂囊瘤的發(fā)生均早，表現(xiàn)為出生時即有或出生后不久發(fā)生，即都在青春期前發(fā)生。結(jié)合近10年來文獻(xiàn)報道的早發(fā)性多發(fā)性脂囊瘤伴有甲損害的家系情況(表2)，分析發(fā)現(xiàn)盡管PC-2型伴早發(fā)性多發(fā)性脂囊瘤的KRT17的突變位點(diǎn)不盡相同，但所有的突變均位于1A區(qū)，N92S多見，且皮損多位于頭面部[7-11]。發(fā)生年齡都在青春期之前。這說明角蛋白1A區(qū)的變化對脂囊瘤的早發(fā)可能存在一定影響，但不是導(dǎo)致脂囊瘤早發(fā)的決定因素。

分析所報道的病例，大部分早發(fā)性多發(fā)性脂囊瘤的患者屬于亞洲地區(qū)，提示地域環(huán)境對脂囊瘤的發(fā)生有一定影響。但是，由于所研究的病例較少，不足以得出可靠確切的結(jié)論，需要更多的資料來進(jìn)一步分析之間的關(guān)系及影響因素。

表2 KRT17基因突變位點(diǎn)與脂囊瘤出現(xiàn)的關(guān)系

Tab.2 Relationship between keratin 17 domain mutation and early onset of steatocystoma multiplex

KRT17的突變位點(diǎn)脂囊瘤發(fā)生年齡、部位有無甲損害及其他國家地區(qū)V102M5歲頭皮、腋下出生后2月甲變厚,扭曲發(fā)日本[6]N92S1歲頭面部、頸部15歲甲變厚,掌跖角化過度中國[7]M88T1歲面頰甲肥厚,角化性丘疹,哈欽森樣齒韓國[8]N92S出生時面部10歲甲變厚英國[9]L99P3歲面部甲畸形,足跖角化過度,角化性丘疹日本[10]N92S出生時頭面部1歲時甲變厚,胎生牙,聲音嘶啞足跖角化過度,手足多汗土耳其[11]N92S出生時面部、外陰出生后2月甲變厚,胎生牙中國本文

總之，先天性厚甲的臨床表現(xiàn)比較復(fù)雜，且容易與其他疾病混淆，而且臨床表現(xiàn)中足跖角化過度嚴(yán)重影響患者的身心健康。因此，有必要對患者進(jìn)行基因檢測，觀察是否存在角蛋白基因突變，以便對有家族史的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，提供可靠的遺傳咨詢，尋求新的治療方法。例如，最新GOLDBERG 等[18]研究辛伐他汀及其他他汀類藥物能夠抑制k6a啟動子活性及k6a蛋白的表達(dá)，這種抑制PC突變角蛋白基因的表達(dá)可成為一種新治療手段。但任何一種治療方法包括藥物、物理及外科手術(shù)治療，不是對每個人都有效的，還期待一些更有效更針對性的治療[19]。

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(編輯 國 榮)

Gene mutation of pachyonychia congenita II: A family case analysis

LIU Ping1, LU Ning2, SU Hui1, LI Lin-li1,SONG Jian-wen3, YANG Rong-li1, LIU Yu-ze1

(1.Department of Dermatology,th Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004;2.Department of Dermatology, Baoding No.1 Hospital, Baoding 071000;3.Department of Dermatology,Xi'an Children's Hospital,Xi'an 710003,China)

Objective To explore the relationship between the genotype and the clinical phenotypes through investigating gene mutation in pachyonychia congenital (PC). Methods Genomic DNA of the proband and her family members (including the affected and normal) with blood relationship were extracted with a peripheral blood genomic DNA extraction kit, and using polymerase chain reaction (PCR)-mediated amplification of 1 exon of keratin 17 gene. Direct sequencing of all PCR products was performed to detect the mutation. Skin biopsy was taken from the proband’s mother of PC processed for histopathologic examination eosinophilic staining of the hematoxylin, and immunohistochemistry staining to observe the expression of keratin 17. Results (1) PCR amplification products were sequenced. Results disclosed a heterozygous A to G transition at nucleotide position 275 of exon 1 of keratin 17 in the affected members of PC. This nucleotide substitution caused change of codon 92 from asparagine into serine (N92S) in the 1A domain of keratin 17. (2) The results of skin biopsy of the proband’s mother showed steatocystoma multiplex and immunohistochemical staining showed positive expression of keratin 17. Conclusion Our study validated the important role of keratin 17 1A domain mutation in the pathogenesis of PC. Keratin 17 1A domain mutation seems to have a certain influence on the early occurrence of steatocystoma. There is a correlation between genotype and phenotype of Keratin 17 1A domain mutation.

keratin; gene mutation; keratin 17; pachyonychia congenita; early onset steatocystoma multiplex; genotype; clinical phenotype

2015-04-26

2015-07-21

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30600764)，西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院院基金[YJ(ZD)201307] Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30600764) and Research Fund of the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University [No.YJ(ZD)201307]

劉平. E-mail: medlp@163.com

R758.5

A

10.7652/jdyxb201601023

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151208.1751.016.html(2015-12-08)