晁佩佩，盛慧萍，石文波，楊 巖，程玉娥，劉瑪瀟，翟 雪

(1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染疾病科，寧夏銀川 750004；3. 湖北省恩施州中心醫(yī)院腫瘤Ⅱ科，湖北恩施 445000)

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慢性乙型肝炎患者外周血CD4CD25CD127調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)及其與肝組織病理、HBV-cccDNA的關(guān)系

晁佩佩1，盛慧萍2，石文波3，楊 巖2，程玉娥1，劉瑪瀟1，翟 雪1

(1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染疾病科，寧夏銀川 750004；3. 湖北省恩施州中心醫(yī)院腫瘤Ⅱ科，湖北恩施 445000)

目的 探討慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與肝組織HBV-cccDNA及HBV-DNA載量、血清HBV-DNA載量、肝臟病理及肝功能的相關(guān)性。方法 采用流式細(xì)胞儀檢測30例CHB及30例健康體檢者外周血CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分率；并對其中22例患者行肝組織活檢，采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測CHB患者肝組織HBV-cccDNA、HBV-DNA載量；肝組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、Masson染色、網(wǎng)染、VG染色，行炎癥(G)分級及纖維化(S)分期；同期檢測肝功能ALT水平，并對各檢測值進(jìn)行比較和相關(guān)性分析。結(jié)果 CHB患者外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞的百分率為(9.27±2.07)%，明顯高于健康對照組(4.96±0.97)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CHB患者外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞與血清HBV DNA(lgIU/mL)載量呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.38,P<0.05)；與肝組織HBV-cccDNA及HBV-DNA(lgcps/mg)均無明顯相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)r分別為0.162、0.306，兩者均P>0.05)；與肝組織炎癥級別及纖維化分期均無明顯相關(guān)性(Spearman秩相關(guān)系數(shù)r分別為0.056、-0.047，兩者均為P>0.05)；與ALT亦無明顯相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.044，P>0.05)。結(jié)論 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞水平明顯升高且與血清HBV-DNA載量呈正相關(guān)，提示Treg細(xì)胞在慢性乙型肝炎中發(fā)揮著重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，可能是導(dǎo)致病毒復(fù)制持續(xù)存在的重要因素。

慢性乙型肝炎；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)；HBV-DNA；HBV-cccDNA；肝臟病理

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的免疫相關(guān)性疾病，是當(dāng)今危害人類健康的常見傳染病之一。機(jī)體感染HBV后是否發(fā)病、病情的嚴(yán)重程度及轉(zhuǎn)歸主要與宿主的免疫應(yīng)答有關(guān)[1]，其機(jī)制至今尚未完全明了，但已經(jīng)公認(rèn)的是CHB的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞免疫密切相關(guān)[2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)是一種特殊的CD4+T細(xì)胞亞群，因其獨(dú)特的免疫低反應(yīng)和負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能而稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[3]。近年來，Treg細(xì)胞在HBV慢性感染中的作用受到廣泛關(guān)注，但研究結(jié)果尚不一致。本研究旨在通過檢測CHB外周血CD4+CD25+CD127low/-T細(xì)胞頻率、肝組織HBV-cccDNA、HBV-DNA，血清HBV-DNA、ALT、肝組織炎癥及纖維化分期，分析各指標(biāo)間的相關(guān)性，初步探討外周血Treg細(xì)胞在CHB發(fā)生發(fā)展過程中的意義，為CHB的發(fā)病機(jī)制及臨床治療等研究提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2010年9月至2013年9月在我院感染科門診及住院未經(jīng)治療的HBeAg陽性的CHB患者30例，其中男性患者20例，女性患者10例，年齡17～47歲，中位年齡為30歲。所有患者診斷均符合中國2010年修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[4]。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、人類皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒等病毒感染，排除急性肝炎、肝癌、酒精性、藥物性及自身免疫性疾病等所致肝損害，排除精神心理疾病及心、肺、腎等嚴(yán)重功能障礙患者。另選取同期健康對照組30例，均無肝炎病史，肝炎病原學(xué)血清標(biāo)志物檢測均陰性，肝功能均正常。

1.2 研究方法

1.2.1 血清樣本采集 所有患者及對照組均于清晨空腹分別抽取外周血10 mL，送至我院檢驗(yàn)科進(jìn)行肝功能(ALT)、血清HBV-M、HBV-DNA等檢測；同時取患者及對照組外周血4 mL用枸櫞酸鈉抗凝管保存，4 h內(nèi)檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

1.2.2 肝穿刺活檢 對實(shí)驗(yàn)組中的22例患者行肝穿刺活檢。穿刺前告知手術(shù)可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)及并發(fā)癥，并取得本人、家屬及倫理委員會同意。在B超引導(dǎo)下，用美國巴德活檢槍快速穿刺抽取長15～20 mm肝組織1～2條，一條放入EP管中，快速放置于-80 ℃冰箱保存用于肝組織HBV-DNA及HBV-cccDNA檢測；另一條放入100 mL/L甲醛溶液中固定后送我院病理科進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、Masson染色、網(wǎng)染、VG染色，制作好的病理切片最終由西京醫(yī)院病理科專家進(jìn)行肝臟炎癥活動度(G)及纖維化程度分級(S)評價。

1.2.3 外周血CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測 取空腹采集的新鮮抗凝血100 μL于消毒的2 mL EP中，均依次加入20 μL FITC標(biāo)記鼠抗人CD4單抗、20 μL PE標(biāo)記鼠抗人CD25單抗、5 μL PerCP-Cy5.5標(biāo)記鼠抗人CD127單抗，震蕩混勻，25 ℃避光孵育20 min，加入溶血素2 mL，震蕩混勻，避光放置10 min，2 000 r/min，離心5 min，棄上清。2 mL PBS洗滌1次后，加入40 g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液0.5 mL固定，制成單細(xì)胞懸液2 h內(nèi)待測。每次實(shí)驗(yàn)均有1個正常人做對照。FACSCalibur型流式細(xì)胞儀檢測以CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞設(shè)門作鑒定，以CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)占CD4+T細(xì)胞數(shù)百分比作為CD4+CD25+CD127low/-Treg計(jì)數(shù)，并保存數(shù)據(jù)。

1.2.4 肝組織HBV-cccDNA、HBV-DNA載量的測定 采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測肝組織HBV-DNA及HBV-cccDNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 外周血CD4CD25CD127Treg的頻率

1例健康對照者和1例CHB患者外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞結(jié)果顯示見圖1，頻率分別為3.56%、13.5%。與健康對照組(n=30)相比，CHB組(n=30)外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞表達(dá)明顯升高，分別為(4.96±0.97)%、(9.27±2.07)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。

圖1 外周血CD4+淋巴細(xì)胞群中CD4+CD25+CD127lowT細(xì)胞比例散點(diǎn)圖

Fig.1 Scatter diagram of the rate of CD4+CD25+CD127low/-T cells in the peripheral blood CD4+lymphocytes
A：健康對照組；B：CHB患者。

2.2 CD4CD25CD127Treg細(xì)胞與血清HBV-DNA、肝組織HBV-cccDNA及HBV-DNA載量的關(guān)系

CHB患者血清HBV-DNA載量為(6.48±0.99)(lgIU/mL)，肝組織HBV-DNA及HBV-cccDNA載量分別為(7.12±0.96)、(5.39±1.16)(lgcps/mg)。Pearson直線相關(guān)分析顯示，CHB患者外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞與血清HBV-DNA(lgIU/mL)載量呈正相關(guān)(r=0.38，P<0.05)；與肝組織HBV DNA及HBV cccDNA(lg cps/mg)均無明顯相關(guān)性(r分別為0.31、0.16，兩者均為P>0.05)，見圖2～4。

圖2 CD4+CD25+CD127low/-Treg與外周血HBV DNA(lgIU/mL)關(guān)系散點(diǎn)圖

Fig.2 Scatter diagram of the relationship between CD4+CD25+CD127low/-T cells and plasma HBV DNA (lgIU/mL) in CHB

圖3 CD4+CD25+CD127low/-Treg與肝組織HBV DNA(lgcps/mg)關(guān)系散點(diǎn)圖

Fig.3 Scatter diagram of the relationship between CD4+CD25+CD127low/-T cells and intrahepatic HBV DNA (lgcps/mg) in CHB

2.3 CD4CD25CD127Treg細(xì)胞與肝組織炎癥及纖維化分期的關(guān)系

Spearman秩相關(guān)分析顯示，CHB患者外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞與肝組織炎癥級別(G)及纖維化(S)分期均無明顯相關(guān)性(秩相關(guān)系數(shù)r分別為0.056、-0.047，兩者均為P>0.05)。

2.4 CD4CD25CD127Treg細(xì)胞與ALT的關(guān)系

Pearson直線相關(guān)分析顯示，CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞與ALT無明顯相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.044，P>0.05)，見圖5。

圖4 CD4+CD25+CD127low/-Treg與肝組織HBV-cccDNA(lgcps/mg)關(guān)系散點(diǎn)圖

Fig.4 Scatter diagram of the relationship between CD4+CD25+CD127low/-T cells and intrahepatic HBV-cccDNA (lgcps/mg) in CHB

圖5 CD4+CD25+CD127low/-Treg與外周血ALT(U/L)關(guān)系散點(diǎn)圖

Fig.5 Scatter diagram of the relationship between CD4+CD25+CD127low/-T cells and peripheral blood ALT (U/L) in CHB

3 討 論

HBV感染的慢性化問題一直以來是乙型肝炎防治的一個熱點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為機(jī)體對HBV感染的免疫耐受是其慢性化最主要的原因之一[5]。雖然國內(nèi)外學(xué)者從不同方面對機(jī)體免疫耐受的機(jī)制進(jìn)行了研究，但至今仍未明確。目前比較公認(rèn)的是在CHB的免疫發(fā)病機(jī)制中，細(xì)胞免疫反應(yīng)占著很重要的作用[2]。 Treg細(xì)胞是近年來研究較多的一種新型免疫細(xì)胞亞群，它主要來源于胸腺，亦可以在外周誘導(dǎo)產(chǎn)生。研究表明，Treg細(xì)胞具有獨(dú)特的免疫低反應(yīng)性及負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能，在誘導(dǎo)自身免疫耐受、維持機(jī)體免疫平衡中起著重要作用[6]。Treg細(xì)胞的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能主要是指它能夠限制免疫御防中效應(yīng)性T細(xì)胞或B細(xì)胞，如CD4+、CD8+T細(xì)胞的過度活化、增殖，避免正常組織損傷。其作用機(jī)制主要通過細(xì)胞與細(xì)胞間的直接接觸和分泌一些抑制性細(xì)胞因子如IL-10、IL-4、TGF-β等發(fā)揮其抑制免疫炎性反應(yīng)的作用[7-8]。免疫低反應(yīng)性是指Treg細(xì)胞對低濃度抗原及抗原提呈細(xì)胞的刺激呈低反應(yīng)狀態(tài)，而在高濃度的抗原刺激下，可使其活化增殖。Treg細(xì)胞是一種高表達(dá)CD25與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3為特征的CD4+T細(xì)胞群，其中FoxP3是目前國際公認(rèn)的Treg細(xì)胞最特異性的表面標(biāo)志物[9]，是Treg細(xì)胞分化、發(fā)育和發(fā)揮功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，但是FoxP3屬于胞內(nèi)蛋白，需要對細(xì)胞進(jìn)行固定及穿孔后才能鑒定，因此不能用來對活的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞純化以及細(xì)胞的后續(xù)研究，而且MORGAN等[10]發(fā)現(xiàn)人類FoxP3 mRNA不僅在CD25+T細(xì)胞上表達(dá),CD25-T細(xì)胞活化后也可短暫表達(dá)，可見并不是所有FoxP3陽性的細(xì)胞都是調(diào)節(jié)性細(xì)胞。最新研究表明，CD4+CD25+純化的細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)與CD127低表達(dá)呈正相關(guān)，CD4+CD25+CD127low/-三標(biāo)記法可以幫助識別CD4+CD25+Treg和部分激活的CD4+T細(xì)胞，提高CD4+CD25+Treg細(xì)胞的可檢出數(shù)量，并且不影響細(xì)胞活性度，是反應(yīng)CD4+CD25+Treg細(xì)胞更理想的指標(biāo)[11]。本研究采用新的表面標(biāo)志物CD127low/-來研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，能更明確的判定該群體細(xì)胞。

目前，有關(guān)外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞在CHB患者的免疫發(fā)病機(jī)制方面的研究，國內(nèi)外已取得一定的成果，但研究結(jié)果尚不一致?，F(xiàn)在多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CHB患者外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞與血清病毒載量呈正相關(guān)[12-13]，也有少數(shù)學(xué)者研究得出結(jié)論與之相反[14]。本研究結(jié)果顯示，CHB患者外周血Treg細(xì)胞比例明顯高于健康對照組，且與血清HBV-DNA載量呈正相關(guān)，與多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致，提示HBV感染后升高的CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞促進(jìn)了HBV病毒復(fù)制，可能與其抑制了HBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)的活化增殖及其細(xì)胞因子的分泌有關(guān)，從而影響了機(jī)體抗感染免疫應(yīng)答，導(dǎo)致病毒的持續(xù)感染。我們研究還發(fā)現(xiàn)外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞與肝組織HBV-DNA及HBV-cccDNA間無明顯的相關(guān)性，分析可能的原因是CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞屬于免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要分布在外周血，而肝組織HBV-DNA及HBV-cccDNA均在肝細(xì)胞核內(nèi)，Treg細(xì)胞對細(xì)胞核內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用較弱所致。本研究還顯示CHB患者外周血Treg細(xì)胞比例與血清ALT水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性，與多數(shù)學(xué)者觀點(diǎn)一致[15]。ALT主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在肝細(xì)胞膜受損傷或細(xì)胞溶解壞死時釋放入血。ALT是判斷肝臟炎癥的血清指標(biāo)，提示CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞可能只是參與了免疫耐受，利于HBV的持續(xù)感染，在參與肝臟組織免疫損傷作用中較弱。鑒于肝臟組織病理學(xué)檢查才是直觀、準(zhǔn)確反映肝臟病變程度的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究對22例CHB患者進(jìn)行肝穿刺病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞與肝組織炎癥級別及纖維化分期亦無明顯相關(guān)性，而鄭盛[16]研究發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染者外周CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞水平與肝組織炎癥活動度分級和纖維化分期均呈負(fù)相關(guān)，這可能與病例的選擇和樣本含量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)僅選取了HBeAg陽性的患者，與HbeAg陰性患者的免疫狀態(tài)不同，可能是造成不同結(jié)果的原因，值得我們選取不同免疫狀態(tài)的CHB患者做進(jìn)一步研究。

綜上所述，CHB患者CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞明顯升高，且與血清HBV-DNA的復(fù)制具有較高的一致性，有望成為反映細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的參考指標(biāo)，而且有助于監(jiān)測病毒清除、病毒復(fù)制?；蛟S我們可以通過降低Treg細(xì)胞數(shù)量或抑制其功能，來增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,降低HBV病毒復(fù)制,這將為今后CHB的治療提供新的思路。

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(編輯 韓維棟)

Association of expression of peripheral CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells with liver pathology and HBV-cccDNA in patients with chronic hepatitis B

CHAO Pei-pei1, SHENG Hui-ping2, SHI Wen-bo3,YANG Yan2, CHENG Yu-e1, LIU Ma-xiao1, ZHAI Xue1

(1. Ningxia Medical University, Yinchuan 750004; 2. Department of Infectious Diseases,the Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004; 3. Department Ⅱ of Oncology, Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture, Enshi 445000, China)

Objective To investigate the expression level of CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B (CHB) and its association with liver HBV-cccDNA and HBV-DNA, HBV-DNA of the peripheral blood, liver pathology and liver function. Methods We enrolled 30 CHB patients and 30 healthy controls. The percentage of peripheral blood CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells in CD4+T cells were detected by flow cytometry. And 22 patients underwent liver biopsy; the quantities of intrahepatic HBV cccDNA and HBV DNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The liver tissue was dyed with HE dyeing, Masson dyeing, Nets dyeing and VG dyeing. Inflammatory grading and fibrosis staging were performed. The level of alanine aminotransferase (ALT) was collected simultaneously. Results The frequency of the peripheral blood CD4+CD25+CD127low/-Treg in CHB was (9.27±2.07)%, which was significantly higher than that in healthy controls [(4.96±0.97)%,P<0.05]. The peripheral blood CD4+CD25+CD127low/-Treg in CHB was positively correlated with the plasma HBV DNA (lgIU/mL) (r=0.38,P<0.05), and there was no significant correlation with the level of liver inflammation or fibrosis stage (r=0.056, -0.047 respectively, bothP>0.05). Also there were no significant correlation with ALT (r=0.044,P>0.05). Conclusion The expression of CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells in the peripheral blood of CHB patients increased significantly, which suggested that Tregs plays a negative role in immune regulation of CHB and may be an important factor of the persistence of viral replication.

chronic hepatitis B; regulatory T-lymphocyte; flow cytometry; HBV-DNA; HBV-cccDNA; hepatic pathohistology

2015-03-27

2015-08-10

寧夏回族自治區(qū)科技攻關(guān)項(xiàng)目[No.(2011)25] Supported by the Science and Technology Key Project of Ningxia Hui Autonomous Region [No.(2011)25]

楊巖. E-mail: yangyan6660@163.com；盛慧萍與晁佩佩為共同第一作者。

R512.6

A

10.7652/jdyxb201601017

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1624.012.html(2015-12-09)