馬會(huì)明，張永芳，王蒙蒙，李 昕，王永峰，田洪成，裴秀英，王燕蓉

(寧夏醫(yī)科大學(xué)/生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心/人體解剖與組織胚胎學(xué)系，寧夏銀川 750004)

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α-硫辛酸對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡的影響

馬會(huì)明，張永芳，王蒙蒙，李 昕，王永峰，田洪成，裴秀英，王燕蓉

(寧夏醫(yī)科大學(xué)/生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心/人體解剖與組織胚胎學(xué)系，寧夏銀川 750004)

目的 探討α-硫辛酸對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中抗氧化水平和抗凋亡水平的影響。方法 收集經(jīng)PMSG處理的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞，經(jīng)原代培養(yǎng)24 h后，添加終濃度為100 μmol/L的α-硫辛酸繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測(cè)定氧化水平SOD、MDA和GSH-Px參數(shù)，評(píng)價(jià)抗氧化能力，采用Trizol法提取各組細(xì)胞的RNA，進(jìn)行RT-PCR法檢測(cè)α-硫辛酸對(duì)caspase-3和caspase-9基因的表達(dá)情況的影響，同時(shí)利用細(xì)胞免疫熒光和ELISA法檢測(cè)caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)，并分析α-硫辛酸降低細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果 分離培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞α-硫辛酸添加后，SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量降低(P<0.05)；經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得長(zhǎng)度為180 bp的特異性caspase-3產(chǎn)物，獲得長(zhǎng)度為152 bp的特異性caspase-9產(chǎn)物，α-硫辛酸添加可顯著性降低caspase-3和caspase-9 mRNA的表達(dá)(P<0.05)；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示顆粒細(xì)胞caspase-3和caspase-9蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞胞質(zhì)，分別呈現(xiàn)綠色熒光和紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；ELISA結(jié)果顯示α-硫辛酸添加后caspase-3和caspase-9酶活性顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 小鼠顆粒細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加α-硫辛酸可明顯改變細(xì)胞抗氧化能力，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起到一定的保護(hù)作用。

α-硫辛酸；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；卵巢顆粒細(xì)胞；小鼠

α-硫辛酸(α-lipoic acid, α-LA)是一種類(lèi)似維他命的水溶性和脂溶性代謝天然的抗氧化物質(zhì)。它具有獨(dú)特雙硫鍵的抗氧化分子結(jié)構(gòu)，是強(qiáng)效的抗氧化劑，能保存和再生其他抗氧化劑[1]，α-LA與其還原產(chǎn)物二氫硫辛酸協(xié)同抑制自由基的損傷，降低氧化應(yīng)激，減少脂質(zhì)過(guò)氧化[2]，維持機(jī)體正常的抗氧化水平。有證據(jù)證明[3]，α-LA通過(guò)減少施旺細(xì)胞8-羥化脫氧鳥(niǎo)苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine, 8-OHdG)的形成和線(xiàn)粒體去極化，降低細(xì)胞的凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道[4]，α-LA可以抑制凋亡分子途徑的激活，有效地調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激所致凋亡事件的影響，從而停止活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基的活性，減少線(xiàn)粒體膜電位的損失，降低氧化應(yīng)激的發(fā)生，降低caspase-3和caspase-9的活性。張毅等[5]應(yīng)用不同濃度硫辛酸顯著降低神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高細(xì)胞抗氧化能力，提高細(xì)胞的生存率，延緩老化的進(jìn)程。鑒于目前文獻(xiàn)有關(guān)α-LA對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞抗氧化和抗凋亡的的保護(hù)作用機(jī)制的報(bào)道不多。本研究利用α-硫辛酸的強(qiáng)氧化劑的特性，通過(guò)抗氧化水平和細(xì)胞凋亡表達(dá)的檢測(cè)來(lái)研究α-硫辛酸對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制，探討α-硫辛酸對(duì)顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平和凋亡程度的抑制作用，為α-硫辛酸在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中降低氧化應(yīng)激、減少凋亡的發(fā)生提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

兔抗人caspase-3和caspase-9多克隆抗體購(gòu)自碧云天生物；β-actin兔單克隆抗體、羊抗兔二抗及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自博士德生物；蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒(批號(hào)：20100119)，丙二醛(malonaldehyde, MDA)試劑盒(批號(hào)：20100119)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒(批號(hào)：20100119)，均由南京建成生物工程研究所提供。Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒(20T)(批號(hào)：C1157)，caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(20T)(批號(hào)：C1115)，均由碧云天生物提供。

1.2 顆粒細(xì)胞的采集和體外培養(yǎng)

取18～22 g未成熟的雌性ICR小鼠(購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，每只腹部皮下注射PMSG 10 IU，36～48 h后頸椎脫臼法處死。在無(wú)菌條件下迅速剖取卵巢放入無(wú)菌的PBS中清洗，再置于含100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的TCM199-Hepes培養(yǎng)基中刺破卵巢使顆粒細(xì)胞釋放于培養(yǎng)基中，再離心、1 mg/mL透明質(zhì)酸酶消化，收集顆粒細(xì)胞單細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105cells/mL。將細(xì)胞懸液分裝在6孔培養(yǎng)板中在50 mL/L(體積分?jǐn)?shù))的CO2，37.5 ℃條件下于M199完全培養(yǎng)液(M199∶FBS=9∶1)中孵育24 h。貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基，并加入終濃度為100 μmol/L的α-硫辛酸(不加α-硫辛酸處理的細(xì)胞為對(duì)照組)處理細(xì)胞24 h，然后開(kāi)始進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理要求和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.3 顆粒細(xì)胞SOD、MDA和GSH-Px測(cè)定

α-硫辛酸處理細(xì)胞24 h后，按組別收取6孔板中的處理組細(xì)胞和正常對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心2 500 r/min 5 min后分離上清，按SOD、MDA和GSH-Px試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的SOD、MDA和GSH-Px含量。

1.4 顆粒細(xì)胞RNA提取及caspase-3和caspase-9 mRNA分析

采用Trizol一步抽提的常規(guī)方法提取RNA，濃度測(cè)定后進(jìn)行cDNA第一鏈的逆轉(zhuǎn)錄合成，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA和cDNA，再根據(jù)caspase-3引物序列(180 bp)：上游：5′-ATGGCTTGCCAGAAGATACC-3′；下游：5′-CCTGTTAACG-CGAGTGAGAA-3′；caspase-9引物序列(152 bp)：上游：5′-CAACTTGGACCGTGACAAAC-3′；下游：5′-ATGACCACCACAAAGCAGTC-3′；β-actin引物序列(133 bp)上游：5′-GGTCATCACTATTGGCAACG-3′；下游：5′-ACGGATGTCAACGTCACACT-3′進(jìn)行RT-PCR法caspase-3和caspase-9基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；56 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s；72 ℃ 10 min；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳條帶進(jìn)行掃描拍照分析。Real-time PCR檢測(cè)在ABI 7500 fast熒光定量PCR儀中進(jìn)行，caspase-3和caspase-9基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算，β-actin為內(nèi)參基因。

1.5 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)caspase-3和caspase-9的表達(dá)

α-硫辛酸處理細(xì)胞24 h后，按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法固定、漂洗、TritonX-100通透、封閉，按1∶300稀釋兔抗人caspase-3和caspase-9多克隆抗體，濕盒4 ℃孵育過(guò)夜，陰性對(duì)照用PBS代替一抗；PBS洗3次，每次5 min；取出培養(yǎng)板，加CY3和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200)熒光二抗室溫避光孵育1 h；PBS洗5次，每次5 min，再加入300～400 μL DAPI染核并抗熒光淬滅劑封固，熒光顯微鏡下觀(guān)察并避光拍照。

1.6 顆粒細(xì)胞caspase-3和caspase-9活性的檢測(cè)

α-硫辛酸處理細(xì)胞24 h后，去除試驗(yàn)組和空白對(duì)照組培養(yǎng)液， 用胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min 4 ℃離心5 min收集細(xì)胞，小心吸除上清，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬(wàn)細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。4 ℃ 14 000 r/min離心10～15 min。把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。取少量樣品用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達(dá)到3 mg/mL，相當(dāng)于每10 μL待測(cè)樣品中含有10～30 μg蛋白，以10 μL 2 mmol/L的Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-CHO分別被用作caspase-3和caspase-9的顯色底物，釋放的pNA和CHO立即用405 nm測(cè)定吸光度值確定caspase-3和caspase-9的酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 α-硫辛酸對(duì)SOD、MDA和GSH-Px的影響

與對(duì)照組培養(yǎng)細(xì)胞上清液比較，采用黃嘌呤氧化酶法于550 nm處對(duì)SOD活力的測(cè)定結(jié)果顯示，100 μmol/L的α-硫辛酸處理顆粒細(xì)胞SOD酶活性升高(P<0.05)；采用TBA法于532 nm處測(cè)定MDA含量的結(jié)果顯示，α-硫辛酸處理后細(xì)胞上清液中MDA含量降低(P<0.05)；根據(jù)酶促反應(yīng)中GSH的消耗速度來(lái)反映GSH-Px的活力的原理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α-硫辛酸處理后細(xì)胞上清液中GSH-Px活性升高(P<0.05，表1)。

表1 α-硫辛酸對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞SOD，MDA和GSH-Px活性的影響

組別SOD(U/mL)MDA(μmol/L)GSH-Px(μmol/L)對(duì)照組15.69±1.083.82±0.2260.31±10.29α-硫辛酸組20.55±0.96*2.63±0.29*102.47±21.43*

與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 α-硫辛酸對(duì)caspase-3和caspase-9 mRNA表達(dá)的影響

提取顆粒細(xì)胞總RNA，濃度測(cè)定時(shí)OD260/OD280比值為1.8～2.0，均符合RNA質(zhì)量要求。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1A和B顯示，caspase-3和caspase-9 mRNA分別在180 bp、152 bp處可觀(guān)察到特異性條帶，內(nèi)參β-actin條帶亮度相近；Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加α-硫辛酸處理后caspase-3和caspase-9 mRNA表達(dá)顯著性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 卵巢顆粒細(xì)胞caspase-3和caspase-9基因表達(dá) RT-PCR和Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.1 Expressions of caspase-3 and caspase-9 mRNA in the ovary granulose cells detected by RT-PCR and Real-time PCR
A：caspase-9 mRNA表達(dá)(1：α-硫辛酸組；2：對(duì)照組)；B：caspase-3 mRNA表達(dá)(3：對(duì)照組；4：α-硫辛酸組)。

2.3 α-硫辛酸對(duì)caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果如圖2顯示，添加α-硫辛酸處理后細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯示，caspase-3和caspase-9存在于卵巢顆粒細(xì)胞中，caspase-3和caspase-9陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈綠色熒光著染，細(xì)胞核呈深藍(lán)色熒光，鏡下可見(jiàn)。

圖2 卵巢顆粒細(xì)胞caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

Fig.2 Expression of caspase-3 and caspase-9 protein of the ovary granulose cells detected by immunofluorescence (×200)
A：caspase-3蛋白表達(dá)；B：caspase-9蛋白表達(dá)。

2.4 α-硫辛酸對(duì)凋亡蛋白caspase-3及caspase-9酶活性的影響

酶標(biāo)儀測(cè)定顆粒細(xì)胞溶蛋白性裂解產(chǎn)物中caspase-3和caspase-9酶的活性結(jié)果顯示(如圖3所示)，與對(duì)照組相比，添加α-硫辛酸處理后可引起顆粒細(xì)胞caspase-3和caspase-9酶活性顯著性降低(P<0.05)。

3 討 論

卵巢顆粒細(xì)胞是成熟卵泡中最大的細(xì)胞群，其包圍且營(yíng)養(yǎng)著卵母細(xì)胞，在維持卵母細(xì)胞成熟的微環(huán)境中起著極為重要的作用。因此，顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)是一個(gè)較好的評(píng)價(jià)卵巢功能及卵母細(xì)胞質(zhì)量的系統(tǒng)[6]。大量研究表明，卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡才是卵泡退化的根本原因。有研究也表明卵泡液中顆粒細(xì)胞自身的凋亡導(dǎo)致了卵泡的閉鎖，從而減少可發(fā)育并排出的卵子數(shù)目[7]。有研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者顆粒細(xì)胞的凋亡降低了卵子的質(zhì)量，顆粒細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致相應(yīng)卵子發(fā)育質(zhì)量欠佳， 使其受精、卵裂及后續(xù)的胚胎發(fā)育過(guò)程均受影響[8]。而且分離獲得的PCOS患者顆粒細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，顆粒細(xì)胞凋亡率高的卵子質(zhì)量低下。氧化應(yīng)激時(shí)過(guò)量的ROS主要損傷細(xì)胞大分子，如DNA、蛋白質(zhì)及膜磷脂，導(dǎo)致DNA突變或裂解，細(xì)胞內(nèi)重要酶的失活及細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化[9]。

圖3 α-硫辛酸對(duì)顆粒細(xì)胞caspase-3和caspase-9酶活性的影響

Fig.3 Effect of α-lipoic acid on caspase-3 and caspase-9 activities in the ovary granulose cells
A：caspase-9酶活性；B：caspase-3酶活性。

α-硫辛酸是一種較強(qiáng)的天然抗氧化劑，可通過(guò)清除自由基，恢復(fù)氧化還原平衡，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有文獻(xiàn)報(bào)道[10]，α-LA通過(guò)降低神經(jīng)膜細(xì)胞的丙二醛含量及增加超氧化物歧化酶活性，抑制氧化應(yīng)激，改善高糖導(dǎo)致的神經(jīng)膜細(xì)胞凋亡，從而對(duì)改善糖尿病周?chē)窠?jīng)病變起重要作用。研究顯示α-LA能夠顯著降低大鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)MDA含量及ROS水平并提高SOD活力，且能明顯降低caspase-3的活性，改善高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)將α-LA應(yīng)用于小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-LA顯著性減少細(xì)胞內(nèi)MDA含量，提高細(xì)胞SOD活力，升高細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性(P<0.05)，這與JIA等[12]研究α-LA能夠有效保護(hù)SD大鼠晶狀體上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激造成的SOD，MDA和GSH-Px酶活性下降的結(jié)論一致，也與文獻(xiàn)[13]中α-硫辛酸減輕耳蝸損傷中MDA含量的結(jié)論一致。也進(jìn)一步證明抗氧化劑可以降低細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激損傷，與以往研究報(bào)道結(jié)果一致[14]。

細(xì)胞經(jīng)歷誘發(fā)凋亡因素刺激時(shí)，caspase分子以酶原的形式被合成，必須經(jīng)歷自我剪切、激活的復(fù)合物形成等過(guò)程，這一過(guò)程一旦被激活，其中起始的caspase會(huì)特異性地剪切激活效應(yīng)的caspase酶原，在凋亡的內(nèi)源性通路中起始分子caspase-9被激活，進(jìn)一步激活哺乳動(dòng)物凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白酶caspase-3等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。在正常情況下，caspase-3以無(wú)活性的pre-caspase-3形式存在，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)則變?yōu)閳?zhí)行功能的、有活性的caspase-3，可使細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白質(zhì)降解失活。研究證明，α-LA刺激心肌細(xì)胞，阻斷ERS啟動(dòng)的凋亡通路，caspase-12蛋白表達(dá)減少，凋亡明顯降低[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α-LA減少氧化應(yīng)激，抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，這與caspase-3和caspase-9的表達(dá)密切相關(guān)，酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示α-LA處理引起顆粒細(xì)胞caspase-3和caspase-9酶活性顯著性降低。這一結(jié)果也進(jìn)一步證明了α-LA降低凋亡的作用與caspase-9和caspase-3緊密相關(guān)，顆粒細(xì)胞線(xiàn)粒體介導(dǎo)的caspase-9和caspase-3途徑激活，發(fā)生剪切，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與KIM等[16]和KAYA-DAGISTANLI等[17]報(bào)道的α-LA降低耳蝸毛細(xì)胞株HEI-OC1細(xì)胞和SD大鼠肝細(xì)胞caspase-3活性的結(jié)論一致，這一結(jié)果也證明抗氧化劑可以充分降低caspase酶原的活性[18]。

本研究中，顆粒細(xì)胞處理過(guò)程中caspase-9分子激活，繼而使caspase-3分子活化，致使顆粒細(xì)胞凋亡，添加α-LA減少了細(xì)胞這一凋亡的發(fā)生。這一凋亡的信號(hào)能否傳遞到細(xì)胞內(nèi)并募集、激活caspase-2、caspase-8、caspase-10等分子，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡發(fā)生，將作為我們繼續(xù)研究的方向。

總之，α-硫辛酸降低顆粒細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中凋亡蛋白caspase-9和caspase-3分子的表達(dá)，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡起到保護(hù)作用。

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(編輯 韓維棟)

α-lipoic acid protects mouse ovarian granulosa cells from oxidative stress and apoptosis

MA Hui-ming, ZHANG Yong-fang, WANG Meng-meng, LI Xin, WANG Yong-feng,TIAN Hong-cheng, PEI Xiu-ying, WANG Yan-rong

(Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education;Department of Anotomy and Histology-embryology, Ningxia Medical University;Fertility Center for Reproductive Medicine, Ningxia Medical University,Yinchuan 750004, China)

Objective To study the protective effects of α-lipoic acid on oxidative stress and apoptosis of mouse ovary granulose cells culturedinvitro. Methods Granulosa cells were collected from PMSG-treated mice and cultured in DMEM/F12 medium for 24 h; then the cell medium was supplemented with 100 μmol/L α-lipoic acid for 24 h culture. After α-lipoic acid treatment, SOD, MDA and GSH-Px activities in cell supernatant were measured. Additionally, RT-PCR, immunocytochemistry and Western blot were performed to detect the expressions of caspase-3 and caspase-9. Immunofluorescence and ELISA were used to evaluate the expressions of caspase-3 and caspase-9 at the protein level in whole granulosa cell lysate protein in both groups. Results α-lipoic acid supplementation increased SOD and GSH-Px activities and decreased MDA content notably (P<0.05). PCR products of caspase-3 and caspase-9 in granulosa cells were analyzed using RT-PCR and Real-time PCR. The expected 180 bp product was verified for caspase-3 and 152bp for caspase-9 by electrophoresis and gel imager in α-lipoic acid group and control group. Expressions of caspase-3 and caspase-9 at mRNA level showed a decreased tendency in α-lipoic acid group (P<0.05). For immunofluorescence analysis, caspase-3 and caspase-9 protein of granulosa cells was detected. Cell-specific positive staining was located in the cytoplasm of the granulosa cells which showed green fluorescence for caspase-3 and caspase-9 protein; cell nuclei showed blue fluorescence. In α-lipoic acid group it has a lower bands density values than the control group by Western blot analysis (P<0.05). ELISA assay showed a significant decrease of caspase-3 and caspase-9 activities in α-lipoic acid group (P<0.05). Conclusion α-lipoic acid can significantly change the anti-oxidation ability of mouse ovarian granulosa cells, which suggests that it has protective and antioxidant effects on oxidative stress and apoptosis during the culture of mouse ovarian granulosa cells.

α-lipoic acid; oxidative stress; apoptosis; ovary granulosa cell; mouse

2015-04-22

2015-08-22

寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.NZ11128) Supported by the Natural Science Foundation of Ningxia (No.NZ11128)

裴秀英. E-mail: peixiuying@163.com；王燕蓉. E-mail: 4083304@163.com

R711.6

A

10.7652/jdyxb201601010

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1554.006.html(2015-12-09)